2025年生物制藥發(fā)酵工藝標(biāo)準(zhǔn)知識(shí)考察試題及答案解析一、單項(xiàng)選擇題（每題1分，共20分）1.在2025版《生物制藥發(fā)酵工藝標(biāo)準(zhǔn)》中，對(duì)“種子批”活菌濃度測(cè)定要求的首選方法是A.平板計(jì)數(shù)法B.流式細(xì)胞術(shù)C.qPCR法D.微量量熱法答案：B解析：2025版標(biāo)準(zhǔn)將“單細(xì)胞精度”列為強(qiáng)制條款，流式細(xì)胞術(shù)可在2h內(nèi)給出±3%誤差內(nèi)的活菌濃度，且無(wú)需培養(yǎng)，顯著降低污染風(fēng)險(xiǎn)。2.對(duì)于表達(dá)單抗的CHO細(xì)胞流加工藝，2025版標(biāo)準(zhǔn)建議的滲透壓控制上限為A.320mOsm/kgB.350mOsm/kgC.380mOsm/kgD.420mOsm/kg答案：C解析：超過(guò)380mOsm/kg時(shí)，高爾基體N-糖基化相關(guān)酶活性下降15%以上，導(dǎo)致G0F比例降低，影響ADCC。3.采用一次性生物反應(yīng)器時(shí)，2025版標(biāo)準(zhǔn)對(duì)袋體完整性測(cè)試的最小靈敏度要求是A.5μmB.10μmC.15μmD.20μm答案：A解析：標(biāo)準(zhǔn)引用ASTMF2096-2024，要求檢出5μm針孔，以杜絕支原體穿透風(fēng)險(xiǎn)。4.在pH7.0、37℃條件下，若溶氧電極顯示120%飽和度，最可能的解釋是A.電極極化B.罐壓升高C.純氧通氣D.溫度補(bǔ)償失效答案：C解析：120%飽和度只有在純氧或富氧通氣時(shí)才會(huì)出現(xiàn)，電極若經(jīng)兩點(diǎn)校準(zhǔn)且無(wú)漂移，則C唯一合理。5.2025版標(biāo)準(zhǔn)將“連續(xù)發(fā)酵”定義為至少持續(xù)A.7dB.14dC.21dD.30d答案：C解析：≥21d才可進(jìn)入“連續(xù)”監(jiān)管通道，享受批簽發(fā)豁免優(yōu)惠，但需在線PAT數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)上傳。6.對(duì)E.coli高密度發(fā)酵，2025版標(biāo)準(zhǔn)推薦的比生長(zhǎng)速率μ上限為A.0.2h?1B.0.4h?1C.0.6h?1D.0.8h?1答案：B解析：μ>0.4h?1時(shí)，乙酸生成速率呈指數(shù)上升，導(dǎo)致質(zhì)粒丟失率>5%，不符合GMP附錄《重組菌穩(wěn)定性指南》。7.在單抗純化中，若ProteinA層析后HCP>100ppm，2025版標(biāo)準(zhǔn)要求的下一步措施是A.陰離子交換B.病毒納濾C.低pH病毒滅活D.疏水層析答案：A解析：陰離子流穿模式可在不改變緩沖體系的前提下去除>90%HCP，且收率>95%。8.2025版標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，發(fā)酵尾氣中CO?濃度在線監(jiān)測(cè)的最低頻率為A.1次/minB.1次/5minC.1次/10minD.1次/30min答案：A解析：CO?分壓是計(jì)算RQ的核心參數(shù)，1次/min可及時(shí)捕捉代謝漂移，滿足PAT實(shí)時(shí)放行。9.對(duì)使用CRISPR編輯的菌株，2025版標(biāo)準(zhǔn)要求的脫靶位點(diǎn)驗(yàn)證深度為A.10×B.30×C.100×D.300×答案：C解析：100×覆蓋度可檢出≥1%的脫靶嵌合，滿足EMA《基因編輯微生物安全性評(píng)價(jià)指南》。10.在培養(yǎng)基優(yōu)化階段，2025版標(biāo)準(zhǔn)推薦的DoE最小實(shí)驗(yàn)點(diǎn)數(shù)（k=5因素）為A.16B.20C.28D.36答案：C解析：采用中心復(fù)合設(shè)計(jì)CCF，k=5時(shí)需28次實(shí)驗(yàn)，可獨(dú)立估計(jì)二次項(xiàng)與交互作用。11.2025版標(biāo)準(zhǔn)對(duì)“無(wú)菌模擬灌裝”的污染接受標(biāo)準(zhǔn)為A.0/1000B.1/5000C.1/10000D.1/50000答案：C解析：參考EUGMPAnnex1-2025，1/10000是連續(xù)三批驗(yàn)證的通過(guò)線。12.對(duì)Vero細(xì)胞流感疫苗，2025版標(biāo)準(zhǔn)推薦的微載體濃度為A.2g/LB.5g/LC.8g/LD.12g/L答案：B解析：5g/LCytodex1可在250r/min攪拌下保持<50W/m3剪切，且提供>2×10?cells/mL的貼附面積。13.2025版標(biāo)準(zhǔn)將“病毒種子批”外源因子檢測(cè)的體外指示細(xì)胞種類由3種增至A.4B.5C.6D.7答案：C解析：新增DuckCBC-ELD、Mv1Lu與A549，覆蓋禽類、嚙齒類、靈長(zhǎng)類病毒譜。14.對(duì)mRNA疫苗用質(zhì)粒，2025版標(biāo)準(zhǔn)對(duì)宿主基因組DNA殘留限度為A.≤0.1ng/μgB.≤1ng/μgC.≤10ng/μgD.≤50ng/μg答案：A解析：0.1ng/μg是WHO2025草案的閾值，低于此前10倍，以降低整合風(fēng)險(xiǎn)。15.2025版標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，連續(xù)發(fā)酵的在線細(xì)胞密度探頭每多少小時(shí)需用離線計(jì)數(shù)校準(zhǔn)一次A.6hB.12hC.24hD.48h答案：B解析：12h校準(zhǔn)可將電容法漂移控制在±5%以內(nèi)，滿足實(shí)時(shí)放行標(biāo)準(zhǔn)。16.對(duì)畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，2025版標(biāo)準(zhǔn)將甲醇誘導(dǎo)階段溫度下調(diào)至A.20℃B.25℃C.28℃D.30℃答案：B解析：25℃可顯著降低蛋白酶A活性，提高全長(zhǎng)蛋白比例15%以上。17.2025版標(biāo)準(zhǔn)中，一次性儲(chǔ)液袋的可提取物檢測(cè)需采用A.WFI70℃/24hB.0.9%NaCl40℃/14dC.50%EtOH40℃/24hD.pH9緩沖液50℃/7d答案：B解析：0.9%NaCl40℃/14d被USP<665>2025版列為“最惡劣”條件，可模擬整個(gè)貨架期。18.對(duì)ADC藥物，2025版標(biāo)準(zhǔn)將“裸抗比例”放行上限設(shè)為A.1%B.2%C.5%D.10%答案：B解析：裸抗>2%時(shí)，體內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合會(huì)降低治療指數(shù)，且與血小板減少相關(guān)。19.2025版標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，發(fā)酵過(guò)程變更需進(jìn)入“可比性”研究的臨界等級(jí)是A.Ⅰ級(jí)B.Ⅱ級(jí)C.Ⅲ級(jí)D.Ⅳ級(jí)答案：B解析：Ⅱ級(jí)變更（如規(guī)模放大10×以上）需啟動(dòng)多變量可比性研究，包括糖譜、電荷異構(gòu)、體內(nèi)藥效。20.對(duì)BSL-2級(jí)發(fā)酵，2025版標(biāo)準(zhǔn)要求的排氣HEPA完整性測(cè)試周期為A.每月B.每季度C.每半年D.每年答案：A解析：高產(chǎn)毒株或病毒載體即使BSL-2，也需每月DOP掃描，防止HEPA因高濕失效。二、配伍題（每題2分，共20分）A.乙酸抑制B.乳酸抑制C.氨抑制D.甲醇抑制E.谷氨酰胺抑制21.CHO細(xì)胞在>6mM時(shí)，比生長(zhǎng)速率下降50%22.E.coli在>40mM時(shí)，質(zhì)粒穩(wěn)定性下降23.畢赤酵母在>1%（v/v）時(shí)，AOX啟動(dòng)子受阻遏24.人類MSC在>15mM時(shí)，成骨分化受阻25.Vero細(xì)胞在>8mM時(shí)，流感病毒HA滴度下降1log答案：21-C22-A23-D24-B25-E解析：氨離子通過(guò)改變胞內(nèi)pH并抑制TCA酶；乙酸在E.coli中通過(guò)降低ATP產(chǎn)率；甲醇對(duì)AOX啟動(dòng)子為負(fù)反饋；乳酸在MSC中通過(guò)HIF-1α抑制成骨；谷氨酰胺在Vero中通過(guò)氨副產(chǎn)物抑制病毒復(fù)制。三、判斷題（每題1分，共10分）26.2025版標(biāo)準(zhǔn)允許使用動(dòng)物源蛋白胨作為商業(yè)培養(yǎng)基唯一氮源。27.對(duì)mRNA疫苗，加帽率低于90%即可判定為不合格。28.2025版標(biāo)準(zhǔn)將“連續(xù)制造”定義為至少持續(xù)21d且RQ波動(dòng)<5%。29.對(duì)ADC藥物，DAR值可比性范圍可接受±0.3。30.2025版標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，發(fā)酵尾氣VOC排放限值為20mg/m3。31.使用CRISPR編輯的菌株無(wú)需再進(jìn)行抗生素耐藥基因排查。32.2025版標(biāo)準(zhǔn)將“數(shù)字化批次記錄”列為強(qiáng)制要求。33.對(duì)一次性反應(yīng)袋，標(biāo)準(zhǔn)允許可提取物報(bào)告僅含TOC與pH。34.2025版標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，細(xì)胞庫(kù)需采用-196℃液氮保存。35.對(duì)單抗糖基化，G2F比例可比性可接受±5%。答案：26×27√28√29×30√31×32√33×34√35×解析：26必須無(wú)動(dòng)物源；27加帽率<90%影響翻譯效率；29DAR可比性±0.2；35G2F為±3%。四、填空題（每空2分，共20分）36.2025版標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，E.coli發(fā)酵過(guò)程中溶氧不得低于飽和度的________%，以保障________途徑通量。答案：20；TCA循環(huán)解析：低于20%時(shí)，TCA酶活性下降30%，乙酸激增。37.對(duì)CHO細(xì)胞，2025版標(biāo)準(zhǔn)將“高甘露糖型”上限設(shè)為_(kāi)_______%，其檢測(cè)方法首選________。答案：5；LC-ESI-MS解析：高甘露糖>5%時(shí)，血漿清除率增加3倍。38.2025版標(biāo)準(zhǔn)中，一次性儲(chǔ)液袋的“特定可提取物”檢測(cè)需使用________溶劑，在________℃下提取14d。答案：0.9%NaCl；40解析：與配伍題18一致。39.對(duì)Vero細(xì)胞流感疫苗，2025版標(biāo)準(zhǔn)將“病毒單細(xì)胞產(chǎn)率”定義為_(kāi)_______HAU/________cells。答案：10?3；10?解析：即每百萬(wàn)細(xì)胞產(chǎn)1HAU，為工藝放大關(guān)鍵指標(biāo)。40.2025版標(biāo)準(zhǔn)將“連續(xù)發(fā)酵”在線PAT數(shù)據(jù)上傳延遲不得超過(guò)________s，否則視為_(kāi)_______缺陷。答案：30；關(guān)鍵解析：30s延遲內(nèi)可回溯至具體PID參數(shù)，滿足FDACMC2025實(shí)時(shí)放行。五、簡(jiǎn)答題（每題10分，共30分）41.闡述2025版標(biāo)準(zhǔn)對(duì)“CRISPR編輯菌株”脫靶驗(yàn)證的技術(shù)路線與數(shù)據(jù)接受標(biāo)準(zhǔn)。答案：（1）路線：①全基因組測(cè)序（WGS）100×；②Cas-OFFinder預(yù)測(cè)Top100潛在脫靶；③對(duì)≥1%脫靶位點(diǎn)進(jìn)行PCR+NGS驗(yàn)證；④轉(zhuǎn)錄組測(cè)序驗(yàn)證無(wú)異常表達(dá)。（2）標(biāo)準(zhǔn)：①脫靶位點(diǎn)reads<0.1%；②無(wú)編碼區(qū)InDel；③無(wú)鄰近基因表達(dá)變化>2倍；④傳代60代后穩(wěn)定性驗(yàn)證通過(guò)。42.說(shuō)明2025版標(biāo)準(zhǔn)對(duì)“連續(xù)制造”實(shí)時(shí)放行的多變量統(tǒng)計(jì)過(guò)程控制（MSPC）模型構(gòu)建要點(diǎn)。答案：（1）數(shù)據(jù)池：≥30批歷史，含50個(gè)在線變量（pH、DO、RQ、電容、拉曼光譜等）。（2）預(yù)處理：缺失值<0.1%，采用PLS填補(bǔ)；光譜歸一化SNV；時(shí)間軸對(duì)齊DTW。（3）模型：動(dòng)態(tài)PCA-DPCA，滯后窗口3h；T2與SPE聯(lián)合控制限，置信度99%。（4）驗(yàn)證：外部驗(yàn)證10批，誤報(bào)率<1%，漏報(bào)率0%。（5）維護(hù)：每新增5批更新一次，若HotellingT2偏移>30%觸發(fā)再驗(yàn)證。43.比較2025版標(biāo)準(zhǔn)中“一次性生物反應(yīng)器”與“不銹鋼反應(yīng)器”在清潔驗(yàn)證方面的差異。答案：（1）一次性無(wú)需清潔，改為“可提取物+顆粒物”驗(yàn)證；不銹鋼需三步清潔（堿-酸-純化水）。（2）一次性驗(yàn)證周期為每供應(yīng)商1次/年；不銹鋼為每批清潔+3批驗(yàn)證。（3）殘留限度：不銹鋼TOC<0.5ppm，蛋白質(zhì)<0.1μg/cm2；一次性可提取物<5ppm，顆粒物>10μm為零檢出。（4）生物負(fù)載：一次性SAL10??；不銹鋼內(nèi)表面<1CFU/25cm2。（5）時(shí)間成本：一次性節(jié)省60%驗(yàn)證工時(shí)，但需額外可提取物毒理評(píng)估報(bào)告。六、計(jì)算題（每題15分，共30分）44.某E.coli高密度發(fā)酵罐工作體積50L，初始甘油500g，菌體對(duì)甘油得率Yx/s=0.45g/g，比生長(zhǎng)速率μ=0.35h?1，維持系數(shù)ms=0.025g/(g·h)。求：（1）最大干細(xì)胞量；（2）到達(dá)最大量所需時(shí)間；（3）若采用指數(shù)流加保持μ=0.35h?1，求10h時(shí)的甘油流加速率（g/h）。答案：（1）Xmax=500g×0.45=225g。（2）由dX/dt=μX，積分得t=ln(X/X?)/μ，取X?=0.1g，t=ln(225/0.1)/0.35≈17.8h。（3）F=(μX/Yx/s+msX)/Cs，設(shè)Cs=500g/L，X=225g，F(xiàn)=(0.35×225/0.45+0.025×225)/500≈0.38L/h=190g/h。45.某CHO連續(xù)灌注培養(yǎng)，灌流速率為1VVD，細(xì)胞密度保持80×10?cells/mL，體積1000L，目標(biāo)蛋白比產(chǎn)率qp=25pg/(cell·d)。求：（1）每日總蛋白產(chǎn)量（g）；（2）若下游純化收率75%，求年產(chǎn)能（kg）；（3）若采用3×500L平行罐，保持相同參數(shù)，年產(chǎn)能提升比例。答案：（1）P=80×10?cells/mL×25pg×1000L×1VVD×1d=2×101?pg=2000g=2kg。（2）年產(chǎn)能=2kg/d×0.75×365=547.5kg。（3）3×500L產(chǎn)能=1.5×547.5=821.25kg，提升比例=(821.5-547.5)/547.5=50%。七、案例分析題（每題20分，共40分）46.某企業(yè)在將15kL不銹鋼罐放大至45kL時(shí)，發(fā)現(xiàn)單抗產(chǎn)量下降18%，高甘露糖型比例由3%升至7%，請(qǐng)依據(jù)2025版標(biāo)準(zhǔn)分析可能原因并提出糾正策略。答案：（1）混合時(shí)間延長(zhǎng)：45kL時(shí)混合時(shí)間由25s增至65s，導(dǎo)致pH/DO梯度，局部高滲引發(fā)甘露糖苷酶活性升高。（2）CO?stripping效率下降，罐底pCO?>120mmHg，抑制高爾基體甘露糖苷酶Ⅱ，反向積累高甘露糖。（3）糾正：①增加2組斜葉槳，混合時(shí)間降至35s；②提升通氣比由0.1vvm至0.15vvm，添加微泡分布器；③采用CO?stripping模型在線預(yù)測(cè)，維持pCO?<80mmHg；④補(bǔ)加Mn2?至10μM，提高甘露糖苷酶Ⅱ活性，促使復(fù)雜型合成。驗(yàn)證3批后，產(chǎn)量恢復(fù)至95%，高甘露糖降至3.2%，符合±3%標(biāo)準(zhǔn)。47.某公司在連續(xù)發(fā)酵第28天出現(xiàn)未知峰（RRT1.07）且主峰純度由98%降至93%，請(qǐng)依據(jù)2025版標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)調(diào)查與處置路徑。答案：（1）立即觸發(fā)“偏差-Ⅲ級(jí)”警報(bào)，暫停下游純化。（2）在線拉曼比對(duì)，發(fā)現(xiàn)1.07峰對(duì)應(yīng)甲硫氨酸亞砜氧化。（3）回顧PAT數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)第25天起DO驟降10%，導(dǎo)致ROS升高。（4）根因：空壓機(jī)干燥劑失效，油霧進(jìn)入，催化氧化。（5）處置：①更換除油過(guò)濾器，DO恢復(fù)；②加0.1mMEDTA+0.2mM抗壞血酸；③采用pH7.2溫和還原層析，氧化峰降至0.5%；④啟動(dòng)可比性研究，體外活性與藥代無(wú)差異，放行。后續(xù)將空壓機(jī)納入月度PM，氧化事件零復(fù)發(fā)。八、設(shè)計(jì)題（30分）48.依據(jù)2025版標(biāo)準(zhǔn)，為“年產(chǎn)1000kg單抗”設(shè)計(jì)一條基于連續(xù)制造的模塊化生產(chǎn)線，要求：（1）列出上游、下游、制劑核心單元與規(guī)模；（2）給出PAT配置清單；（3）估算固定資產(chǎn)投資（USD）與單位成本（USD/g）；（4）描述數(shù)字化批次追溯架構(gòu)。答案：（1）上游：3×2000L一次性灌注罐，每罐80×10?cells/mL，1VVD，qp=30pg/(cell·d)，收率85%，年工作330d。下游：連續(xù)捕獲（3×20LProteinA周期性逆流），連續(xù)低pH病毒滅活，連續(xù)陰離子流穿，病毒納濾，超濾濃縮。制劑：2×15L連續(xù)無(wú)菌配制，隔離器灌裝，10mL/瓶，每批10萬(wàn)瓶。（2）PAT：拉曼（上游、捕獲）、FTIR（糖基化）、ICP-MS（金屬）、HCP-ELISA在線、病毒顆粒計(jì)數(shù)器、RTRT-MS。（3）CAPEX：土建5000萬(wàn)，設(shè)備1.2億（含PAT），QC2000萬(wàn)，總計(jì)1.7億USD。單位成本：總運(yùn)營(yíng)成本5500萬(wàn)USD/年，產(chǎn)能1000kg→55USD/g。（4）追溯：采用區(qū)塊鏈+IPC，每10s哈希一次PAT數(shù)據(jù)，智能合約自動(dòng)匹配COA，審計(jì)追蹤不可篡改，滿足FDAPart11與EUAnnex11。九、英文文獻(xiàn)翻譯與解讀（20分）49.閱讀以下2025版ICHQ5E修訂草案節(jié)選并回答問(wèn)題：“Forcontinuousbiomanufacturing,theconceptof‘batch’isreplacedby‘continuouslot’definedbyamaximumholdtimeof24hat2–8°Cor72hat≤–60°C.Real-timereleasetesting(RTRT)mustcoveridentity,purity,pote