高中生物生物技術(shù)重點知識復(fù)習(xí)提綱一、基因工程（DNA重組技術(shù)）（一）核心工具與操作原理1.工具酶限制酶：識別特定回文序列的雙鏈DNA片段，切割磷酸二酯鍵，產(chǎn)生黏性末端（如*Eco*RⅠ）或平末端（如*Sma*Ⅰ）。DNA連接酶：催化磷酸二酯鍵形成，連接目的基因與載體。T4DNA連接酶可連接平末端，*E.coli*連接酶僅連接黏性末端。2.載體常用載體為質(zhì)粒（細菌中獨立于擬核的環(huán)狀DNA），需具備：復(fù)制原點（自主復(fù)制）、多個限制酶切點（便于插入目的基因）、標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因，用于篩選含重組載體的細胞）、啟動子/終止子（調(diào)控基因表達）。（二）操作步驟（四步曲）1.目的基因的獲取從基因文庫（基因組文庫/部分基因文庫如cDNA文庫）中篩選；PCR擴增：以目的基因的兩條鏈為模板，通過變性（90-95℃）、退火（55-60℃引物結(jié)合）、延伸（70-75℃*Taq*酶催化）循環(huán)擴增；人工合成：已知序列的短基因（如胰島素基因）可通過化學(xué)法合成。2.基因表達載體的構(gòu)建（核心步驟）將目的基因與載體通過限制酶切割、DNA連接酶連接，形成“目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因”的重組載體，確保目的基因在受體細胞中穩(wěn)定表達。3.將目的基因?qū)胧荏w細胞植物：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（利用Ti質(zhì)粒的T-DNA整合到植物基因組）、基因槍法（金屬顆粒攜帶DNA轟擊細胞）、花粉管通道法（授粉時將DNA注入花粉管）；動物：顯微注射法（將重組載體注入受精卵）；微生物：感受態(tài)細胞法（用Ca2?處理大腸桿菌，使其吸收DNA）。4.目的基因的檢測與鑒定分子水平：①DNA分子雜交（檢測是否插入目的基因）；②分子雜交（檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA）；③抗原-抗體雜交（檢測是否翻譯出蛋白質(zhì)）；個體水平：如抗蟲棉的抗蟲接種實驗、轉(zhuǎn)基因作物的抗病性檢測。二、細胞工程（一）植物細胞工程1.植物組織培養(yǎng)（原理：**植物細胞全能性**）過程：外植體（離體的植物器官、組織、細胞）→脫分化（形成無定形狀態(tài)的愈傷組織，需避光、生長素與細胞分裂素比例相當(dāng)）→再分化（愈傷組織分化為根、芽，需光照：生長素比例高→生根；細胞分裂素比例高→生芽）→完整植株。條件：無菌環(huán)境、營養(yǎng)（蔗糖、礦質(zhì)元素）、植物激素（生長素、細胞分裂素）、適宜溫度/pH。2.植物體細胞雜交（克服遠緣雜交不親和障礙）過程：去壁（纖維素酶+果膠酶處理，獲得原生質(zhì)體）→原生質(zhì)體融合（物理法：電融合；化學(xué)法：PEG誘導(dǎo)）→雜種細胞篩選（通過細胞壁再生、染色體鑒定等）→雜種植株（如“白菜-甘藍”）。（二）動物細胞工程1.動物細胞培養(yǎng)（基礎(chǔ)技術(shù)）過程：原代培養(yǎng)（從動物組織消化分離細胞，培養(yǎng)至貼壁生長匯合）→傳代培養(yǎng)（胰蛋白酶處理，分瓶培養(yǎng)，注意“接觸抑制”）。條件：無菌無毒（定期更換培養(yǎng)液）、營養(yǎng)（葡萄糖、氨基酸、血清/血漿）、氣體環(huán)境（95%空氣+5%CO?，維持pH）、適宜溫度（36.5±0.5℃）。應(yīng)用：生產(chǎn)疫苗、干擾素；檢測有毒物質(zhì)（觀察細胞變異率）。2.動物細胞核移植（克隆技術(shù)）原理：動物細胞核全能性（體細胞核需卵母細胞的細胞質(zhì)激活）。過程：供體細胞（體細胞，如乳腺細胞）→去核卵母細胞（MⅡ期卵母細胞）→電融合/顯微注射→重組胚胎→代孕母體→克隆動物（如多利羊）。3.動物細胞融合與單克隆抗體細胞融合原理：細胞膜流動性，方法：PEG、電融合、滅活病毒（如仙臺病毒，誘導(dǎo)動物細胞融合）。單克隆抗體制備：①免疫小鼠（注射抗原，獲得產(chǎn)生特定抗體的漿細胞）；②骨髓瘤細胞（無限增殖）與漿細胞融合，篩選雜交瘤細胞（既能無限增殖，又能產(chǎn)生特異性抗體）；③克隆化培養(yǎng)+抗體檢測，獲得能穩(wěn)定分泌單抗的細胞株；④大規(guī)模培養(yǎng)（體外或腹腔內(nèi)），提取單抗。優(yōu)點：特異性強、靈敏度高、可大量制備，應(yīng)用于疾病診斷（如新冠抗體檢測）、靶向治療。三、胚胎工程（一）生殖細胞發(fā)生與受精作用1.精子發(fā)生：從初情期開始，精原細胞經(jīng)減數(shù)分裂→精子細胞→變形（頂體、尾形成）。2.卵子發(fā)生：胎兒期形成初級卵母細胞，排卵前完成減數(shù)第一次分裂（產(chǎn)生次級卵母細胞和極體），受精時完成減數(shù)第二次分裂（產(chǎn)生卵細胞和極體）。3.體外受精：精子獲能（如培養(yǎng)法、化學(xué)誘導(dǎo)法）→卵子培養(yǎng)至MⅡ期→共培養(yǎng)完成受精。（二）早期胚胎培養(yǎng)與胚胎移植1.早期胚胎培養(yǎng)：培養(yǎng)液含無機鹽、有機鹽、維生素、激素、氨基酸、核苷酸、血清等，胚胎發(fā)育至桑椹胚/囊胚階段可進行移植。2.胚胎移植（核心技術(shù)）：生理學(xué)基礎(chǔ)：①供體與受體同期發(fā)情（生殖器官生理狀態(tài)一致）；②胚胎在受體內(nèi)不發(fā)生免疫排斥；③受體對胚胎不發(fā)生遺傳影響。過程：供體超數(shù)排卵→配種/人工授精→沖卵（收集胚胎）→胚胎檢查→移植（手術(shù)/非手術(shù)法）→妊娠檢查。意義：充分發(fā)揮雌性優(yōu)良個體的繁殖潛力（如高產(chǎn)奶牛的快速擴繁）。（三）胚胎分割與干細胞1.胚胎分割：將桑椹胚或囊胚（內(nèi)細胞團均等分割）分割為2/4等份，移植后發(fā)育為同卵多胎，屬于無性繁殖。2.胚胎干細胞（ES細胞）：來源于早期胚胎（囊胚內(nèi)細胞團）或原始性腺，具有全能性，可分化為各種組織細胞，應(yīng)用于細胞治療（如帕金森病）、藥物篩選。四、發(fā)酵工程（一）發(fā)酵工程流程1.菌種選育：自然篩選、誘變育種（如紫外線誘變）、基因工程育種（如高產(chǎn)青霉素菌株）。2.培養(yǎng)基配制：根據(jù)菌種需求設(shè)計，如谷氨酸發(fā)酵用豆餅水解液+玉米漿（碳源、氮源），需調(diào)節(jié)碳氮比（影響產(chǎn)物類型）。3.滅菌：培養(yǎng)基（高壓蒸汽滅菌）、設(shè)備（干熱/濕熱滅菌），防止雜菌污染。4.發(fā)酵過程：控制溫度（如酵母菌20-30℃）、pH（如谷氨酸發(fā)酵加氨水調(diào)pH）、溶解氧（攪拌、通氧），監(jiān)測微生物生長（OD值）、產(chǎn)物濃度。5.產(chǎn)物分離：菌體（過濾、離心）；代謝產(chǎn)物（如酒精蒸餾、青霉素萃取、氨基酸離子交換）。（二）典型應(yīng)用食品：酸奶（乳酸菌發(fā)酵）、醬油（米曲霉發(fā)酵）；醫(yī)藥：青霉素（青霉菌發(fā)酵）、胰島素（工程菌發(fā)酵）；化工：酒精（酵母菌發(fā)酵）、檸檬酸（黑曲霉發(fā)酵）。五、蛋白質(zhì)工程（一）概念與流程概念：通過基因修飾/合成，改造現(xiàn)有蛋白質(zhì)或創(chuàng)造新蛋白質(zhì)（如改造胰島素結(jié)構(gòu)提高穩(wěn)定性）。流程：預(yù)期蛋白質(zhì)功能→設(shè)計蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)→推測氨基酸序列→找到對應(yīng)基因序列→基因改造/合成→表達蛋白質(zhì)。（二）與基因工程的區(qū)別基