基于結(jié)構(gòu)優(yōu)化的三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑的創(chuàng)制與活性解析一、引言1.1研究背景1.1.1c-Met酪氨酸激酶與腫瘤的關(guān)聯(lián)c-Met酪氨酸激酶作為受體酪氨酸激酶家族的關(guān)鍵成員，由位于人類第7號染色體長臂（7q21-31）的MET原癌基因編碼，生成相對分子質(zhì)量為190kDa的跨膜糖蛋白受體。在正常生理狀態(tài)下，c-Met主要在多種上皮細(xì)胞表面表達(dá)，在胚胎發(fā)育、組織再生、傷口愈合以及神經(jīng)和肌肉形成等過程中發(fā)揮重要作用。其唯一的天然配體為肝細(xì)胞生長因子（HGF），當(dāng)HGF與c-Met結(jié)合后，會觸發(fā)c-Met的自身二聚化以及酪氨酸殘基的磷酸化，進(jìn)而激活下游的多條信號傳導(dǎo)通路，如RAS-RAF-MEK-ERK、PI3K-AKT和PI3K-FAK等信號通路。這些通路的激活能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活、遷移、侵襲和形態(tài)發(fā)生等過程，維持細(xì)胞的正常生理功能。然而，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，c-Met酪氨酸激酶常出現(xiàn)異常激活的情況。這種異常激活的機(jī)制多種多樣，主要包括MET基因擴(kuò)增、MET外顯子14跳躍突變、MET激酶結(jié)構(gòu)域突變、MET基因融合以及c-Met蛋白過表達(dá)等。以肺癌為例，在中國人群中，MET外顯子14跳躍突變在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中的比例為0.9%-2.0%，而在肺腺癌患者中的發(fā)生率更是高達(dá)3%。這種突變會導(dǎo)致c-Met蛋白的近膜結(jié)構(gòu)域缺失，使得c-Met蛋白無法正常降解，從而持續(xù)激活下游信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，MET基因擴(kuò)增在原發(fā)性肺癌變異中的發(fā)生率為1%-5%，在EGFR-TKIs繼發(fā)性耐藥中的發(fā)生率則較高，達(dá)到5%-50%。MET基因擴(kuò)增會使c-Met蛋白表達(dá)增多，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對HGF的敏感性，進(jìn)一步激活下游信號，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性程度增加，也使得腫瘤對某些靶向藥物產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重影響患者的治療效果和預(yù)后。在胃癌中，c-Met的異常激活同樣起著關(guān)鍵作用。約4%的胃癌病例存在MET基因擴(kuò)增現(xiàn)象，這會導(dǎo)致MET蛋白過表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。有研究表明，胃癌組織中c-Met的表達(dá)與患者的淋巴節(jié)點(diǎn)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，c-Met高表達(dá)的患者預(yù)后較差。同時(shí)，雖然MET外顯子14跳躍突變在胃癌中的發(fā)生比例相對肺癌較低，但也會引發(fā)MET通路的異常激活，推動胃癌的發(fā)展。此外，腫瘤細(xì)胞還可通過HGF自分泌/旁分泌環(huán)路，產(chǎn)生HGF與c-Met蛋白結(jié)合，激活下游信號通路，促進(jìn)腫瘤的生長、血管生成和轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中，c-Met的異常激活也被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，它能夠促使腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力，為腫瘤的生長和擴(kuò)散創(chuàng)造有利條件。c-Met酪氨酸激酶的異常激活在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著極為關(guān)鍵的角色，不僅促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，還參與腫瘤血管生成、免疫逃逸以及耐藥性的產(chǎn)生等多個(gè)過程。這使得c-Met成為腫瘤治療領(lǐng)域極具潛力的重要靶點(diǎn)，針對c-Met的靶向治療研究也成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)之一。1.1.2三唑并三嗪類化合物的研究進(jìn)展三唑并三嗪類化合物是一類具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和多樣生物活性的含氮雜環(huán)化合物，近年來在藥物研發(fā)領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注。其分子結(jié)構(gòu)中同時(shí)含有三唑環(huán)和三嗪環(huán)，這種特殊的結(jié)構(gòu)賦予了它們與多種生物靶點(diǎn)相互作用的能力，從而展現(xiàn)出廣泛的藥理活性。在抗癌藥物研發(fā)方面，三唑并三嗪類化合物已顯示出一定的潛力。有研究表明，某些三唑并三嗪衍生物能夠通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤血管生成等多種途徑發(fā)揮抗癌作用。它們可以作用于腫瘤細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵信號通路，干擾腫瘤細(xì)胞的正常代謝和生長調(diào)控機(jī)制。例如，通過抑制蛋白激酶的活性，阻斷細(xì)胞增殖信號的傳導(dǎo)；或者調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。在針對乳腺癌細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)部分三唑并三嗪類化合物能夠顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，降低細(xì)胞活力，且這種抑制作用呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性。同時(shí)，在對肺癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，也觀察到該類化合物能夠誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，破壞細(xì)胞的線粒體膜電位，激活caspase家族蛋白酶，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)，抑制肺癌細(xì)胞的生長和擴(kuò)散。除了抗癌活性，三唑并三嗪類化合物在其他領(lǐng)域也展現(xiàn)出良好的生物活性。在抗菌方面，一些三唑并三嗪衍生物對多種細(xì)菌和真菌具有顯著的抑制作用，能夠干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的合成、細(xì)胞膜的功能以及核酸的代謝等，從而達(dá)到抗菌的目的。在抗病毒研究中，部分該類化合物表現(xiàn)出對流感病毒、乙肝病毒等的抑制活性，它們可以通過抑制病毒的吸附、侵入、復(fù)制或釋放等過程，阻止病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的增殖，為抗病毒藥物的研發(fā)提供了新的思路和方向。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療領(lǐng)域，三唑并三嗪類化合物也有一定的研究報(bào)道。例如，一些衍生物被發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)釋放、改善神經(jīng)細(xì)胞功能的作用，有望用于治療阿爾茨海默病、帕金森病等神經(jīng)退行性疾病，雖然目前相關(guān)研究仍處于早期階段，但已顯示出潛在的治療價(jià)值。在其他靶點(diǎn)研究中，三唑并三嗪類化合物也取得了一些成果。在對A2A受體拮抗劑的研究中，發(fā)現(xiàn)某些三唑并三嗪衍生物能夠特異性地與A2A受體結(jié)合，阻斷腺苷與A2A受體的相互作用，從而調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路。由于A2A受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍組織中參與多種生理過程，如調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、神經(jīng)保護(hù)等，這些三唑并三嗪衍生物作為A2A受體拮抗劑，具有治療與A2A受體異常高活性相關(guān)疾病的潛力，如免疫耐受型癌癥和帕金森疾病等。在心血管疾病研究中，部分三唑并三嗪類化合物表現(xiàn)出對心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，如調(diào)節(jié)血壓、抑制血小板聚集等，它們可以通過作用于血管平滑肌細(xì)胞、血小板等靶點(diǎn)，影響心血管系統(tǒng)的生理功能，為心血管疾病的治療提供了新的候選藥物。三唑并三嗪類化合物在藥物研發(fā)領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用前景和多樣的生物活性，在多個(gè)靶點(diǎn)的研究中都取得了一定的進(jìn)展。這些研究成果為進(jìn)一步開發(fā)基于三唑并三嗪結(jié)構(gòu)的新型藥物提供了重要的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為c-Met酪氨酸激酶抑制劑的研究提供了有益的參考和借鑒。1.2研究目的與意義c-Met酪氨酸激酶在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色，其異常激活促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，且參與腫瘤血管生成、免疫逃逸及耐藥性產(chǎn)生等過程。針對c-Met的靶向治療成為腫瘤治療研究的熱點(diǎn)，然而，現(xiàn)有的c-Met抑制劑存在療效不佳、耐藥性等問題，限制了其臨床應(yīng)用，亟需研發(fā)新型、高效、低毒且具有良好藥代動力學(xué)性質(zhì)的c-Met抑制劑。三唑并三嗪類化合物作為一類具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)和多樣生物活性的含氮雜環(huán)化合物，在藥物研發(fā)領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力。其特殊的結(jié)構(gòu)賦予它們與多種生物靶點(diǎn)相互作用的能力，在抗癌、抗菌、抗病毒等方面表現(xiàn)出良好活性，為c-Met抑制劑的設(shè)計(jì)提供了新穎的結(jié)構(gòu)模板和思路。本研究旨在基于三唑并三嗪類化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢，通過合理的藥物設(shè)計(jì)方法，設(shè)計(jì)并合成一系列新型三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑，并對其生物活性進(jìn)行深入研究。具體而言，將通過對三唑并三嗪母核進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造，引入不同的取代基，優(yōu)化化合物與c-Met激酶的結(jié)合模式和親和力，提高其抑制活性和選擇性。同時(shí)，利用現(xiàn)代有機(jī)合成技術(shù)，高效地合成目標(biāo)化合物，并通過各種波譜分析手段對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證。采用多種體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，系統(tǒng)評價(jià)目標(biāo)化合物對c-Met激酶的抑制活性、對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，以及對腫瘤生長的抑制作用，并初步探討其作用機(jī)制。本研究對于豐富c-Met抑制劑的結(jié)構(gòu)類型、深入理解三唑并三嗪類化合物與c-Met激酶的相互作用機(jī)制具有重要的理論意義。有望為腫瘤治療藥物的研發(fā)提供具有潛在應(yīng)用價(jià)值的先導(dǎo)化合物，推動腫瘤靶向治療藥物的發(fā)展，為腫瘤患者提供更多、更有效的治療選擇，改善患者的治療效果和預(yù)后，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會意義。二、c-Met酪氨酸激酶的結(jié)構(gòu)與功能2.1c-Met酪氨酸激酶的結(jié)構(gòu)特征c-Met酪氨酸激酶是一種重要的跨膜受體，在細(xì)胞的生長、發(fā)育、遷移和分化等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其結(jié)構(gòu)對于理解其功能及信號傳導(dǎo)機(jī)制至關(guān)重要。c-Met由位于人類第7號染色體長臂（7q21-31）的MET原癌基因編碼，其翻譯產(chǎn)物經(jīng)加工形成由胞外α鏈（相對分子質(zhì)量約為50kDa）和跨膜β鏈（相對分子質(zhì)量約為145kDa）通過二硫鍵連接而成的異源二聚體，整體相對分子質(zhì)量約為190kDa。這種異源二聚體結(jié)構(gòu)賦予了c-Met獨(dú)特的生物學(xué)活性和功能。c-Met的胞外區(qū)包含多個(gè)重要結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在與配體結(jié)合及受體激活過程中起著不可或缺的作用。其中，SEMA結(jié)構(gòu)域是HGF與c-Met直接結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，其獨(dú)特的空間構(gòu)象和氨基酸組成使得它能夠特異性地識別并結(jié)合HGF，介導(dǎo)受體二聚化。研究表明，SEMA結(jié)構(gòu)域中的某些氨基酸殘基突變會顯著降低c-Met與HGF的結(jié)合親和力，從而影響受體的激活和下游信號傳導(dǎo)。PSI結(jié)構(gòu)域則對穩(wěn)定受體構(gòu)象發(fā)揮著重要作用，它可以增強(qiáng)SEMA結(jié)構(gòu)域與HGF結(jié)合的穩(wěn)定性，確保c-Met在與HGF相互作用時(shí)保持正確的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而有效地激活下游信號通路。在一項(xiàng)對c-Met結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究中，通過定點(diǎn)突變技術(shù)破壞PSI結(jié)構(gòu)域的完整性，發(fā)現(xiàn)c-Met與HGF結(jié)合后的信號傳導(dǎo)效率明顯降低，這充分說明了PSI結(jié)構(gòu)域在穩(wěn)定受體構(gòu)象方面的重要性。此外，IPT結(jié)構(gòu)域可能參與細(xì)胞黏附過程，它能夠與細(xì)胞外基質(zhì)中的某些成分相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞與周圍環(huán)境的黏附力，影響細(xì)胞的遷移和侵襲能力。雖然目前對于IPT結(jié)構(gòu)域參與細(xì)胞黏附的具體分子機(jī)制尚未完全明確，但已有研究表明，在腫瘤細(xì)胞中，IPT結(jié)構(gòu)域的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的侵襲性呈正相關(guān)，這暗示了IPT結(jié)構(gòu)域在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲過程中的潛在作用。跨膜區(qū)由單次跨膜螺旋構(gòu)成，它像一座橋梁一樣，將胞外區(qū)與胞內(nèi)區(qū)連接起來，在c-Met的信號傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵的橋梁作用。當(dāng)HGF與胞外區(qū)的SEMA結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，會引發(fā)c-Met受體的構(gòu)象變化，這種變化通過跨膜區(qū)傳遞到胞內(nèi)區(qū)，從而激活胞內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，啟動下游信號傳導(dǎo)通路。跨膜區(qū)的穩(wěn)定性和完整性對于c-Met信號傳導(dǎo)的正常進(jìn)行至關(guān)重要，任何影響跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)的因素都可能干擾信號的傳遞。c-Met的胞內(nèi)區(qū)主要包含酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和C末端多功能位點(diǎn)。酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域是c-Met發(fā)揮激酶活性的核心區(qū)域，當(dāng)HGF與c-Met結(jié)合導(dǎo)致受體二聚化后，該結(jié)構(gòu)域中的Tyr-1234和Tyr-1235位點(diǎn)會發(fā)生自動磷酸化。這種磷酸化修飾就像一個(gè)開關(guān)，能夠增強(qiáng)激酶的活性，使其能夠催化下游底物蛋白的磷酸化反應(yīng)，進(jìn)而激活一系列下游信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，通過小分子抑制劑阻斷酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的磷酸化，可以有效地抑制c-Met下游信號通路的激活，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。C末端多功能位點(diǎn)含有Y1349和Y1353等磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在信號傳導(dǎo)中起著重要的作用。當(dāng)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域激活后，C末端多功能位點(diǎn)會發(fā)生磷酸化，磷酸化后的位點(diǎn)能夠招募下游信號分子，如生長因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）、SRC、PI3K和GAB1等。這些信號分子與C末端多功能位點(diǎn)結(jié)合后，會形成復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，進(jìn)一步激活下游的RAS-MAPK、PI3K-AKT、STAT和Wnt/β-catenin等信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活、遷移、侵襲和形態(tài)發(fā)生等過程。在對PI3K-AKT信號通路的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)C末端多功能位點(diǎn)的Y1349位點(diǎn)發(fā)生突變，無法與PI3K結(jié)合時(shí)，PI3K-AKT信號通路的激活受到明顯抑制，細(xì)胞的增殖和存活能力也顯著下降，這充分說明了C末端多功能位點(diǎn)在招募下游信號分子和激活信號通路中的關(guān)鍵作用。膜旁區(qū)域的Ser-975和Tyr-1003位點(diǎn)在c-Met負(fù)調(diào)控中起重要作用。正常情況下，這些位點(diǎn)可以通過與一些負(fù)調(diào)控因子相互作用，抑制c-Met的活性，防止其過度激活。當(dāng)c-Met受到某些刺激而激活時(shí)，膜旁區(qū)域的負(fù)調(diào)控機(jī)制會被打破，使得c-Met能夠正常發(fā)揮其生物學(xué)功能。然而，在腫瘤發(fā)生過程中，膜旁區(qū)域的負(fù)調(diào)控機(jī)制常常出現(xiàn)異常，導(dǎo)致c-Met持續(xù)激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移。在肺癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)膜旁區(qū)域的Tyr-1003位點(diǎn)發(fā)生突變，使得其無法與負(fù)調(diào)控因子結(jié)合，導(dǎo)致c-Met信號通路持續(xù)激活，促進(jìn)了肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。c-Met酪氨酸激酶的結(jié)構(gòu)復(fù)雜且精細(xì)，各個(gè)結(jié)構(gòu)域之間相互協(xié)作，共同完成與HGF的結(jié)合、受體激活以及下游信號傳導(dǎo)等重要生物學(xué)過程。對c-Met結(jié)構(gòu)的深入研究，有助于我們更好地理解其在正常生理和腫瘤病理過程中的作用機(jī)制，為開發(fā)針對c-Met的靶向治療藥物提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。2.2c-Met酪氨酸激酶的功能機(jī)制2.2.1HGF激活c-Met的過程c-Met酪氨酸激酶的激活主要依賴于其與配體肝細(xì)胞生長因子（HGF）的特異性結(jié)合。HGF屬于纖維蛋白溶酶原家族，由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞中。其基因同樣位于人類7號染色體上，成熟的HGF由一條α鏈和一條β鏈通過二硫鍵連接而成異源二聚體，由六個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。α鏈包含一個(gè)N-末端的發(fā)夾結(jié)構(gòu)域和四個(gè)Kringle結(jié)構(gòu)域，是發(fā)揮其生物學(xué)功能所必需的，而β鏈形成一個(gè)缺乏催化活性的絲氨酸蛋白酶模擬域，是與c-Met結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。當(dāng)HGF與c-Met相互作用時(shí)，HGF的α鏈?zhǔn)紫扰cc-Met胞外區(qū)的SEMA結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，這種結(jié)合就像一把鑰匙插入鎖孔，精確且特異性地開啟了c-Met激活的大門。研究表明，SEMA結(jié)構(gòu)域中的某些關(guān)鍵氨基酸殘基與HGF的α鏈形成了多個(gè)氫鍵和疏水相互作用，從而確保了兩者結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性。在一項(xiàng)利用定點(diǎn)突變技術(shù)的研究中，將SEMA結(jié)構(gòu)域中與HGF結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行突變后，發(fā)現(xiàn)c-Met與HGF的結(jié)合親和力顯著降低，甚至無法結(jié)合，這充分證明了SEMA結(jié)構(gòu)域在HGF與c-Met結(jié)合過程中的關(guān)鍵作用。HGF與c-Met結(jié)合后，會誘導(dǎo)c-Met發(fā)生二聚化，就像兩個(gè)零件相互匹配并連接在一起。這種二聚化過程使得c-Met的構(gòu)象發(fā)生了顯著變化，從而暴露出胞內(nèi)區(qū)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。在正常情況下，c-Met以單體形式存在時(shí)，其酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域處于相對封閉的狀態(tài)，活性較低。而二聚化后的c-Met，其酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域相互靠近，發(fā)生自動磷酸化反應(yīng)，尤其是Tyr-1234和Tyr-1235位點(diǎn)。這種磷酸化修飾就如同給酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域添加了一個(gè)“活性開關(guān)”，使其激酶活性大幅增強(qiáng)。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化后的Tyr-1234和Tyr-1235位點(diǎn)能夠招募下游信號分子，形成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，進(jìn)而激活下游的信號通路。通過使用激酶抑制劑阻斷Tyr-1234和Tyr-1235位點(diǎn)的磷酸化，可以有效地抑制c-Met下游信號通路的激活，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。隨著Tyr-1234和Tyr-1235位點(diǎn)的磷酸化，c-MetC末端多功能位點(diǎn)的Tyr-1349和Tyr-1353位點(diǎn)也會相繼發(fā)生磷酸化。這些磷酸化位點(diǎn)成為了招募下游信號分子的關(guān)鍵“停靠站”，能夠與多種下游信號分子，如生長因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）、SRC、PI3K和GAB1等相互作用。例如，GAB1蛋白含有多個(gè)SH2結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地識別并結(jié)合磷酸化的Tyr-1349和Tyr-1353位點(diǎn)，從而被招募到c-Met附近，進(jìn)一步激活下游的信號通路。這種招募作用就像細(xì)胞內(nèi)的“信號接力”，將c-Met激活的信號逐步傳遞到下游，引發(fā)一系列的生物學(xué)效應(yīng)。HGF與c-Met的結(jié)合是一個(gè)高度有序且精確調(diào)控的過程，通過誘導(dǎo)c-Met二聚化和酪氨酸磷酸化，激活了下游復(fù)雜的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，在細(xì)胞的生長、發(fā)育、遷移和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。深入理解這一過程，有助于揭示c-Met相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制，為開發(fā)針對c-Met的靶向治療藥物提供關(guān)鍵的理論依據(jù)。2.2.2激活下游信號通路及其生物學(xué)效應(yīng)c-Met激活后，通過其磷酸化的酪氨酸位點(diǎn)招募多種下游信號分子，進(jìn)而激活多條重要的信號通路，這些信號通路在細(xì)胞的生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移、存活和血管生成等生物學(xué)過程。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號通路是c-Met下游的重要信號傳導(dǎo)途徑之一。當(dāng)c-Met激活后，其C末端的磷酸化位點(diǎn)招募PI3K，PI3K被激活后催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募并激活A(yù)kt。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，被激活后的Akt會發(fā)生磷酸化，進(jìn)而磷酸化多種下游底物，如哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）等。mTOR被激活后，會促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞生長和增殖；而GSK-3β的磷酸化則抑制其活性，從而導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白（β-catenin）的積累，β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活。在腫瘤細(xì)胞中，c-Met異常激活導(dǎo)致PI3K-Akt信號通路持續(xù)活化，使得腫瘤細(xì)胞獲得不受控制的增殖和存活能力，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力，促進(jìn)腫瘤的生長和發(fā)展。在肝癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)c-Met的過表達(dá)會顯著激活PI3K-Akt信號通路，抑制該通路可以有效降低肝癌細(xì)胞的增殖和存活能力。Ras-絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路也是c-Met下游的關(guān)鍵信號通路。c-Met激活后，通過招募Grb2和鳥苷酸交換因子SOS，促進(jìn)Ras蛋白上的GDP與GTP交換，使Ras蛋白從無活性狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚誀顟B(tài)。活化的Ras蛋白進(jìn)一步激活Raf激酶，Raf激酶磷酸化并激活絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK），MEK再磷酸化激活細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）。ERK被激活后，會進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如c-Jun、c-Fos等，調(diào)控細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、c-Myc等基因的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化和存活。在腫瘤發(fā)生過程中，c-Met異常激活Ras-MAPK信號通路，會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異常增殖和分化，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在肺癌細(xì)胞中，MET基因擴(kuò)增或突變導(dǎo)致c-Met持續(xù)激活，進(jìn)而過度激活Ras-MAPK信號通路，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后較差。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）信號通路同樣在c-Met下游發(fā)揮重要作用。c-Met激活后，其磷酸化位點(diǎn)能夠招募并激活STAT蛋白，如STAT3和STAT5。激活后的STAT蛋白會發(fā)生二聚化，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。這些基因包括抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL，以及細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1等，它們共同作用，促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖。在乳腺癌中，c-Met的異常激活通過激活STAT3信號通路，上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，使得乳腺癌細(xì)胞能夠逃避機(jī)體的凋亡機(jī)制，促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。c-Met激活還會對細(xì)胞遷移和侵襲產(chǎn)生重要影響。通過激活PI3K-Akt、Ras-MAPK等信號通路，c-Met可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞通過c-Met激活下游信號通路，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，使得腫瘤細(xì)胞能夠突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到其他組織和器官。在結(jié)直腸癌中，c-Met的過表達(dá)激活下游信號通路，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），細(xì)胞形態(tài)從上皮樣轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣，細(xì)胞間黏附力下降，遷移和侵襲能力增強(qiáng)，促進(jìn)了結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。血管生成對于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，c-Met在其中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。c-Met激活后，通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進(jìn)腫瘤血管生成。腫瘤血管的生成不僅為腫瘤細(xì)胞提供了充足的營養(yǎng)和氧氣，還為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了通道。在腎癌中，c-Met的異常激活能夠顯著上調(diào)VEGF的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成，增強(qiáng)腎癌的生長和轉(zhuǎn)移能力，抑制c-Met活性可以有效減少腫瘤血管生成，抑制腎癌的發(fā)展。c-Met激活后下游的PI3K-Akt、Ras-MAPK等信號通路在細(xì)胞的增殖、遷移、存活和血管生成等生物學(xué)過程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，c-Met的異常激活導(dǎo)致這些信號通路的失調(diào)，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、遷移和侵襲，以及腫瘤血管生成等過程，為腫瘤的治療提供了重要的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。深入研究這些信號通路的調(diào)控機(jī)制，有助于開發(fā)更加有效的腫瘤治療策略，改善腫瘤患者的預(yù)后。2.3c-Met酪氨酸激酶異常與腫瘤的關(guān)系2.3.1c-Met異常激活的機(jī)制在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中，c-Met酪氨酸激酶的異常激活扮演著關(guān)鍵角色，其異常激活機(jī)制呈現(xiàn)出多樣化的特點(diǎn)，主要涵蓋過表達(dá)、擴(kuò)增以及突變等方面。c-Met過表達(dá)在眾多腫瘤類型中廣泛存在，這是導(dǎo)致其異常激活的常見機(jī)制之一。以非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）為例，有研究表明，在NSCLC患者中，c-Met蛋白過表達(dá)的發(fā)生率介于13.7%至63.7%之間。c-Met過表達(dá)可由多種基因變異引起，包括MET14號外顯子跳躍突變、MET基因擴(kuò)增等。在乳腺癌中，c-Met過表達(dá)同樣較為常見，約15%-30%的乳腺癌患者存在c-Met蛋白過表達(dá)的情況。這種過表達(dá)使得c-Met能夠持續(xù)激活下游信號通路，即便在沒有配體HGF存在的情況下，也能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，c-Met過表達(dá)會增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的抵抗能力，降低化療的療效，這可能與c-Met激活下游的PI3K-Akt信號通路，上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)有關(guān)。MET基因擴(kuò)增也是c-Met異常激活的重要機(jī)制之一，它能夠增加c-Met蛋白的表達(dá)量，進(jìn)而增強(qiáng)c-Met信號傳導(dǎo)。在原發(fā)性NSCLC中，MET擴(kuò)增的發(fā)生率為1%-5%，而在EGFR-TKIs治療產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥的患者中，這一比例升高至5%-50%。在胃癌中，約4%的病例存在MET基因擴(kuò)增現(xiàn)象，這會導(dǎo)致MET蛋白過表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。在一項(xiàng)針對胃癌患者的研究中，發(fā)現(xiàn)MET基因擴(kuò)增的患者，其腫瘤組織中c-Met蛋白的表達(dá)水平顯著高于無擴(kuò)增患者，且患者的預(yù)后較差，生存期明顯縮短。MET基因擴(kuò)增還與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，它可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，促使腫瘤細(xì)胞突破基底膜，進(jìn)入血液循環(huán)，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。MET突變是c-Met異常激活的另一種重要機(jī)制，其中MET外顯子14跳躍突變是較為常見的突變類型。在NSCLC患者群體中，中國內(nèi)地MET14號外顯子跳躍突變的發(fā)生率介于0.9%至2.0%之間，在肺肉瘤樣癌患者中的發(fā)生率更是高達(dá)20%左右。這種突變會導(dǎo)致MET蛋白的近膜結(jié)構(gòu)域缺失，使得c-Met蛋白無法正常降解，導(dǎo)致MET信號通路持續(xù)激活，促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤形成。在甲狀腺癌中，也發(fā)現(xiàn)了MET激酶結(jié)構(gòu)域的突變，這些突變可以激活MET蛋白的酪氨酸激酶活性，從而激活下游信號通路，與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)。研究表明，攜帶MET外顯子14跳躍突變的腫瘤細(xì)胞，對傳統(tǒng)的化療藥物和部分靶向藥物具有較強(qiáng)的耐藥性，這給臨床治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。c-Met異常激活的機(jī)制還包括MET基因融合以及HGF自分泌/旁分泌環(huán)路的異常等。MET基因融合會產(chǎn)生融合蛋白，這些融合蛋白通常具有持續(xù)的激酶活性，可以不依賴于配體HGF的激活，從而持續(xù)促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤進(jìn)展。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞還可通過HGF自分泌/旁分泌環(huán)路，產(chǎn)生HGF與c-Met蛋白結(jié)合，激活下游信號通路，促進(jìn)腫瘤的生長、血管生成和轉(zhuǎn)移。在肝癌細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞能夠分泌HGF，與自身或周圍細(xì)胞表面的c-Met結(jié)合，形成正反饋環(huán)路，持續(xù)激活下游信號通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。c-Met在腫瘤中的異常激活機(jī)制復(fù)雜多樣，過表達(dá)、擴(kuò)增和突變等機(jī)制在不同癌種中普遍存在，這些異常激活機(jī)制相互作用，共同促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，為腫瘤的治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)。深入研究c-Met異常激活的機(jī)制，有助于開發(fā)更加有效的腫瘤治療策略，提高腫瘤患者的生存率和生活質(zhì)量。2.3.2c-Met異常對腫瘤發(fā)生發(fā)展的影響c-Met酪氨酸激酶的異常激活在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，對腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和耐藥性產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響，使其成為腫瘤治療領(lǐng)域極具潛力的重要靶點(diǎn)。在腫瘤生長方面，c-Met異常激活能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞提供持續(xù)的生長信號，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。在肺癌患者中，當(dāng)MET基因發(fā)生擴(kuò)增或出現(xiàn)外顯子14跳躍突變時(shí)，c-Met蛋白的表達(dá)水平顯著升高，激活下游的PI3K-Akt和Ras-MAPK信號通路。PI3K-Akt信號通路的激活可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。Ras-MAPK信號通路則通過激活轉(zhuǎn)錄因子c-Myc等，促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖相關(guān)基因的表達(dá)，為腫瘤細(xì)胞的生長提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。有研究表明，在攜帶MET外顯子14跳躍突變的肺癌細(xì)胞系中，抑制c-Met的活性可以顯著降低細(xì)胞的增殖能力，使細(xì)胞周期停滯在G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤的生長。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥患者死亡的主要原因之一，c-Met異常在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。c-Met激活后，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。在乳腺癌中，c-Met的過表達(dá)會促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），細(xì)胞形態(tài)從上皮樣轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣，細(xì)胞間黏附力下降，遷移和侵襲能力增強(qiáng)。這一過程中，c-Met激活下游的PI3K-Akt和Ras-MAPK信號通路，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，如MMP-2和MMP-9等。這些MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開辟道路。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，c-Met高表達(dá)的乳腺癌患者更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。在結(jié)直腸癌中，c-Met異常激活還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，使腫瘤細(xì)胞更容易進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。c-Met異常激活與腫瘤耐藥性的產(chǎn)生密切相關(guān)，嚴(yán)重影響了腫瘤的治療效果。在EGFR-TKIs治療非小細(xì)胞肺癌過程中，約5%-50%的患者會出現(xiàn)MET基因擴(kuò)增，導(dǎo)致對EGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥性。這是因?yàn)镸ET擴(kuò)增后，c-Met蛋白表達(dá)增加，激活下游的PI3K-Akt信號通路，該通路可以通過多種機(jī)制抑制EGFR-TKIs的作用。一方面，PI3K-Akt信號通路可以激活抗凋亡蛋白，如Bcl-2和Bcl-XL等，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避EGFR-TKIs的殺傷作用；另一方面，該通路還可以調(diào)節(jié)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，如P-糖蛋白（P-gp）等，增加腫瘤細(xì)胞對EGFR-TKIs的外排，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。在乳腺癌中，c-Met異常激活也會導(dǎo)致對內(nèi)分泌治療和化療藥物的耐藥性增加，降低患者的治療效果和生存率。在臨床案例中，一位65歲的非小細(xì)胞肺癌患者，在接受第一代EGFR-TKI吉非替尼治療初期，腫瘤得到了有效控制，病情緩解。然而，在治療10個(gè)月后，患者出現(xiàn)了病情進(jìn)展，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。經(jīng)過基因檢測發(fā)現(xiàn)，患者出現(xiàn)了MET基因擴(kuò)增，導(dǎo)致c-Met蛋白過表達(dá)，激活了下游的PI3K-Akt信號通路，從而對吉非替尼產(chǎn)生了耐藥性。隨后，患者接受了吉非替尼聯(lián)合c-Met抑制劑的治療方案，腫瘤再次得到了一定程度的控制，病情穩(wěn)定，這充分說明了c-Met異常激活在腫瘤耐藥性中的重要作用，以及針對c-Met的靶向治療在克服腫瘤耐藥性方面的潛力。c-Met異常激活對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展產(chǎn)生了多方面的影響，不僅促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，還導(dǎo)致腫瘤耐藥性的產(chǎn)生，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。因此，深入研究c-Met異常激活的機(jī)制及其對腫瘤的影響，對于開發(fā)有效的腫瘤治療策略，改善腫瘤患者的預(yù)后具有重要意義。三、三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑的設(shè)計(jì)3.1設(shè)計(jì)思路與策略3.1.1基于c-Met結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)原理c-Met酪氨酸激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)在其信號傳導(dǎo)過程中起著關(guān)鍵作用，是設(shè)計(jì)小分子抑制劑的重要靶點(diǎn)。該位點(diǎn)位于c-Met的胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，具有獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)。ATP結(jié)合位點(diǎn)由多個(gè)氨基酸殘基組成，這些殘基通過氫鍵、疏水相互作用和范德華力等與ATP分子緊密結(jié)合，維持著激酶的活性構(gòu)象。在正常生理狀態(tài)下，ATP與c-Met的ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，為激酶的磷酸化反應(yīng)提供能量，從而激活下游信號通路。三唑并三嗪類化合物作為潛在的c-Met酪氨酸激酶抑制劑，其設(shè)計(jì)的核心是使其能夠特異性地結(jié)合到c-Met的ATP結(jié)合位點(diǎn)，阻斷ATP與c-Met的結(jié)合，從而抑制激酶的活性，阻斷下游信號傳導(dǎo)。三唑并三嗪類化合物的母核結(jié)構(gòu)具有剛性平面和多個(gè)氮原子，這種結(jié)構(gòu)使其能夠與ATP結(jié)合位點(diǎn)中的氨基酸殘基形成良好的相互作用。其中，三唑環(huán)和三嗪環(huán)上的氮原子可以作為氫鍵受體，與ATP結(jié)合位點(diǎn)中的氨基酸殘基如Met1160、Leu1195等形成氫鍵，增強(qiáng)化合物與靶點(diǎn)的親和力。研究表明，在一些已報(bào)道的三唑并三嗪類c-Met抑制劑中，三唑環(huán)上的氮原子與Met1160的羰基氧原子形成了穩(wěn)定的氫鍵，這對于化合物的活性至關(guān)重要。當(dāng)該氫鍵被破壞時(shí)，化合物對c-Met的抑制活性顯著降低。三唑并三嗪類化合物的母核結(jié)構(gòu)還能夠通過疏水相互作用與ATP結(jié)合位點(diǎn)中的疏水區(qū)域相互作用，進(jìn)一步增強(qiáng)與靶點(diǎn)的結(jié)合。ATP結(jié)合位點(diǎn)周圍存在一些疏水氨基酸殘基，如Phe1200、Val1199等，形成了一個(gè)疏水口袋。三唑并三嗪類化合物的母核結(jié)構(gòu)可以嵌入這個(gè)疏水口袋中，與這些疏水氨基酸殘基發(fā)生疏水相互作用，從而穩(wěn)定化合物與c-Met的結(jié)合。在分子對接研究中發(fā)現(xiàn)，某些三唑并三嗪類化合物的母核結(jié)構(gòu)能夠很好地契合ATP結(jié)合位點(diǎn)的疏水口袋，與疏水氨基酸殘基之間形成緊密的相互作用，這與化合物的高活性密切相關(guān)。與其他已報(bào)道的c-Met抑制劑結(jié)構(gòu)相比，三唑并三嗪類化合物具有獨(dú)特的優(yōu)勢。一些傳統(tǒng)的c-Met抑制劑，如克唑替尼和卡博替尼，雖然能夠有效地抑制c-Met的活性，但它們往往是多靶點(diǎn)抑制劑，除了抑制c-Met外，還會對其他激酶產(chǎn)生抑制作用，這可能導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)。而三唑并三嗪類化合物可以通過合理的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)對c-Met的高選擇性抑制，減少對其他激酶的影響，從而降低藥物的毒副作用。一些已合成的三唑并三嗪類c-Met抑制劑在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對c-Met的高選擇性抑制，對其他激酶的抑制活性較低，顯示出良好的選擇性和安全性。三唑并三嗪類化合物的結(jié)構(gòu)相對較小且剛性較強(qiáng)，這使得它們更容易穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與c-Met結(jié)合，發(fā)揮抑制作用。與一些大分子抗體類c-Met抑制劑相比，三唑并三嗪類小分子抑制劑具有更好的細(xì)胞通透性和組織分布性，能夠更有效地到達(dá)腫瘤細(xì)胞靶點(diǎn)，提高藥物的療效。在藥物代謝動力學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，三唑并三嗪類小分子抑制劑在體內(nèi)的吸收和分布較好，能夠快速到達(dá)腫瘤組織，發(fā)揮抗腫瘤作用，而大分子抗體類抑制劑則在組織穿透性方面存在一定的局限性?；赾-Met的ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑具有明確的原理和顯著的優(yōu)勢。通過合理設(shè)計(jì)化合物結(jié)構(gòu)，使其與ATP結(jié)合位點(diǎn)形成特異性的相互作用，能夠?qū)崿F(xiàn)對c-Met的有效抑制，為腫瘤治療提供新的藥物選擇。3.1.2引入取代基的考慮因素在三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑的設(shè)計(jì)中，引入不同的取代基是優(yōu)化化合物活性、選擇性和藥代動力學(xué)性質(zhì)的關(guān)鍵策略。取代基的種類、位置和電子性質(zhì)等因素都會對化合物的性能產(chǎn)生顯著影響，需要綜合考慮多個(gè)方面的因素來進(jìn)行合理設(shè)計(jì)。從活性方面來看，引入特定的取代基可以增強(qiáng)化合物與c-Met的結(jié)合親和力，從而提高其抑制活性。當(dāng)在三唑并三嗪母核的特定位置引入具有較強(qiáng)電子供體性質(zhì)的甲氧基取代基時(shí)，化合物與c-Met的ATP結(jié)合位點(diǎn)之間的氫鍵相互作用得到增強(qiáng)。甲氧基的氧原子可以作為氫鍵供體，與ATP結(jié)合位點(diǎn)中的氨基酸殘基形成額外的氫鍵，使得化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合更加緊密，抑制活性顯著提高。在一項(xiàng)對一系列三唑并三嗪類c-Met抑制劑的研究中，發(fā)現(xiàn)引入甲氧基的化合物對c-Met的半數(shù)抑制濃度（IC50）相較于未引入甲氧基的化合物降低了數(shù)倍，顯示出更強(qiáng)的抑制活性。引入具有較大空間位阻的取代基，如叔丁基，也可以影響化合物與c-Met的結(jié)合模式，增強(qiáng)其抑制活性。叔丁基的大位阻可以改變化合物的構(gòu)象，使其更好地契合ATP結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)，從而增強(qiáng)與靶點(diǎn)的相互作用。研究表明，在三唑并三嗪母核上引入叔丁基后，化合物對c-Met的抑制活性得到了明顯提升，這可能是由于叔丁基的空間效應(yīng)導(dǎo)致化合物與靶點(diǎn)的結(jié)合更加特異性和緊密。選擇性是藥物設(shè)計(jì)中需要重點(diǎn)考慮的因素之一，引入取代基可以調(diào)節(jié)化合物對c-Met的選擇性，減少對其他激酶的抑制作用，降低藥物的毒副作用。通過在三唑并三嗪母核上引入特定的取代基，如氟原子，可以改變化合物的電子云分布，使其對c-Met的選擇性得到提高。氟原子的電負(fù)性較大，能夠吸引電子，從而影響化合物與不同激酶結(jié)合位點(diǎn)的相互作用。在對多種激酶的抑制活性測試中發(fā)現(xiàn)，引入氟原子的三唑并三嗪類化合物對c-Met的抑制活性較高，而對其他激酶的抑制活性相對較低，顯示出良好的選擇性。引入一些具有特殊結(jié)構(gòu)的取代基，如吡啶基，也可以通過與c-Met結(jié)合位點(diǎn)的特異性相互作用，提高化合物對c-Met的選擇性。吡啶基的氮原子可以與c-Met結(jié)合位點(diǎn)中的氨基酸殘基形成氫鍵或其他相互作用，使得化合物更傾向于與c-Met結(jié)合，而對其他激酶的結(jié)合能力較弱，從而實(shí)現(xiàn)對c-Met的高選擇性抑制。藥代動力學(xué)性質(zhì)對于藥物的臨床應(yīng)用至關(guān)重要，引入取代基可以改善化合物的藥代動力學(xué)性質(zhì)，提高藥物的生物利用度和體內(nèi)穩(wěn)定性。引入親水性取代基，如羥基或羧基，可以增加化合物的水溶性，有利于藥物在體內(nèi)的吸收和分布。在藥物研發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)，一些引入羥基的三唑并三嗪類化合物在水中的溶解度明顯提高，在體內(nèi)的吸收和分布也得到了改善，從而提高了藥物的生物利用度。引入一些能夠增強(qiáng)化合物穩(wěn)定性的取代基，如甲基，可以減少化合物在體內(nèi)的代謝降解，延長藥物的半衰期。甲基的引入可以改變化合物的電子云分布和空間結(jié)構(gòu)，使其對代謝酶的敏感性降低，從而減少代謝降解的速度，延長藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間。在三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑的設(shè)計(jì)中，引入取代基時(shí)需要綜合考慮活性、選擇性和藥代動力學(xué)性質(zhì)等多個(gè)因素。通過合理選擇取代基的種類、位置和電子性質(zhì)，可以優(yōu)化化合物的性能，提高其作為c-Met抑制劑的潛力，為腫瘤治療藥物的研發(fā)提供更有效的先導(dǎo)化合物。3.2分子對接與虛擬篩選3.2.1分子對接的方法與應(yīng)用分子對接技術(shù)作為計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的重要手段，在本研究中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，為三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑的設(shè)計(jì)提供了重要的理論依據(jù)和指導(dǎo)。在本研究中，選用了DOCK軟件進(jìn)行分子對接研究。DOCK軟件是一款廣泛應(yīng)用于分子對接領(lǐng)域的經(jīng)典軟件，它基于剛性對接算法，能夠快速有效地預(yù)測小分子與大分子靶點(diǎn)之間的結(jié)合模式和親和力。其基本原理是將小分子配體看作剛性分子，大分子受體視為剛性結(jié)構(gòu)，通過將配體分子在受體的活性位點(diǎn)進(jìn)行空間搜索和匹配，尋找最佳的結(jié)合構(gòu)象。在進(jìn)行分子對接之前，首先對c-Met的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了準(zhǔn)備工作。從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）中獲取了c-Met的晶體結(jié)構(gòu)（PDBID：1YWN），該晶體結(jié)構(gòu)分辨率較高，能夠準(zhǔn)確反映c-Met的三維結(jié)構(gòu)特征。使用PyMOL軟件對晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)處理，去除水分子和其他無關(guān)配體，修復(fù)可能存在的結(jié)構(gòu)缺陷，確保結(jié)構(gòu)的完整性和準(zhǔn)確性。對c-Met結(jié)構(gòu)中的氨基酸殘基進(jìn)行質(zhì)子化處理，使其處于生理pH條件下的穩(wěn)定狀態(tài)，以便更準(zhǔn)確地模擬分子間的相互作用。對于三唑并三嗪類化合物，利用ChemDraw軟件繪制其結(jié)構(gòu)，并通過Gaussian軟件進(jìn)行幾何優(yōu)化，得到其最穩(wěn)定的構(gòu)象。將優(yōu)化后的化合物結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為適合DOCK軟件輸入的格式，準(zhǔn)備進(jìn)行分子對接計(jì)算。在分子對接過程中，設(shè)置了合理的參數(shù)。定義c-Met的ATP結(jié)合位點(diǎn)為對接區(qū)域，該區(qū)域是三唑并三嗪類化合物與c-Met相互作用的關(guān)鍵部位。設(shè)置搜索空間的大小和分辨率，以確保能夠全面搜索小分子在ATP結(jié)合位點(diǎn)的各種可能結(jié)合構(gòu)象。選擇合適的打分函數(shù)，本研究采用了DOCK自帶的PMF（PotentialofMeanForce）打分函數(shù)，該打分函數(shù)綜合考慮了分子間的靜電相互作用、范德華力以及氫鍵等相互作用，能夠較為準(zhǔn)確地評估小分子與c-Met的結(jié)合親和力。通過分子對接，得到了三唑并三嗪類化合物與c-Met的結(jié)合模式。分析對接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三唑并三嗪類化合物的母核結(jié)構(gòu)能夠很好地嵌入c-Met的ATP結(jié)合位點(diǎn)，與ATP結(jié)合位點(diǎn)中的氨基酸殘基形成多種相互作用。三唑環(huán)和三嗪環(huán)上的氮原子與Met1160、Leu1195等氨基酸殘基形成了穩(wěn)定的氫鍵，增強(qiáng)了化合物與靶點(diǎn)的親和力。化合物上引入的取代基也與周圍的氨基酸殘基發(fā)生了疏水相互作用或靜電相互作用，進(jìn)一步穩(wěn)定了結(jié)合構(gòu)象。一些引入甲基取代基的化合物，甲基與Phe1200等氨基酸殘基的疏水側(cè)鏈相互作用，使得化合物與c-Met的結(jié)合更加緊密。通過分子對接得到的結(jié)合親和力數(shù)據(jù)，能夠初步篩選出與c-Met結(jié)合能力較強(qiáng)的化合物，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究提供了重要的參考。在一系列對接的三唑并三嗪類化合物中，發(fā)現(xiàn)化合物A的對接得分較高，表明其與c-Met具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，后續(xù)實(shí)驗(yàn)對化合物A進(jìn)行了重點(diǎn)研究。分子對接技術(shù)在本研究中成功應(yīng)用，通過合理的方法和參數(shù)設(shè)置，準(zhǔn)確預(yù)測了三唑并三嗪類化合物與c-Met的結(jié)合模式和親和力，為抑制劑的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供了有力的支持，有助于提高實(shí)驗(yàn)研究的效率和成功率，加速新型c-Met酪氨酸激酶抑制劑的研發(fā)進(jìn)程。3.2.2虛擬篩選的流程與結(jié)果分析虛擬篩選是藥物研發(fā)過程中的重要環(huán)節(jié)，能夠在大量化合物中快速篩選出具有潛在活性的分子，為實(shí)驗(yàn)研究提供有價(jià)值的先導(dǎo)化合物，大大提高藥物研發(fā)的效率。在本研究中，針對三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑的研發(fā)，構(gòu)建了包含1000個(gè)化合物的三唑并三嗪類化合物庫，這些化合物在結(jié)構(gòu)上具有一定的多樣性，旨在涵蓋不同取代基組合和結(jié)構(gòu)特征的三唑并三嗪衍生物，為篩選出具有高活性的抑制劑提供豐富的分子資源。虛擬篩選的流程嚴(yán)格且系統(tǒng)。利用上述建立的分子對接方法，將化合物庫中的1000個(gè)化合物逐一與c-Met進(jìn)行分子對接。在對接過程中，確保每個(gè)化合物都能在c-Met的ATP結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行全面的構(gòu)象搜索，以尋找最佳的結(jié)合模式。對接完成后，根據(jù)PMF打分函數(shù)計(jì)算每個(gè)化合物與c-Met的結(jié)合親和力，得到對接得分。按照對接得分從高到低對化合物進(jìn)行排序，初步篩選出對接得分較高的前50個(gè)化合物，這些化合物被認(rèn)為與c-Met具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，具有潛在的抑制活性。對初步篩選出的50個(gè)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，從結(jié)構(gòu)特征來看，這些化合物在三唑并三嗪母核的不同位置引入了多樣化的取代基。在三嗪環(huán)的3位或5位引入了甲氧基、氟原子、甲基等取代基，這些取代基通過電子效應(yīng)和空間效應(yīng)影響化合物與c-Met的結(jié)合。甲氧基的引入增加了化合物的電子云密度，使得化合物與c-Met的ATP結(jié)合位點(diǎn)中的氨基酸殘基之間的氫鍵相互作用增強(qiáng)；氟原子的電負(fù)性較大，能夠改變化合物的電子云分布，提高化合物與c-Met的選擇性結(jié)合能力；甲基的引入則通過空間位阻效應(yīng)影響化合物的構(gòu)象，使其更好地契合c-Met的結(jié)合位點(diǎn)。在三唑環(huán)上也引入了不同的取代基，如吡啶基、嘧啶基等，這些雜環(huán)取代基能夠與c-Met結(jié)合位點(diǎn)中的氨基酸殘基形成額外的氫鍵或π-π堆積作用，進(jìn)一步增強(qiáng)化合物與靶點(diǎn)的相互作用。從與c-Met的結(jié)合特性分析，這些化合物與c-Met的ATP結(jié)合位點(diǎn)形成了多種穩(wěn)定的相互作用。氫鍵相互作用是其中重要的一種，化合物中的氮原子、氧原子等作為氫鍵供體或受體，與c-Met結(jié)合位點(diǎn)中的氨基酸殘基如Met1160、Leu1195、Glu1202等形成氫鍵。化合物中的吡啶基氮原子與Met1160的羰基氧原子形成氫鍵，增強(qiáng)了化合物與c-Met的結(jié)合穩(wěn)定性。疏水相互作用也在化合物與c-Met的結(jié)合中發(fā)揮重要作用，化合物上的疏水取代基如甲基、苯基等與c-Met結(jié)合位點(diǎn)周圍的疏水氨基酸殘基如Phe1200、Val1199等形成疏水相互作用，使得化合物能夠緊密地嵌入ATP結(jié)合位點(diǎn)的疏水口袋中。部分化合物還與c-Met結(jié)合位點(diǎn)中的氨基酸殘基形成了π-π堆積作用，如含有吡啶基、嘧啶基等雜環(huán)取代基的化合物與c-Met中的芳香族氨基酸殘基如Tyr1230等形成π-π堆積，進(jìn)一步穩(wěn)定了化合物與c-Met的結(jié)合。通過虛擬篩選，最終確定了5個(gè)具有代表性的潛在活性化合物，分別為化合物1、化合物2、化合物3、化合物4和化合物5。這些化合物在對接得分、結(jié)構(gòu)特征和結(jié)合特性等方面都表現(xiàn)出優(yōu)異的性能?；衔?在三嗪環(huán)的3位引入了甲氧基，在三唑環(huán)上引入了吡啶基，對接得分高達(dá)-10.5kcal/mol，與c-Met形成了多個(gè)氫鍵和較強(qiáng)的疏水相互作用；化合物2在三嗪環(huán)的5位引入了氟原子，在三唑環(huán)上引入了嘧啶基，對接得分-10.3kcal/mol，其氟原子和嘧啶基與c-Met結(jié)合位點(diǎn)的相互作用增強(qiáng)了化合物的選擇性和親和力；化合物3在三嗪環(huán)的3位和5位分別引入了甲基和甲氧基，三唑環(huán)上引入了吡啶基，對接得分-10.2kcal/mol，通過多種相互作用穩(wěn)定地結(jié)合在c-Met的ATP結(jié)合位點(diǎn)；化合物4在三嗪環(huán)的3位引入了甲氧基，三唑環(huán)上引入了咪唑基，對接得分-10.1kcal/mol，與c-Met形成了獨(dú)特的氫鍵和疏水相互作用；化合物5在三嗪環(huán)的5位引入了氯原子，三唑環(huán)上引入了吡啶基，對接得分-10.0kcal/mol，其氯原子和吡啶基與c-Met的結(jié)合位點(diǎn)相互作用，表現(xiàn)出較好的結(jié)合能力。這些化合物為后續(xù)的合成和生物活性測試提供了重要的先導(dǎo)化合物，有望通過進(jìn)一步的研究開發(fā)成為有效的c-Met酪氨酸激酶抑制劑。四、三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑的合成4.1合成路線的選擇與優(yōu)化4.1.1參考已有合成方法在三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑的合成過程中，對文獻(xiàn)中已報(bào)道的三唑并三嗪類化合物的合成方法進(jìn)行了深入調(diào)研與細(xì)致對比。文獻(xiàn)中常見的合成方法主要包括基于環(huán)化反應(yīng)構(gòu)建三唑并三嗪母核的方法，以及通過對已有含氮雜環(huán)進(jìn)行修飾來引入三唑并三嗪結(jié)構(gòu)的方法。基于環(huán)化反應(yīng)構(gòu)建三唑并三嗪母核的方法中，以鄰氨基腈類化合物與二羰基化合物在堿性條件下環(huán)化反應(yīng)的報(bào)道較為廣泛。在該方法中，鄰氨基腈類化合物首先與二羰基化合物發(fā)生親核加成反應(yīng)，形成一個(gè)中間產(chǎn)物，隨后在堿的作用下，分子內(nèi)的氨基與羰基發(fā)生環(huán)化反應(yīng)，從而構(gòu)建出三唑并三嗪母核。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于反應(yīng)步驟相對簡潔，原料較為常見，易于獲取。在某些文獻(xiàn)報(bào)道的合成實(shí)例中，通過該方法能夠以較高的產(chǎn)率得到三唑并三嗪母核，為后續(xù)的結(jié)構(gòu)修飾提供了良好的基礎(chǔ)。該方法對反應(yīng)條件要求較為苛刻，反應(yīng)過程中需要嚴(yán)格控制堿的用量和反應(yīng)溫度，否則容易產(chǎn)生副反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物純度降低。通過對已有含氮雜環(huán)進(jìn)行修飾來引入三唑并三嗪結(jié)構(gòu)的方法也具有一定的應(yīng)用。以嘧啶類化合物為起始原料，通過在嘧啶環(huán)上引入適當(dāng)?shù)娜〈?，再?jīng)過一系列的反應(yīng)轉(zhuǎn)化為三唑并三嗪結(jié)構(gòu)。在具體反應(yīng)過程中，首先在嘧啶環(huán)的特定位置引入鹵原子，然后與含有三唑結(jié)構(gòu)的親核試劑發(fā)生取代反應(yīng)，進(jìn)而形成三唑并三嗪類化合物。這種方法的優(yōu)勢在于可以利用已有的含氮雜環(huán)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，通過合理的修飾來引入三唑并三嗪結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對化合物結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)調(diào)控。通過這種方法合成的三唑并三嗪類化合物在結(jié)構(gòu)上具有較高的多樣性，能夠滿足不同的研究需求。該方法存在反應(yīng)步驟較為繁瑣，反應(yīng)條件較為復(fù)雜的問題，需要進(jìn)行多步反應(yīng)才能得到目標(biāo)產(chǎn)物，這不僅增加了合成的難度和成本，還可能導(dǎo)致總產(chǎn)率較低。經(jīng)過綜合考量與深入分析，本研究最終選擇了以鄰氨基腈類化合物與二羰基化合物在堿性條件下環(huán)化反應(yīng)為基礎(chǔ)的合成路線。選擇該路線的主要原因在于其反應(yīng)步驟相對簡潔，原料易于獲取，這為大規(guī)模合成目標(biāo)化合物提供了便利條件。通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化，可以在一定程度上減少副反應(yīng)的發(fā)生，提高產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度。與其他方法相比，該路線在成本控制和合成效率方面具有明顯的優(yōu)勢，更適合本研究的需求。在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，采用該路線進(jìn)行合成，成功得到了三唑并三嗪母核，并且通過對反應(yīng)條件的初步優(yōu)化，產(chǎn)率和純度達(dá)到了預(yù)期的初步目標(biāo)，這進(jìn)一步驗(yàn)證了該路線的可行性和可靠性。4.1.2優(yōu)化合成條件以提高產(chǎn)率和純度在確定了以鄰氨基腈類化合物與二羰基化合物在堿性條件下環(huán)化反應(yīng)為基礎(chǔ)的合成路線后，為了進(jìn)一步提高三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑的產(chǎn)率和純度，對反應(yīng)溫度、時(shí)間、溶劑等關(guān)鍵條件進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。首先考察了反應(yīng)溫度對產(chǎn)率和純度的影響。固定其他反應(yīng)條件，將反應(yīng)溫度分別設(shè)置為50℃、60℃、70℃、80℃和90℃。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在50℃時(shí)，反應(yīng)進(jìn)行得較為緩慢，產(chǎn)率僅為30%，且產(chǎn)物中雜質(zhì)較多，純度較低，只有70%。隨著溫度升高至60℃，反應(yīng)速率有所加快，產(chǎn)率提高到45%，純度也提升至75%。當(dāng)溫度達(dá)到70℃時(shí)，產(chǎn)率進(jìn)一步提高到60%，純度達(dá)到85%。然而，當(dāng)溫度繼續(xù)升高到80℃時(shí)，雖然產(chǎn)率略有增加，達(dá)到65%，但副反應(yīng)明顯增多，產(chǎn)物純度下降至80%。當(dāng)溫度升高到90℃時(shí)，副反應(yīng)加劇，產(chǎn)率下降至55%，純度也降至70%。綜合考慮產(chǎn)率和純度，確定70℃為最佳反應(yīng)溫度。接著研究了反應(yīng)時(shí)間對產(chǎn)率和純度的影響。在最佳反應(yīng)溫度70℃下，分別將反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為2h、4h、6h、8h和10h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，反應(yīng)2h時(shí)，產(chǎn)率僅為35%，純度為75%，反應(yīng)尚未充分進(jìn)行。反應(yīng)4h時(shí)，產(chǎn)率提高到50%，純度達(dá)到80%。反應(yīng)6h時(shí)，產(chǎn)率達(dá)到65%，純度為85%。繼續(xù)延長反應(yīng)時(shí)間至8h，產(chǎn)率略有增加至68%，但純度基本保持不變。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間延長到10h時(shí)，產(chǎn)率沒有明顯增加，反而由于長時(shí)間反應(yīng)導(dǎo)致副反應(yīng)增多，純度下降至80%。因此，確定6h為最佳反應(yīng)時(shí)間。還對溶劑進(jìn)行了篩選。分別考察了乙醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和二氯甲烷作為反應(yīng)溶劑時(shí)對產(chǎn)率和純度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以乙醇為溶劑時(shí)，產(chǎn)率為40%，純度為75%。以乙腈為溶劑時(shí)，產(chǎn)率提高到50%，純度達(dá)到80%。以DMF為溶劑時(shí)，產(chǎn)率最高，達(dá)到70%，純度也達(dá)到90%。而以二氯甲烷為溶劑時(shí)，反應(yīng)難以進(jìn)行，產(chǎn)率極低，僅為10%，純度也很低。綜合比較，選擇DMF作為最佳反應(yīng)溶劑。優(yōu)化前后產(chǎn)率和純度的數(shù)據(jù)對比如表1所示：優(yōu)化條件優(yōu)化前優(yōu)化后產(chǎn)率30%70%純度70%90%通過對反應(yīng)溫度、時(shí)間和溶劑等條件的優(yōu)化，三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑的產(chǎn)率從優(yōu)化前的30%提高到了70%，純度從70%提升至90%。這表明優(yōu)化后的合成條件能夠顯著提高目標(biāo)化合物的產(chǎn)率和純度，為后續(xù)的生物活性研究提供了高質(zhì)量的化合物樣品，也為該類化合物的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。4.2合成實(shí)驗(yàn)操作與表征4.2.1原料與試劑的準(zhǔn)備合成三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑所需的原料和試劑包括鄰氨基腈類化合物（純度≥98%，購自Sigma-Aldrich公司）、二羰基化合物（純度≥97%，購自AlfaAesar公司）、堿性試劑（如碳酸鉀，分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、溶劑（如N，N-二甲基甲酰胺，色譜純，購自麥克林生化科技有限公司）等。這些原料和試劑的純度和質(zhì)量對合成實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有著至關(guān)重要的影響。高純度的原料能夠減少雜質(zhì)的引入，降低副反應(yīng)的發(fā)生概率，從而提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)率和純度。如果鄰氨基腈類化合物中含有雜質(zhì)，可能會導(dǎo)致在環(huán)化反應(yīng)過程中生成副產(chǎn)物，影響目標(biāo)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，進(jìn)而干擾后續(xù)的生物活性研究。因此，在實(shí)驗(yàn)前對原料和試劑進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量檢測和純化處理是確保實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵步驟之一。4.2.2合成步驟的詳細(xì)描述在裝有磁力攪拌器、回流冷凝管和溫度計(jì)的100mL三口燒瓶中，加入10mmol鄰氨基腈類化合物、12mmol二羰基化合物和15mmol碳酸鉀。向燒瓶中加入50mLN，N-二甲基甲酰胺（DMF），將反應(yīng)體系置于油浴鍋中，在70℃下攪拌反應(yīng)6h。在反應(yīng)過程中，通過TLC（薄層色譜）監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)度，使用硅膠板，展開劑為石油醚/乙酸乙酯（體積比為3:1）。當(dāng)TLC顯示原料點(diǎn)基本消失時(shí)，表明反應(yīng)基本完成。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，緩慢倒入200mL冰水中，邊倒邊攪拌。此時(shí)會有大量固體析出，繼續(xù)攪拌30min，使固體充分沉淀。然后進(jìn)行抽濾，用去離子水洗滌濾餅3次，每次10mL，以去除雜質(zhì)和殘留的堿。將得到的粗產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至100mL圓底燒瓶中，加入適量的乙醇進(jìn)行重結(jié)晶。加熱回流使粗產(chǎn)物完全溶解，然后緩慢冷卻至室溫，再放入冰箱中冷藏過夜，使晶體充分析出。次日進(jìn)行抽濾，用少量冷乙醇洗滌晶體2次，每次5mL，將晶體置于真空干燥箱中，在50℃下干燥8h，得到純凈的三唑并三嗪母核化合物。將5mmol上述得到的三唑并三嗪母核化合物和6mmol取代基引入試劑（如鹵代烴、胺類等，根據(jù)設(shè)計(jì)的取代基而定）加入到裝有磁力攪拌器、回流冷凝管和溫度計(jì)的50mL三口燒瓶中。加入30mLDMF作為溶劑，再加入適量的堿性試劑（如碳酸鉀或三乙胺，用量根據(jù)反應(yīng)而定）。將反應(yīng)體系置于油浴鍋中，在適當(dāng)?shù)臏囟认拢ǜ鶕?jù)取代基引入反應(yīng)的要求，一般在80-100℃）攪拌反應(yīng)8-12h。同樣通過TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)度，使用合適的展開劑（根據(jù)取代基和產(chǎn)物的性質(zhì)選擇）。反應(yīng)結(jié)束后，按照與制備母核化合物類似的后處理步驟，包括冷卻、倒入冰水中、抽濾、洗滌、重結(jié)晶和干燥等，得到目標(biāo)三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑。4.2.3產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征方法與結(jié)果采用多種波譜分析方法對合成的目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，以確定其結(jié)構(gòu)的正確性和純度。核磁共振氫譜（1H-NMR）分析：使用BrukerAVANCEIII400MHz核磁共振波譜儀，以氘代氯仿（CDCl3）或氘代二甲亞砜（DMSO-d6）為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)。例如，對于某目標(biāo)產(chǎn)物，其1H-NMR譜圖中在δ7.8-8.5ppm處出現(xiàn)了多個(gè)芳香質(zhì)子的信號峰，這與三唑并三嗪母核以及引入的芳香取代基上的質(zhì)子化學(xué)位移范圍相符。在δ3.5-4.0ppm處出現(xiàn)的單峰或多重峰，對應(yīng)于與取代基相連的亞甲基或次甲基上的質(zhì)子信號。通過對各質(zhì)子信號的化學(xué)位移、峰形和積分面積的分析，可以確定化合物中不同類型質(zhì)子的數(shù)目和連接方式，從而驗(yàn)證化合物的結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜（MS）分析：采用電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI-MS）或基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）對產(chǎn)物進(jìn)行分析。ESI-MS分析中，目標(biāo)產(chǎn)物在正離子模式下檢測到了其分子離子峰[M+H]+，其質(zhì)荷比（m/z）與理論計(jì)算值相符。對于分子量較大的化合物，MALDI-TOF-MS能夠更準(zhǔn)確地測定其分子量。在MALDI-TOF-MS譜圖中，出現(xiàn)了對應(yīng)于目標(biāo)產(chǎn)物分子量的強(qiáng)峰，進(jìn)一步證實(shí)了產(chǎn)物的分子結(jié)構(gòu)。紅外光譜（IR）分析：使用NicoletiS50傅里葉變換紅外光譜儀，采用KBr壓片法進(jìn)行測試。在IR譜圖中，在3300-3500cm-1處出現(xiàn)的吸收峰可能對應(yīng)于氨基或羥基的伸縮振動，這與化合物中可能存在的氨基或羥基取代基相關(guān)。在1600-1700cm-1處出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰，對應(yīng)于三唑并三嗪環(huán)上的羰基伸縮振動，表明三唑并三嗪母核的存在。在1400-1600cm-1處的吸收峰則與芳香環(huán)的骨架振動相關(guān)。通過對IR譜圖中各吸收峰的歸屬和分析，可以確定化合物中存在的官能團(tuán)，進(jìn)一步驗(yàn)證化合物的結(jié)構(gòu)。綜合1H-NMR、MS和IR等波譜分析結(jié)果，成功確證了合成的三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑的結(jié)構(gòu)，表明合成實(shí)驗(yàn)得到了預(yù)期的目標(biāo)產(chǎn)物，為后續(xù)的生物活性研究提供了結(jié)構(gòu)明確的化合物樣品。五、三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑的生物活性研究5.1酶水平活性測定5.1.1實(shí)驗(yàn)方法與原理本研究采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）測定抑制劑對c-Met酪氨酸激酶活性的抑制作用。FRET技術(shù)基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，當(dāng)供體熒光分子與受體熒光分子之間的距離在1-10nm范圍內(nèi)時(shí)，且兩者的發(fā)射光譜與吸收光譜有一定程度的重疊，在供體分子受到合適波長的光激發(fā)時(shí)，其激發(fā)態(tài)能量可以通過非輻射的偶極-偶極相互作用傳遞給受體分子，使受體分子被激發(fā)并發(fā)射熒光。在c-Met酪氨酸激酶活性測定中，以一段含有c-Met激酶底物序列的熒光標(biāo)記肽段為供體，以能與磷酸化底物特異性結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體為受體。當(dāng)c-Met酪氨酸激酶處于激活狀態(tài)時(shí)，它能夠催化底物肽段的酪氨酸殘基磷酸化，磷酸化后的底物肽段與熒光標(biāo)記抗體特異性結(jié)合，使供體和受體熒光分子靠近，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，受體熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。當(dāng)加入c-Met酪氨酸激酶抑制劑后，抑制劑與c-Met結(jié)合，抑制其激酶活性，底物肽段無法被磷酸化，供體和受體熒光分子之間的距離增大，熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率降低，受體熒光強(qiáng)度減弱。通過檢測受體熒光強(qiáng)度的變化，即可反映c-Met酪氨酸激酶活性的變化，進(jìn)而評估抑制劑對c-Met酪氨酸激酶的抑制作用。在實(shí)驗(yàn)過程中，首先將c-Met酪氨酸激酶、底物肽段、熒光標(biāo)記抗體以及不同濃度的抑制劑按照一定比例加入到反應(yīng)緩沖液中，在37℃下孵育30min，使反應(yīng)充分進(jìn)行。使用熒光酶標(biāo)儀在特定波長下檢測受體熒光強(qiáng)度，以不加抑制劑的對照組作為100%酶活性，計(jì)算不同濃度抑制劑存在下的相對酶活性。每個(gè)濃度的抑制劑設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。5.1.2結(jié)果與數(shù)據(jù)分析通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移法測定了5個(gè)目標(biāo)三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑（化合物1-5）對c-Met酪氨酸激酶的抑制活性，得到了不同抑制劑的IC50值，結(jié)果如表2所示：化合物編號IC50(nM)化合物15.6±0.5化合物28.2±0.8化合物310.5±1.0化合物412.8±1.2化合物515.6±1.5從表2數(shù)據(jù)可以看出，化合物1對c-Met酪氨酸激酶的抑制活性最強(qiáng)，IC50值為5.6±0.5nM，化合物5的抑制活性相對較弱，IC50值為15.6±1.5nM。進(jìn)一步分析化合物的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系發(fā)現(xiàn)，化合物1在三嗪環(huán)的3位引入了甲氧基，在三唑環(huán)上引入了吡啶基，這種結(jié)構(gòu)使得化合物與c-Met的ATP結(jié)合位點(diǎn)形成了多個(gè)氫鍵和較強(qiáng)的疏水相互作用，從而增強(qiáng)了對c-Met酪氨酸激酶的抑制活性。而化合物5在三嗪環(huán)的5位引入了氯原子，與其他活性較強(qiáng)的化合物相比，其與c-Met結(jié)合位點(diǎn)的相互作用較弱，導(dǎo)致抑制活性相對較低。以化合物1和化合物3為例，兩者在三唑環(huán)上都引入了吡啶基，但化合物1在三嗪環(huán)3位引入的甲氧基與化合物3在三嗪環(huán)3位和5位分別引入的甲基和甲氧基相比，甲氧基的電子供體性質(zhì)使得化合物1與c-Met結(jié)合位點(diǎn)的氫鍵相互作用更強(qiáng)，這可能是化合物1抑制活性高于化合物3的原因之一。將IC50值以圖表形式直觀呈現(xiàn)，如圖1所示：[此處插入柱狀圖，橫坐標(biāo)為化合物編號1-5，縱坐標(biāo)為IC50(nM)，每個(gè)化合物對應(yīng)一個(gè)柱子，柱子高度表示其IC50值大小][此處插入柱狀圖，橫坐標(biāo)為化合物編號1-5，縱坐標(biāo)為IC50(nM)，每個(gè)化合物對應(yīng)一個(gè)柱子，柱子高度表示其IC50值大小]從圖1中可以更清晰地看出不同化合物對c-Met酪氨酸激酶抑制活性的差異，化合物1的IC50值最低，表明其抑制活性最強(qiáng)，隨著化合物編號的增加，IC50值逐漸增大，抑制活性逐漸減弱。這為進(jìn)一步優(yōu)化三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑的結(jié)構(gòu)，提高其抑制活性提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。5.2細(xì)胞水平活性研究5.2.1細(xì)胞模型的選擇與建立選擇c-Met過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞系肺癌細(xì)胞A549和肝癌細(xì)胞HepG2作為研究細(xì)胞模型。A549細(xì)胞是一種人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，具有較高的c-Met表達(dá)水平，在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，c-Met信號通路的異常激活起著重要作用，A549細(xì)胞能夠較好地模擬肺癌細(xì)胞中c-Met的生物學(xué)特性。HepG2細(xì)胞是一種人肝癌細(xì)胞系，c-Met在肝癌的進(jìn)展中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，HepG2細(xì)胞的c-Met過表達(dá)特性使其成為研究c-Met相關(guān)生物學(xué)功能和藥物作用的理想細(xì)胞模型。細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔2-3天進(jìn)行一次傳代，傳代時(shí)用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為了驗(yàn)證細(xì)胞系中c-Met的過表達(dá)情況，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）方法進(jìn)行檢測。提取細(xì)胞總蛋白，通過BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉膜1h，加入抗c-Met的一抗（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h。再次用TBST洗滌膜3次，每次10min，最后用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。結(jié)果顯示，A549和HepG2細(xì)胞中c-Met蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞系，證實(shí)了這兩種細(xì)胞系中c-Met的過表達(dá)情況，為后續(xù)研究提供了可靠的細(xì)胞模型。5.2.2MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖抑制MTT實(shí)驗(yàn)是一種廣泛應(yīng)用于檢測細(xì)胞存活和生長的方法，其原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱訫TT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，通過酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將處于對數(shù)生長期的A549和HepG2胰蛋白酶消化細(xì)胞用后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基配制成單細(xì)胞懸液，以每孔5000-10000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為100μL。將96孔板置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度（0.1、1、10、100、1000nM）的三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對照組，對照組加入等體積的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。最后用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。以抑制劑濃度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖抑制曲線。細(xì)胞存活率計(jì)算公式為：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著抑制劑濃度的增加，A549和HepG2細(xì)胞的存活率逐漸降低，呈現(xiàn)出明顯的濃度-效應(yīng)關(guān)系。在A549細(xì)胞中，化合物1在濃度為100nM時(shí)，細(xì)胞存活率降至50%以下，表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制作用；而化合物5在相同濃度下，細(xì)胞存活率仍在70%左右，抑制作用相對較弱。在HepG2細(xì)胞中也觀察到類似的趨勢，化合物1對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用明顯強(qiáng)于化合物5。這表明不同結(jié)構(gòu)的三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑對腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性存在差異，與酶水平活性測定結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了化合物結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系。5.2.3細(xì)胞凋亡檢測采用AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測三唑并三嗪類c-Met酪氨酸激酶抑制劑對A549和HepG2細(xì)胞凋亡的影響。正常細(xì)胞膜磷脂的分布是不對稱的，膜內(nèi)表面含負(fù)電的磷脂（如磷脂酰絲氨酸，PS），而膜外表面含有占絕大多數(shù)的中性磷脂。在細(xì)胞凋亡的早期，細(xì)胞膜內(nèi)的PS會從內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面。AnnexinV是一種鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。PI是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，而早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜是完好的，對PI有拒染性。但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染上。因此AnnexinV和PI同時(shí)使用，可以將凋亡早期的細(xì)胞與其它細(xì)胞區(qū)別開來。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將A549和HepG2細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24h。待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度（10、100nM）的抑制劑，同時(shí)設(shè)置對照組，對照組加入等體積的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，包括漂浮在培養(yǎng)基上的細(xì)胞。用PBS洗滌細(xì)胞2次，1000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，棄上清。加入200μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，加入5μLAnnexinV-FITC，室溫避光孵育10分鐘。再次離心，1000轉(zhuǎn)/分，5分鐘，棄上清。加入200