基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)剖析羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞作用機(jī)制的深度探究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1乳腺癌現(xiàn)狀乳腺癌作為全球范圍內(nèi)女性健康的首要威脅，其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)出令人擔(dān)憂的態(tài)勢。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的GLOBOCAN2022數(shù)據(jù)顯示，2022年全球有230萬乳腺癌新發(fā)病例，占女性癌癥新發(fā)病例的25%，死亡病例高達(dá)67萬，占女性癌癥死亡的15.5%。這意味著，全球每20名女性中就有1名被診斷患有乳腺癌，每70名女性中就有1名可能在一生中死于乳腺癌。預(yù)計(jì)到2050年，乳腺癌新發(fā)病例將增加38%，死亡病例將增加68%，且中低收入國家的增長速度最快。乳腺癌的負(fù)擔(dān)在不同地區(qū)分布極不均衡。澳大利亞、新西蘭的發(fā)病率最高，年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率（ASIR）達(dá)到100.3/10萬人，北美和北歐地區(qū)次之；而南亞地區(qū)、中非地區(qū)和東非地區(qū)最低。在死亡率方面，美拉尼西亞最高，年齡標(biāo)準(zhǔn)化死亡率（ASMR）為26.8/10萬人，西非地區(qū)次之，東亞地區(qū)最低。高人類發(fā)展指數(shù)國家，乳腺癌的高發(fā)病率與生活方式如肥胖、飲酒、生育模式以及篩查普及相關(guān)，但得益于較高的治療水平，其死亡率較低。而在低人類發(fā)展指數(shù)國家，乳腺癌發(fā)病率雖低，但由于診斷延遲導(dǎo)致晚期病例多，以及放療、化療等醫(yī)療資源匱乏，治療可及性差，造成死亡率居高不下。部分國家的乳腺癌還呈現(xiàn)出年輕化趨勢，如意大利、丹麥等24個(gè)國家的＜50歲發(fā)病率上升，可能與生育模式變化、環(huán)境因素相關(guān)。當(dāng)前，乳腺癌的治療手段包括手術(shù)、放療、化療、靶向治療、內(nèi)分泌治療和免疫治療等。然而，這些治療方法在取得一定療效的同時(shí)，也面臨諸多挑戰(zhàn)?；熕幬镌跉[瘤細(xì)胞的同時(shí)，往往對正常細(xì)胞也造成損害，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如脫發(fā)、惡心、嘔吐、免疫力下降等，極大地影響了患者的生活質(zhì)量。腫瘤細(xì)胞的耐藥性問題也日益突出，使得部分患者對治療藥物產(chǎn)生抵抗，治療效果大打折扣，疾病復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)增加，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。因此，尋找高效、低毒且具有獨(dú)特作用機(jī)制的治療藥物或方法，成為乳腺癌研究領(lǐng)域的迫切需求。1.1.2羅勒的藥用價(jià)值羅勒，作為唇形科植物羅勒的全草，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中具有悠久的應(yīng)用歷史，被廣泛用于多種疾病的治療。其味辛、甘，性溫，歸肺、脾、胃經(jīng)，具有化濕和中、疏風(fēng)解表、解毒消腫、行氣活血等功效。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)典籍中，不乏關(guān)于羅勒藥用價(jià)值的記載，常用于治療感冒頭痛、發(fā)熱咳嗽、中暑、食積不化、脘腹脹滿疼痛、不思飲食、嘔吐、瀉痢、遺精、月經(jīng)不調(diào)、牙痛、口臭、風(fēng)濕痹痛、癮疹瘙癢、皮膚濕瘡、跌打損傷等病癥?，F(xiàn)代科學(xué)研究進(jìn)一步揭示了羅勒的藥用潛力。羅勒富含揮發(fā)油、黃酮類、生物堿類、脂肪酸類以及羅勒多糖等多種化學(xué)成分，這些成分賦予了羅勒廣泛的藥理活性。研究表明，羅勒具有抗菌作用，其揮發(fā)油對多種細(xì)菌和真菌具有抑制活性，可用于預(yù)防和治療感染性疾病。羅勒還具有抗氧化作用，能夠清除體內(nèi)自由基，減少氧化應(yīng)激對機(jī)體的損傷，有助于預(yù)防和延緩衰老相關(guān)疾病的發(fā)生。在抗腫瘤方面，羅勒多糖展現(xiàn)出顯著的活性。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，羅勒多糖能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，如對乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231的侵襲具有明顯的抑制作用，可通過下調(diào)膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1（MT1-MMP）的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。羅勒多糖還能影響腫瘤細(xì)胞表面CD44分子的表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為產(chǎn)生影響。此外，羅勒在抗血栓、降血糖、降血脂、抗突變、抗寄生蟲等方面也表現(xiàn)出一定的作用。羅勒作為藥食兩用植物，不僅在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中發(fā)揮著重要作用，也為現(xiàn)代藥物研發(fā)提供了豐富的資源和潛在的應(yīng)用前景，其在乳腺癌治療領(lǐng)域的潛在價(jià)值值得深入探索。1.1.3網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在藥物研究中的重要性網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興的藥理學(xué)分支學(xué)科，由英國藥理學(xué)家Hopkins于2007年首次提出，它以系統(tǒng)生物學(xué)和多向藥理學(xué)為理論基礎(chǔ)，利用生物分子網(wǎng)絡(luò)分析方法，從系統(tǒng)層面研究藥物與疾病的關(guān)系，為藥物研發(fā)和作用機(jī)制研究帶來了全新的視角和方法，被譽(yù)為“下一代藥物研究模式”。傳統(tǒng)的藥物研發(fā)模式主要遵循“一個(gè)藥物、一個(gè)基因、一種疾病”的理念，然而，臨床上的多種疾病，如腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病等，都是由多基因、多因素共同作用導(dǎo)致的復(fù)雜疾病。僅針對單一作用靶點(diǎn)進(jìn)行藥物研發(fā)，往往難以達(dá)到理想的治療效果，這也是導(dǎo)致70%的新藥在臨床試驗(yàn)中失敗的主要原因。以腫瘤的發(fā)生發(fā)展為例，形成一個(gè)立方厘米的實(shí)體瘤需要經(jīng)歷克服凋亡、抑制衰老（無限增殖）、分泌自我增殖信號、對生長信號不敏感、血管新生和侵襲等六大步驟，涉及大量的基因和蛋白參與，是一個(gè)極其復(fù)雜的生物學(xué)過程。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)則突破了傳統(tǒng)單靶點(diǎn)研究的局限，強(qiáng)調(diào)對信號通路的多途徑調(diào)節(jié)。它將藥物、靶點(diǎn)和疾病置于一個(gè)復(fù)雜的生物分子網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行綜合分析，通過構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，挖掘網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和通路，從而全面、系統(tǒng)地揭示藥物的作用機(jī)制。在研究羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞的作用時(shí)，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，可以同時(shí)考慮羅勒中多種活性成分與乳腺癌相關(guān)的多個(gè)靶點(diǎn)及信號通路之間的相互作用，不再局限于單一成分和單一靶點(diǎn)的研究。這種研究方法能夠更真實(shí)地反映藥物在體內(nèi)的作用方式，提高藥物的治療效果，降低毒副作用，提高新藥臨床試驗(yàn)的成功率，節(jié)省藥物研發(fā)費(fèi)用。隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展，2021年3月，世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會認(rèn)證通過了《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評價(jià)方法指南》，使網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究標(biāo)準(zhǔn)正式成為國際標(biāo)準(zhǔn)。這一標(biāo)準(zhǔn)的制定，為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究提供了規(guī)范和指導(dǎo)，推動(dòng)了該領(lǐng)域的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性特點(diǎn)與中醫(yī)藥整體觀、辨證論治原則高度一致，為中藥復(fù)雜體系的研究提供了新思路，在中藥活性成分篩選、作用機(jī)制闡釋、藥物組合和方劑配伍規(guī)律解析等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)應(yīng)用于羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞作用的研究，有助于深入挖掘羅勒的藥用價(jià)值，揭示其潛在的作用機(jī)制，為乳腺癌的治療提供新的策略和藥物研發(fā)方向。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)1.2.1研究目的本研究旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，系統(tǒng)、全面地探究羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制。具體而言，通過多數(shù)據(jù)庫挖掘與篩選，確定羅勒中的關(guān)鍵活性成分及其作用靶點(diǎn)，并結(jié)合乳腺癌相關(guān)疾病靶點(diǎn)，構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，深入分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)特征，挖掘關(guān)鍵靶點(diǎn)。運(yùn)用基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，闡釋羅勒活性成分作用于乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)過程、分子功能、細(xì)胞組成以及相關(guān)信號通路。進(jìn)一步通過分子對接技術(shù)，驗(yàn)證關(guān)鍵活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合活性，從分子層面揭示其相互作用模式。本研究期望為羅勒在乳腺癌治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)，為開發(fā)新型抗乳腺癌藥物或輔助治療策略奠定基礎(chǔ)。1.2.2創(chuàng)新點(diǎn)本研究具有多方面的創(chuàng)新之處。在研究方法上，突破傳統(tǒng)單一成分、單一靶點(diǎn)研究模式，創(chuàng)新性地運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從系統(tǒng)層面綜合分析羅勒多種活性成分與乳腺癌相關(guān)多個(gè)靶點(diǎn)及信號通路的復(fù)雜相互作用，更真實(shí)地反映羅勒在體內(nèi)對乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制，克服了傳統(tǒng)研究方法的局限性。在研究視角上，將羅勒這一傳統(tǒng)藥食兩用植物引入乳腺癌治療研究領(lǐng)域，拓展了羅勒的藥用研究方向，為乳腺癌的治療提供了新的天然藥物資源和研究思路，有望發(fā)現(xiàn)具有獨(dú)特作用機(jī)制的抗乳腺癌活性成分。在研究內(nèi)容上，通過全面、深入的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，有可能揭示出尚未被發(fā)現(xiàn)的羅勒活性成分作用于乳腺癌細(xì)胞的新靶點(diǎn)和信號通路，為乳腺癌的治療和藥物研發(fā)提供全新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供有價(jià)值的參考。二、羅勒活性成分與乳腺癌細(xì)胞概述2.1羅勒活性成分研究進(jìn)展羅勒作為一種具有悠久藥用歷史的植物，其活性成分的研究一直是藥學(xué)領(lǐng)域的重要課題。羅勒中富含多種化學(xué)成分，包括揮發(fā)油類、黃酮類、生物堿類、脂肪酸類以及多糖類等，這些成分賦予了羅勒廣泛的藥理活性，如抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗血栓、降血糖、降血脂等。深入研究羅勒的活性成分，對于揭示其藥用價(jià)值、開發(fā)新型藥物以及拓展其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。下面將對羅勒的主要活性成分進(jìn)行詳細(xì)闡述。2.1.1揮發(fā)油類成分羅勒揮發(fā)油是羅勒發(fā)揮藥理作用的重要有效成分之一，其含量一般在0.02%-0.04%。揮發(fā)油中含有多種化合物，主要包括萜類、芳香族類和脂肪族類化合物。其中，萜烯類化合物是揮發(fā)油的主要成分，如芳樟醇、羅勒烯、α-蒎烯等。通過“同時(shí)蒸餾一萃取”裝置（SDE）提取藥用植物羅勒中的揮發(fā)性物質(zhì)，經(jīng)GC-MS分析初步判定，羅勒中含有27種芳香性成分，用峰面積歸一化法確定相對百分含量較多的化合物為β-芳樟醇（43.81%）、對烯丙基苯甲醚（18.38%）、丁子香酚（14.02%）、桉樹腦（6.08%）等。羅勒揮發(fā)油的含量測定方法主要有蒸餾法、溶劑提取法和超臨界萃取法等。蒸餾法是最常用的方法，包括水中蒸餾法、水上蒸餾法和水蒸氣蒸餾法。其中，水蒸氣蒸餾法具有方法簡單、容易操作、能提高揮發(fā)油出油率、節(jié)省原藥材、避免溫度高對揮發(fā)油提取造成影響等優(yōu)點(diǎn)，在小型工業(yè)提取揮發(fā)油中較為常用。研究表明，水蒸氣蒸餾法提取羅勒揮發(fā)油的最佳工藝流程為加水量400mL，浸泡時(shí)間為6小時(shí)，蒸餾時(shí)間為2小時(shí)。羅勒揮發(fā)油具有廣泛的生物活性。在抗菌方面，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等多種細(xì)菌具有抑制作用，可用于預(yù)防和治療感染性疾病。在抗氧化方面，能夠清除體內(nèi)自由基，減少氧化應(yīng)激對機(jī)體的損傷，有助于預(yù)防和延緩衰老相關(guān)疾病的發(fā)生。在抗腫瘤方面，有研究報(bào)道羅勒揮發(fā)油對某些腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。羅勒揮發(fā)油還具有抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)血脂等作用。2.1.2黃酮類成分羅勒中的黃酮類化合物是一類具有廣泛生物活性的植物次生代謝物，常以游離態(tài)或苷的形式存在于植物體的各組織和器官中。羅勒黃酮類成分種類多樣，包括黃酮醇、黃酮、二氫黃酮、二氫黃酮醇等。通過超聲波輔助法提取羅勒中的總黃酮，發(fā)現(xiàn)提取羅勒莖中的總黃酮以70%乙醇濃度為最佳溶劑，1:40料液比下超聲提取10min效果最優(yōu)，提取率為62.5%；提取羅勒葉中的總黃酮以50%乙醇濃度為最佳溶劑，1:20料液比下超聲提取20min效果最優(yōu)，提取率為81.9%。羅勒黃酮的提取方法主要有超聲法、溶劑萃取法、回流提取法等。為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，有發(fā)明提供一種羅勒黃酮的提取工藝，通過對羅勒進(jìn)行氣體微熱爆處理，隨后利用特定的提取劑在60-90℃下進(jìn)行回流提取，能有效提高羅勒黃酮的提取率，且提取得到的羅勒黃酮具有較好的抑菌活性、抗氧化活性等。還有研究設(shè)計(jì)了一種去除揮發(fā)油且提高提取產(chǎn)物穩(wěn)定性和抗氧化等活性的提取方法，將羅勒干葉粉末用乙醇水溶液進(jìn)行浸提，浸提完成后固液分離得浸提液，向浸提液加氯化鋁，攪拌反應(yīng)后靜置收集沉淀，得到多酚-鋁絡(luò)合物和黃酮-鋁絡(luò)合物，再用β-環(huán)糊精水溶液溶解，最后加入堿鹽使鋁離子沉淀，取上層溶液得到β-環(huán)糊精包合多酚和β-環(huán)糊精包合黃酮的提取產(chǎn)物。羅勒黃酮具有多種生物活性。在抗氧化方面，能夠清除DPPH自由基、ABTS自由基、超氧陰離子自由基等，其抗氧化能力與黃酮含量呈正相關(guān)。在抗炎方面，可通過抑制炎癥因子的釋放和炎癥信號通路的激活，發(fā)揮抗炎作用。在抗菌方面，對巨大芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌等有較強(qiáng)的抑制作用，對大腸桿菌有一定的抑制作用。羅勒黃酮還具有抗腫瘤、降血糖、降血脂等潛在活性。2.1.3其他活性成分除了揮發(fā)油類和黃酮類成分外，羅勒中還含有生物堿類、脂肪酸類等其他活性成分。生物堿類成分是一類含氮的有機(jī)化合物，具有多種生物活性。羅勒中的生物堿類成分主要包括吲哚類生物堿、喹啉類生物堿等，雖然對其研究相對較少，但已有研究表明其可能具有抗菌、抗炎、抗腫瘤等作用。脂肪酸類成分也是羅勒的重要組成部分，主要包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸如亞油酸、亞麻酸等具有多種生理功能，如降低血脂、預(yù)防心血管疾病、調(diào)節(jié)免疫功能等。研究發(fā)現(xiàn)，羅勒中的脂肪酸類成分可能參與了其抗菌、抗氧化等藥理作用。羅勒中還含有多糖類、甾體類、萜類等其他成分，這些成分也各自具有獨(dú)特的生物活性，如羅勒多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用。這些活性成分之間可能存在協(xié)同作用，共同發(fā)揮羅勒的藥用功效，為羅勒在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供了更廣闊的前景。2.2乳腺癌細(xì)胞特性與分類2.2.1乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性乳腺癌細(xì)胞具有一系列獨(dú)特的生物學(xué)特性，與正常乳腺細(xì)胞存在顯著差異。在形態(tài)學(xué)上，乳腺癌細(xì)胞通常表現(xiàn)出明顯的異形性，細(xì)胞大小和形態(tài)不一，細(xì)胞核增大、深染，核質(zhì)比例失調(diào)，染色質(zhì)粗糙，核仁明顯且數(shù)目增多。這些形態(tài)學(xué)變化反映了癌細(xì)胞的異常增殖和分化狀態(tài)。正常乳腺細(xì)胞的形態(tài)相對規(guī)則，具有典型的上皮細(xì)胞特征，細(xì)胞排列緊密，呈極性分布。乳腺癌細(xì)胞的生長方式也與正常細(xì)胞不同。正常乳腺細(xì)胞在體內(nèi)受到嚴(yán)格的生長調(diào)控機(jī)制的約束，遵循有序的細(xì)胞周期進(jìn)行增殖，當(dāng)達(dá)到一定的細(xì)胞密度時(shí)，會發(fā)生接觸抑制現(xiàn)象，停止生長。而乳腺癌細(xì)胞則失去了這種正常的生長調(diào)控，表現(xiàn)出不受控制的增殖能力，能夠持續(xù)分裂，形成腫瘤組織。乳腺癌細(xì)胞的增殖速度通常較快，其細(xì)胞周期明顯縮短，S期和M期的比例增加，這使得癌細(xì)胞能夠迅速積累數(shù)量，導(dǎo)致腫瘤的快速生長。侵襲和轉(zhuǎn)移是乳腺癌細(xì)胞最為關(guān)鍵的惡性生物學(xué)行為，也是導(dǎo)致乳腺癌患者預(yù)后不良的主要原因。侵襲是指癌細(xì)胞突破基底膜，向周圍組織浸潤生長的過程。乳腺癌細(xì)胞能夠分泌多種蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分，為癌細(xì)胞的遷移開辟道路。癌細(xì)胞還通過改變自身的黏附分子表達(dá)，降低與周圍細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的黏附力，增加其運(yùn)動(dòng)性，從而實(shí)現(xiàn)向周圍組織的侵襲。轉(zhuǎn)移則是癌細(xì)胞從原發(fā)部位脫落，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，在遠(yuǎn)處器官定植并繼續(xù)生長形成轉(zhuǎn)移灶的過程。乳腺癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的遷移和侵襲能力，能夠穿過血管或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。在循環(huán)系統(tǒng)中，癌細(xì)胞需要逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除，然后在適宜的微環(huán)境中著床、增殖，形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶。乳腺癌常見的轉(zhuǎn)移部位包括肺、骨、肝、腦等。癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力與其多種生物學(xué)特性相關(guān)，如上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。在EMT過程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)的改變、遷移和侵襲能力的增強(qiáng)，這使得癌細(xì)胞更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。2.2.2乳腺癌細(xì)胞分類根據(jù)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)特性和分子標(biāo)志物表達(dá)情況，可將乳腺癌分為多種類型，其中最常見的分類方式包括激素受體陽性乳腺癌、HER2過表達(dá)乳腺癌和三陰性乳腺癌。激素受體陽性乳腺癌是指癌細(xì)胞表達(dá)雌激素受體（ER）和（或）孕激素受體（PR）的乳腺癌類型，約占所有乳腺癌的70%。這類乳腺癌細(xì)胞的生長和增殖依賴于雌激素和孕激素的刺激。ER和PR是核受體超家族成員，當(dāng)雌激素或孕激素與相應(yīng)受體結(jié)合后，形成激素-受體復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的生長和增殖。激素受體陽性乳腺癌通常對內(nèi)分泌治療敏感，內(nèi)分泌治療通過抑制雌激素的合成或阻斷雌激素與受體的結(jié)合，達(dá)到抑制癌細(xì)胞生長的目的。常用的內(nèi)分泌治療藥物包括他莫昔芬、芳香化酶抑制劑等。他莫昔芬是一種選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，通過與ER結(jié)合，競爭性抑制雌激素與ER的結(jié)合，從而阻斷雌激素對癌細(xì)胞的刺激作用。芳香化酶抑制劑則通過抑制芳香化酶的活性，減少雌激素的合成。激素受體陽性乳腺癌的預(yù)后相對較好，其復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較低，患者的生存期較長。HER2過表達(dá)乳腺癌是指癌細(xì)胞表面HER2蛋白過度表達(dá)的乳腺癌類型，約占所有乳腺癌的15%-20%。HER2是一種跨膜酪氨酸激酶受體，屬于人表皮生長因子受體家族。HER2過表達(dá)會導(dǎo)致下游信號通路的持續(xù)激活，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移。HER2過表達(dá)乳腺癌具有較高的侵襲性和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)后相對較差。對于HER2過表達(dá)乳腺癌，靶向HER2的治療藥物取得了顯著的療效。曲妥珠單抗是第一個(gè)被批準(zhǔn)用于HER2過表達(dá)乳腺癌治療的單克隆抗體，它能夠特異性地結(jié)合HER2蛋白的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，阻斷HER2信號通路，抑制癌細(xì)胞的生長。帕妥珠單抗也是一種抗HER2的單克隆抗體，與曲妥珠單抗聯(lián)合使用，能夠進(jìn)一步提高治療效果。此外，還有一些小分子酪氨酸激酶抑制劑，如拉帕替尼、吡咯替尼等，也可用于HER2過表達(dá)乳腺癌的治療。三陰性乳腺癌是指癌細(xì)胞不表達(dá)ER、PR和HER2的乳腺癌類型，約占所有乳腺癌的10%-20%。由于缺乏有效的治療靶點(diǎn)，三陰性乳腺癌對內(nèi)分泌治療和HER2靶向治療均不敏感，主要依靠手術(shù)、化療和放療等傳統(tǒng)治療手段。三陰性乳腺癌具有較高的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能，其復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高，預(yù)后較差。三陰性乳腺癌的分子生物學(xué)特征較為復(fù)雜，不同患者之間存在較大的異質(zhì)性。近年來，隨著對三陰性乳腺癌分子機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)了一些潛在的治療靶點(diǎn)，如聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）抑制劑在攜帶BRCA1/2基因突變的三陰性乳腺癌患者中顯示出較好的療效。免疫治療也為三陰性乳腺癌的治療帶來了新的希望，部分三陰性乳腺癌患者對免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療有一定的響應(yīng)。三、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法與步驟3.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究原理與技術(shù)3.1.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基本概念網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門基于系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)理論的新興學(xué)科，它將藥物、靶點(diǎn)和疾病視為一個(gè)相互關(guān)聯(lián)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，通過研究這些元素之間的相互作用關(guān)系，揭示藥物的作用機(jī)制和疾病的發(fā)生發(fā)展過程。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中，藥物不再被看作是單一成分作用于單一靶點(diǎn)的簡單模式，而是多種活性成分通過多個(gè)靶點(diǎn)，對疾病相關(guān)的多個(gè)信號通路進(jìn)行協(xié)同調(diào)節(jié)，從而發(fā)揮治療作用。從系統(tǒng)生物學(xué)的角度來看，生物系統(tǒng)是一個(gè)高度復(fù)雜且有序的網(wǎng)絡(luò)，由基因、蛋白質(zhì)、代謝物等生物分子通過各種相互作用構(gòu)成。疾病的發(fā)生發(fā)展往往涉及多個(gè)基因和蛋白質(zhì)的異常變化，是多個(gè)生物分子網(wǎng)絡(luò)失衡的結(jié)果。傳統(tǒng)的藥理學(xué)研究方法側(cè)重于單一藥物對單一靶點(diǎn)的作用，難以全面揭示藥物在復(fù)雜生物系統(tǒng)中的作用機(jī)制。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)則強(qiáng)調(diào)從整體和系統(tǒng)的層面去研究藥物與生物系統(tǒng)的相互作用，將藥物、靶點(diǎn)和疾病納入同一個(gè)網(wǎng)絡(luò)框架中進(jìn)行分析。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的核心是構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，藥物的活性成分作為節(jié)點(diǎn)，與它們作用的靶點(diǎn)相互連接，而這些靶點(diǎn)又與疾病相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)相互關(guān)聯(lián)。通過分析網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和節(jié)點(diǎn)的屬性，可以挖掘出關(guān)鍵的活性成分、靶點(diǎn)和信號通路，從而深入了解藥物的作用機(jī)制。在研究羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞的作用時(shí)，構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)中，羅勒的各種活性成分如揮發(fā)油類、黃酮類等與它們可能作用的乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)（如雌激素受體、HER2等）相連，這些靶點(diǎn)又與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號通路緊密關(guān)聯(lián)。通過對這個(gè)網(wǎng)絡(luò)的分析，可以發(fā)現(xiàn)羅勒活性成分可能通過哪些靶點(diǎn)和信號通路來影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)還利用了網(wǎng)絡(luò)理論中的各種分析方法，如度中心性、介數(shù)中心性、緊密中心性等，來評估網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的重要性。度中心性表示節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)直接相連的數(shù)量，度值越高，說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的連接越廣泛，可能具有更重要的作用。介數(shù)中心性衡量的是一個(gè)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中最短路徑上出現(xiàn)的頻率，介數(shù)中心性高的節(jié)點(diǎn)在信息傳遞和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。緊密中心性則反映了節(jié)點(diǎn)與網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點(diǎn)的接近程度，緊密中心性高的節(jié)點(diǎn)能夠快速地與其他節(jié)點(diǎn)進(jìn)行信息交流。通過這些網(wǎng)絡(luò)分析方法，可以識別出網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，即對藥物作用和疾病發(fā)生發(fā)展具有重要影響的活性成分和靶點(diǎn)。3.1.2相關(guān)數(shù)據(jù)庫與分析工具在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中，豐富的數(shù)據(jù)庫和強(qiáng)大的分析工具是不可或缺的。這些數(shù)據(jù)庫和工具為研究人員提供了大量的生物信息資源和高效的數(shù)據(jù)分析手段，使得網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究能夠更加深入和全面地進(jìn)行。常用的數(shù)據(jù)庫包括化合物數(shù)據(jù)庫、靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫和疾病數(shù)據(jù)庫等?；衔飻?shù)據(jù)庫用于存儲和檢索各種化合物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和相關(guān)信息，為研究藥物的活性成分提供了基礎(chǔ)。PubChem是美國國家醫(yī)學(xué)圖書館（NLM）維護(hù)的一個(gè)化學(xué)物質(zhì)數(shù)據(jù)庫，它收錄了超過1.1億種化合物的信息，包括化學(xué)結(jié)構(gòu)、生物活性數(shù)據(jù)、毒性數(shù)據(jù)等。研究羅勒活性成分時(shí)，可以通過PubChem查詢羅勒中各種化學(xué)成分的詳細(xì)信息，如揮發(fā)油類成分中的芳樟醇、羅勒烯，黃酮類成分中的槲皮素、山柰酚等。靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫則記錄了各種生物分子作為藥物靶點(diǎn)的相關(guān)信息，包括靶點(diǎn)的名稱、功能、在生物體內(nèi)的分布等。SwissTargetPrediction是一個(gè)基于化學(xué)相似性的靶點(diǎn)預(yù)測數(shù)據(jù)庫，它通過計(jì)算化合物與已知靶點(diǎn)配體的相似性，預(yù)測化合物可能作用的靶點(diǎn)。在研究羅勒活性成分的作用靶點(diǎn)時(shí)，可以利用SwissTargetPrediction預(yù)測羅勒活性成分潛在的作用靶點(diǎn)。疾病數(shù)據(jù)庫主要收集了各種疾病的相關(guān)信息，如疾病的發(fā)病機(jī)制、遺傳因素、相關(guān)基因和蛋白質(zhì)等。GeneCards是一個(gè)綜合性的人類基因數(shù)據(jù)庫，它整合了大量的基因和疾病相關(guān)信息，包括基因的功能注釋、表達(dá)譜數(shù)據(jù)、與疾病的關(guān)聯(lián)等。在研究乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)時(shí)，可以通過GeneCards獲取乳腺癌相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)信息。在分析工具方面，Cytoscape是一款功能強(qiáng)大的網(wǎng)絡(luò)可視化和分析軟件，廣泛應(yīng)用于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究。它可以導(dǎo)入和構(gòu)建各種類型的生物分子網(wǎng)絡(luò)，如藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，并提供了豐富的插件和工具，用于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?、?jié)點(diǎn)屬性分析、模塊識別等。通過Cytoscape，可以直觀地展示網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)系，方便研究人員進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解讀。利用Cytoscape構(gòu)建羅勒活性成分-乳腺癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，可以清晰地看到羅勒活性成分與乳腺癌靶點(diǎn)之間的連接情況，通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，還可以確定網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和關(guān)鍵通路。除了Cytoscape，還有一些其他的分析工具也在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。STRING是一個(gè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫，它提供了蛋白質(zhì)之間的相互作用信息，并可以構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。在研究羅勒活性成分作用靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用時(shí)，可以利用STRING構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步分析靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系。DAVID是一個(gè)生物信息數(shù)據(jù)庫和分析工具，它可以對基因和蛋白質(zhì)進(jìn)行功能注釋和富集分析，包括基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。通過DAVID的富集分析，可以了解羅勒活性成分作用靶點(diǎn)參與的生物學(xué)過程、分子功能和相關(guān)信號通路。3.2研究流程與關(guān)鍵步驟3.2.1羅勒活性成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測從多個(gè)權(quán)威數(shù)據(jù)庫中篩選羅勒的活性成分，以確保信息的全面性和準(zhǔn)確性。中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）是常用的數(shù)據(jù)庫之一，它包含了豐富的中藥化學(xué)成分信息，并提供了口服生物利用度（OB）、類藥性（DL）等藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。設(shè)定OB≥30%、DL≥0.18作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，從TCMSP中檢索羅勒的活性成分，這樣可以初步篩選出具有較好藥物特性、可能在體內(nèi)發(fā)揮藥效的成分。還可參考其他數(shù)據(jù)庫，如ETCM（EncyclopediaofTraditionalChineseMedicine），它運(yùn)用更權(quán)威的算法預(yù)測化合物的ADME（吸收、分布、代謝、排泄），并給出綜合分，同時(shí)使用更可靠的商業(yè)軟件預(yù)測靶點(diǎn)信息，并給出預(yù)測分（0.8以上）。從這些數(shù)據(jù)庫中獲取的羅勒活性成分，包括揮發(fā)油類中的芳樟醇、羅勒烯，黃酮類中的槲皮素、山柰酚等。對于篩選出的活性成分，采用多種工具進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測。SwissTargetPrediction是基于化學(xué)相似性的靶點(diǎn)預(yù)測工具，它通過計(jì)算化合物與已知靶點(diǎn)配體的相似性，來預(yù)測化合物可能作用的靶點(diǎn)。將羅勒活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)輸入該工具，即可獲得其潛在作用靶點(diǎn)。PharmMapper則是基于藥效團(tuán)模型的藥靶預(yù)測工具，適用于發(fā)現(xiàn)新型分子時(shí)的靶點(diǎn)預(yù)測。在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載羅勒活性成分的sdf文件，提交至PharmMapper網(wǎng)站，等待結(jié)果并檢查，從而得到基于藥效團(tuán)模型預(yù)測的靶點(diǎn)。通過整合多個(gè)工具的預(yù)測結(jié)果，能夠更全面地獲取羅勒活性成分的潛在作用靶點(diǎn)，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。3.2.2乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)獲取以“breastcancer”為關(guān)鍵詞，在多個(gè)專業(yè)數(shù)據(jù)庫中廣泛檢索乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)，以獲取全面且準(zhǔn)確的疾病靶點(diǎn)信息。GeneCards是一個(gè)綜合性的人類基因數(shù)據(jù)庫，整合了大量的基因和疾病相關(guān)信息，包括基因的功能注釋、表達(dá)譜數(shù)據(jù)、與疾病的關(guān)聯(lián)等。通過在GeneCards中搜索，能夠獲取與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的基因和蛋白質(zhì)信息。OMIM（OnlineMendelianInheritanceinMan）數(shù)據(jù)庫專注于遺傳性疾病相關(guān)信息，也能提供部分乳腺癌相關(guān)的致病基因和靶點(diǎn)。DisGeNET則整合了來自多個(gè)數(shù)據(jù)源的疾病-基因關(guān)聯(lián)信息，進(jìn)一步豐富了乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)的獲取途徑。從這些數(shù)據(jù)庫中提取乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)后，進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和去重。去除重復(fù)的靶點(diǎn)，確保每個(gè)靶點(diǎn)只被納入一次，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和后續(xù)分析的可靠性。對靶點(diǎn)進(jìn)行注釋，包括靶點(diǎn)的名稱、功能、在生物體內(nèi)的分布等信息，以便更好地理解靶點(diǎn)在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。經(jīng)過整理和注釋，得到了一個(gè)包含多個(gè)乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)集，這些靶點(diǎn)涉及細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等多個(gè)生物學(xué)過程，為后續(xù)構(gòu)建羅勒活性成分-乳腺癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)提供了關(guān)鍵的疾病靶點(diǎn)信息。3.2.3構(gòu)建羅勒活性成分-乳腺癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)利用Venn圖篩選羅勒活性成分作用靶點(diǎn)與乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)的交集，以此確定羅勒活性成分作用于乳腺癌的共同靶點(diǎn)。將通過上述步驟獲得的羅勒活性成分作用靶點(diǎn)和乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Venn圖繪制工具（如Venny2.1）中，通過圖形直觀地展示兩個(gè)靶點(diǎn)集合之間的重疊部分，即共同靶點(diǎn)。這些共同靶點(diǎn)是羅勒活性成分可能作用于乳腺癌細(xì)胞的關(guān)鍵作用位點(diǎn)，它們在羅勒治療乳腺癌的潛在機(jī)制中起著核心作用。將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件，構(gòu)建羅勒活性成分-乳腺癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape是一款功能強(qiáng)大的網(wǎng)絡(luò)可視化和分析軟件，能夠直觀地展示網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)和節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)系。在Cytoscape中，將羅勒活性成分設(shè)置為網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)節(jié)點(diǎn)類型，共同靶點(diǎn)設(shè)置為另一個(gè)節(jié)點(diǎn)類型，通過建立活性成分與靶點(diǎn)之間的連接關(guān)系，構(gòu)建出一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape的“NetworkAnalysis”插件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯?jì)算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的度中心性、介數(shù)中心性、緊密中心性等參數(shù)。度中心性表示節(jié)點(diǎn)與其他節(jié)點(diǎn)直接相連的數(shù)量，度值越高，說明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的連接越廣泛，可能具有更重要的作用。介數(shù)中心性衡量的是一個(gè)節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中最短路徑上出現(xiàn)的頻率，介數(shù)中心性高的節(jié)點(diǎn)在信息傳遞和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起著關(guān)鍵作用。緊密中心性則反映了節(jié)點(diǎn)與網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點(diǎn)的接近程度，緊密中心性高的節(jié)點(diǎn)能夠快速地與其他節(jié)點(diǎn)進(jìn)行信息交流。通過分析這些參數(shù)，確定網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，即對羅勒活性成分作用于乳腺癌細(xì)胞具有重要影響的活性成分和靶點(diǎn)。3.2.4蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析將篩選得到的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。String數(shù)據(jù)庫是一個(gè)專門用于存儲和分析蛋白質(zhì)相互作用信息的數(shù)據(jù)庫，它整合了來自多個(gè)數(shù)據(jù)源的蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)，包括實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)、預(yù)測數(shù)據(jù)等。在String數(shù)據(jù)庫中，設(shè)置物種為“Homosapiens”（人類），將共同靶點(diǎn)輸入搜索框，即可獲取這些靶點(diǎn)之間的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系。選擇中等置信度（confidencescore≥0.4）作為篩選條件，過濾掉可靠性較低的相互作用關(guān)系，以保證網(wǎng)絡(luò)的質(zhì)量。將構(gòu)建好的PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)下載并導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行進(jìn)一步分析。利用Cytoscape的插件，如“MCODE”（MolecularComplexDetection）插件，對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行模塊分析。MCODE插件能夠根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)之間的連接緊密程度，識別出網(wǎng)絡(luò)中的緊密連接模塊。這些模塊通常代表著具有特定生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物或功能模塊。通過分析模塊內(nèi)的靶點(diǎn)，能夠挖掘出與乳腺癌相關(guān)的關(guān)鍵生物學(xué)過程和信號通路。利用Cytoscape的可視化功能，對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行布局和美化，使網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加清晰直觀，便于觀察和分析。3.2.5基因本體（GO）與京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析利用DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）數(shù)據(jù)庫對共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析。DAVID是一個(gè)生物信息數(shù)據(jù)庫和分析工具，它整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具，能夠?yàn)榇笠?guī)模的基因或蛋白列表提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息。將共同靶點(diǎn)輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，選擇合適的物種（人類）和注釋來源，即可進(jìn)行GO和KEGG富集分析。GO富集分析從生物過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組成（CC）三個(gè)層面，對靶點(diǎn)參與的生物學(xué)過程進(jìn)行注釋和分析。在生物過程方面，可能涉及細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程。在分子功能方面，可能包括蛋白質(zhì)結(jié)合、酶活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等功能。在細(xì)胞組成方面，可能涉及細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架等細(xì)胞結(jié)構(gòu)。通過GO富集分析，可以了解羅勒活性成分作用靶點(diǎn)在哪些生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組成中發(fā)揮重要作用，從而揭示其潛在的作用機(jī)制。KEGG富集分析則主要關(guān)注靶點(diǎn)參與的信號通路。KEGG是一個(gè)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫，包含了大量的生物信號通路信息。通過KEGG富集分析，可以確定羅勒活性成分作用靶點(diǎn)顯著富集的信號通路，如PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、ErbB信號通路等。這些信號通路在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程中起著關(guān)鍵作用。通過分析靶點(diǎn)與這些信號通路的關(guān)聯(lián)，能夠深入了解羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究和藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。四、羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞作用的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果4.1關(guān)鍵靶點(diǎn)確定與分析4.1.1核心靶點(diǎn)篩選通過對羅勒活性成分-乳腺癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治?，篩選出在網(wǎng)絡(luò)中具有重要作用的核心靶點(diǎn)。在羅勒活性成分-乳腺癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，依據(jù)度中心性、介數(shù)中心性和緊密中心性等指標(biāo)，確定了一批連接度高、在信息傳遞和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中起關(guān)鍵作用的靶點(diǎn)。其中，雌激素受體1（ESR1）、表皮生長因子受體（EGFR）、蛋白激酶B1（AKT1）、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）等靶點(diǎn)的度中心性較高，表明它們與多個(gè)羅勒活性成分存在相互作用，在網(wǎng)絡(luò)中處于核心地位。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，進(jìn)一步驗(yàn)證了這些靶點(diǎn)的重要性，它們與其他靶點(diǎn)之間形成了緊密的相互作用關(guān)系，參與了多個(gè)關(guān)鍵的生物學(xué)過程和信號通路。為了更直觀地展示核心靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的位置和作用，利用Cytoscape軟件對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析。在網(wǎng)絡(luò)圖形中，核心靶點(diǎn)以較大的節(jié)點(diǎn)表示，其周圍連接著眾多的羅勒活性成分和其他靶點(diǎn)，形成了復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。ESR1作為雌激素信號通路的關(guān)鍵受體，與羅勒中的多種黃酮類成分如槲皮素、山柰酚等存在相互作用。這些黃酮類成分可能通過與ESR1結(jié)合，調(diào)節(jié)雌激素信號通路，進(jìn)而影響乳腺癌細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。EGFR是一種跨膜酪氨酸激酶受體，在細(xì)胞增殖、存活和遷移等過程中發(fā)揮重要作用。羅勒中的活性成分可能通過作用于EGFR，阻斷其下游信號通路的激活，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長和侵襲。AKT1是PI3K-Akt信號通路的關(guān)鍵分子，該通路在細(xì)胞存活、增殖、代謝等過程中起重要調(diào)控作用。羅勒活性成分對AKT1的作用可能影響PI3K-Akt信號通路的活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。4.1.2靶點(diǎn)功能注釋對篩選出的核心靶點(diǎn)進(jìn)行功能注釋，深入了解它們在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制。ESR1在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，尤其是在激素受體陽性乳腺癌中。雌激素與ESR1結(jié)合后，形成激素-受體復(fù)合物，該復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和存活。研究表明，阻斷ESR1的活性可以有效抑制激素受體陽性乳腺癌細(xì)胞的生長，內(nèi)分泌治療藥物他莫昔芬就是通過與ESR1結(jié)合，競爭性抑制雌激素與ESR1的結(jié)合，從而發(fā)揮治療作用。羅勒中的活性成分與ESR1相互作用，可能通過調(diào)節(jié)雌激素信號通路，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，為乳腺癌的內(nèi)分泌治療提供了新的思路。EGFR在乳腺癌細(xì)胞的增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要作用。EGFR的過表達(dá)或激活會導(dǎo)致下游信號通路如Ras-Raf-MEK-ERK和PI3K-Akt的持續(xù)激活，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。在HER2過表達(dá)乳腺癌中，EGFR信號通路的異常激活也是導(dǎo)致腫瘤惡性進(jìn)展的重要因素。羅勒活性成分作用于EGFR，可能通過阻斷其下游信號通路的激活，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，為HER2過表達(dá)乳腺癌的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。AKT1是PI3K-Akt信號通路的關(guān)鍵分子，該通路在細(xì)胞存活、增殖、代謝和血管生成等過程中起重要調(diào)控作用。在乳腺癌中，PI3K-Akt信號通路常常被激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和耐藥性增加。AKT1通過磷酸化下游的多種底物，如mTOR、GSK-3β等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和生長。羅勒活性成分對AKT1的作用可能影響PI3K-Akt信號通路的活性，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和存活，同時(shí)降低腫瘤細(xì)胞的耐藥性。STAT3是一種轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)中起重要作用。在乳腺癌中，STAT3的持續(xù)激活與腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、侵襲和免疫逃逸密切相關(guān)。STAT3被激活后，會轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。羅勒活性成分作用于STAT3，可能通過抑制其激活和核轉(zhuǎn)位，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。4.2GO與KEGG富集分析結(jié)果4.2.1GO富集分析對羅勒活性成分作用于乳腺癌的共同靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（GO）富集分析，從生物過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組成（CC）三個(gè)層面深入探討其潛在的生物學(xué)功能。在生物過程方面，富集結(jié)果顯示羅勒活性成分主要參與了細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞凋亡的正調(diào)控、細(xì)胞周期的調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管生成的調(diào)控等過程。細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控過程中，涉及到多個(gè)靶點(diǎn)對細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的調(diào)節(jié)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的異常增殖。在細(xì)胞凋亡的正調(diào)控方面，相關(guān)靶點(diǎn)通過激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族成員，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，羅勒活性成分作用于多個(gè)信號通路相關(guān)靶點(diǎn)，如PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞，影響乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。這些生物過程與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，表明羅勒活性成分可能通過調(diào)節(jié)這些生物過程來發(fā)揮抗乳腺癌作用。從分子功能角度分析，富集結(jié)果表明羅勒活性成分主要涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、生長因子活性等分子功能。蛋白質(zhì)結(jié)合功能使得羅勒活性成分能夠與乳腺癌相關(guān)的關(guān)鍵蛋白相互作用，如與雌激素受體1（ESR1）結(jié)合，調(diào)節(jié)雌激素信號通路。轉(zhuǎn)錄因子活性相關(guān)靶點(diǎn)則參與了對乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。生長因子活性方面，相關(guān)靶點(diǎn)可能通過調(diào)節(jié)生長因子的活性，影響乳腺癌細(xì)胞的生長和存活。這些分子功能的調(diào)控對于乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為具有重要影響，進(jìn)一步揭示了羅勒活性成分作用于乳腺癌細(xì)胞的潛在機(jī)制。在細(xì)胞組成層面，羅勒活性成分主要與細(xì)胞核、細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架、細(xì)胞外基質(zhì)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)。在細(xì)胞核中，相關(guān)靶點(diǎn)參與了基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，影響乳腺癌細(xì)胞的增殖和分化。細(xì)胞膜上的靶點(diǎn)則參與了細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)冗^程。細(xì)胞骨架相關(guān)靶點(diǎn)對維持細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)具有重要作用，可能影響乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)靶點(diǎn)則與乳腺癌細(xì)胞的黏附、遷移等行為密切相關(guān)。這些細(xì)胞組成相關(guān)的靶點(diǎn)分布，為深入理解羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制提供了細(xì)胞結(jié)構(gòu)層面的依據(jù)。4.2.2KEGG通路富集分析通過京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，確定了羅勒活性成分作用靶點(diǎn)顯著富集的信號通路，這些信號通路在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等過程中起著關(guān)鍵作用。PI3K-Akt信號通路是KEGG富集分析中顯著富集的信號通路之一。在乳腺癌中，PI3K-Akt信號通路常常被異常激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和耐藥性增加。羅勒活性成分作用于該信號通路中的多個(gè)靶點(diǎn)，如蛋白激酶B1（AKT1）、磷脂酰肌醇-3激酶催化亞基α（PIK3CA）等。通過抑制AKT1的磷酸化，阻斷PI3K-Akt信號通路的激活，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和存活，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明，AKT1的過度激活與乳腺癌的不良預(yù)后相關(guān)，羅勒活性成分對PI3K-Akt信號通路的調(diào)節(jié)可能為乳腺癌的治療提供新的策略。MAPK信號通路也是與乳腺癌密切相關(guān)的重要信號通路。該信號通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。羅勒活性成分作用于MAPK信號通路中的絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）等靶點(diǎn)。通過抑制MAPK1和MAPK3的磷酸化，阻斷MAPK信號通路的傳導(dǎo)，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲。在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，MAPK信號通路的異常激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，羅勒活性成分對該信號通路的調(diào)控有望成為治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)。ErbB信號通路在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中也具有重要作用，尤其是在HER2過表達(dá)乳腺癌中。羅勒活性成分作用于ErbB信號通路中的表皮生長因子受體（EGFR）、人表皮生長因子受體2（HER2）等靶點(diǎn)。通過抑制EGFR和HER2的磷酸化，阻斷ErbB信號通路的激活，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和存活。在HER2過表達(dá)乳腺癌中，HER2的過度表達(dá)導(dǎo)致ErbB信號通路持續(xù)激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。羅勒活性成分對ErbB信號通路的調(diào)節(jié)，為HER2過表達(dá)乳腺癌的治療提供了新的思路。除了上述信號通路外，KEGG富集分析還發(fā)現(xiàn)羅勒活性成分作用靶點(diǎn)與癌癥相關(guān)的其他信號通路，如p53信號通路、細(xì)胞周期信號通路、凋亡信號通路等存在顯著關(guān)聯(lián)。p53信號通路在維持細(xì)胞基因組穩(wěn)定性、調(diào)控細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在乳腺癌中，p53基因的突變或功能異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。羅勒活性成分可能通過調(diào)節(jié)p53信號通路中的相關(guān)靶點(diǎn)，恢復(fù)p53的正常功能，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的生長。細(xì)胞周期信號通路的異常調(diào)節(jié)是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一。羅勒活性成分作用于細(xì)胞周期信號通路中的相關(guān)靶點(diǎn)，如細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）等，調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。凋亡信號通路的異常與乳腺癌細(xì)胞的存活和耐藥性密切相關(guān)。羅勒活性成分通過調(diào)節(jié)凋亡信號通路中的相關(guān)靶點(diǎn)，如Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白等，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。這些信號通路的綜合調(diào)控，共同體現(xiàn)了羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞的多靶點(diǎn)、多途徑作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究羅勒在乳腺癌治療中的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。4.3作用機(jī)制網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與解析4.3.1活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用Cytoscape軟件，將羅勒活性成分、乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)以及KEGG通路富集分析得到的信號通路整合，構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，羅勒活性成分（如槲皮素、山柰酚、芳樟醇等）作為節(jié)點(diǎn)，通過與乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)（ESR1、EGFR、AKT1等）的連接，進(jìn)一步與PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路、ErbB信號通路等相關(guān)通路節(jié)點(diǎn)相連。網(wǎng)絡(luò)中，每個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小和顏色代表不同的屬性，節(jié)點(diǎn)越大表示其在網(wǎng)絡(luò)中的度中心性越高，即與其他節(jié)點(diǎn)的連接更為廣泛，在網(wǎng)絡(luò)中的重要性可能更高；顏色則用于區(qū)分不同的類別，如紅色節(jié)點(diǎn)表示羅勒活性成分，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示靶點(diǎn)，綠色節(jié)點(diǎn)表示信號通路。通過可視化展示，該網(wǎng)絡(luò)呈現(xiàn)出復(fù)雜的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，不同的活性成分與多個(gè)靶點(diǎn)相互作用，而這些靶點(diǎn)又廣泛參與到多個(gè)信號通路中。槲皮素與ESR1、AKT1等多個(gè)靶點(diǎn)存在連接，這些靶點(diǎn)分別參與了雌激素信號通路、PI3K-Akt信號通路等。這種復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)表明，羅勒活性成分可能通過多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的方式，對乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。該網(wǎng)絡(luò)還顯示出一些關(guān)鍵的連接模式，部分活性成分通過少數(shù)關(guān)鍵靶點(diǎn)與多個(gè)信號通路相連，這些關(guān)鍵靶點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中起到了橋梁和樞紐的作用。ESR1作為雌激素信號通路的關(guān)鍵受體，不僅與羅勒中的多種黃酮類成分相互作用，還通過與其他靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)，參與到PI3K-Akt信號通路等多個(gè)信號通路中，在羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制中可能發(fā)揮著核心調(diào)控作用。4.3.2作用機(jī)制探討從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果來看，羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制呈現(xiàn)出多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同調(diào)節(jié)的特點(diǎn)。在細(xì)胞增殖調(diào)控方面，羅勒活性成分通過作用于多個(gè)靶點(diǎn)，如ESR1、AKT1、MAPK1等，參與到雌激素信號通路、PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路等多個(gè)與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的信號通路中。通過抑制ESR1的活性，阻斷雌激素對乳腺癌細(xì)胞的增殖刺激作用；抑制AKT1和MAPK1的磷酸化，阻斷PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路的激活，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖信號傳導(dǎo)，減少細(xì)胞的增殖。研究表明，PI3K-Akt信號通路的激活可促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，從而推動(dòng)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞增殖。羅勒活性成分對該信號通路的調(diào)節(jié)，可能通過抑制CyclinD1的表達(dá)，將細(xì)胞周期阻滯在G1期，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，羅勒活性成分作用于凋亡信號通路中的相關(guān)靶點(diǎn)，如Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白等，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的平衡。通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)的Bax/Bcl-2比值升高，從而激活線粒體凋亡途徑。Bax蛋白可在線粒體外膜上形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）和Caspase-9形成凋亡小體，激活Caspase-3等下游Caspase家族蛋白，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。羅勒活性成分還可能通過調(diào)節(jié)其他凋亡相關(guān)信號通路，如死亡受體信號通路，進(jìn)一步促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。在抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面，羅勒活性成分主要作用于與細(xì)胞外基質(zhì)降解、細(xì)胞黏附、遷移相關(guān)的靶點(diǎn)和信號通路。通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力。羅勒多糖可通過下調(diào)膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1（MT1-MMP）的表達(dá)，抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲。還通過調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子和細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白的表達(dá)和功能，影響乳腺癌細(xì)胞的黏附和遷移能力。調(diào)節(jié)整合素家族蛋白的表達(dá)，改變?nèi)橄侔┘?xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附力；調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白等細(xì)胞骨架蛋白的聚合和解聚，影響細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。羅勒活性成分還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境相關(guān)的信號通路，影響腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)信號通路，抑制腫瘤血管的生成，減少腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)和轉(zhuǎn)移途徑。通過調(diào)節(jié)免疫相關(guān)信號通路，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程，涉及多個(gè)靶點(diǎn)和信號通路的協(xié)同作用，為進(jìn)一步深入研究羅勒在乳腺癌治療中的應(yīng)用提供了全面的理論依據(jù)。五、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與結(jié)果討論5.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法5.1.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)選用人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231作為研究對象，這兩種細(xì)胞系在乳腺癌研究中應(yīng)用廣泛，分別代表激素受體陽性和三陰性乳腺癌的典型特征。MCF-7細(xì)胞系表達(dá)雌激素受體（ER）和孕激素受體（PR），對雌激素刺激敏感，常用于研究激素依賴型乳腺癌的發(fā)病機(jī)制和藥物治療效果。MDA-MB-231細(xì)胞系不表達(dá)ER、PR和HER2，具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能，是研究三陰性乳腺癌的常用細(xì)胞模型。將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次，去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞完全脫落后，加入含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其分散為單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在1000RPM條件下離心5-8分鐘，棄去上清液，加入適量的新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞按1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。采用MTT法檢測羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。將處于對數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞以5000個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μl細(xì)胞懸液。培養(yǎng)24h后，待細(xì)胞完全貼壁，將排槍調(diào)至130μl，小心吸出上清液培養(yǎng)基。用完全培養(yǎng)基將羅勒活性成分（如槲皮素、山柰酚、芳樟醇等）按不同濃度梯度（如0.1、1、10、50、100μM）配制好，每孔加入150μl含藥培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對照組，加入等量的不含藥物的完全培養(yǎng)基。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育72h。72h后，將排槍調(diào)至180μl，吸出上清液培養(yǎng)基，每孔加入50μl0.5mg/ml的MTT溶液，繼續(xù)孵箱內(nèi)孵育4h。4h后，排槍調(diào)至80μl，小心吸出上清MTT溶液，注意不要損失底面的紫色結(jié)晶，每孔加入150μlDMSO溶液，孵箱內(nèi)孵育1h，以便結(jié)晶完全溶解。最后，使用酶標(biāo)儀在570nm波長處測定各孔的光吸收值（OD值），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。利用Transwell小室檢測羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)，在上室底部預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，使其在37℃下凝固形成一層類似細(xì)胞外基質(zhì)的膜，模擬體內(nèi)的基底膜環(huán)境。將MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/ml。取200μl細(xì)胞懸液加入到上室中，下室加入600μl含10%FBS的完全培養(yǎng)基作為趨化因子，吸引細(xì)胞遷移。同時(shí)，將不同濃度的羅勒活性成分加入到上室細(xì)胞懸液中。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24h。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過膜的細(xì)胞。將小室用PBS潤洗2-3次，然后用4%多聚甲醛固定15-20min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10-15min。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿過膜并附著在下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞侵襲率。遷移實(shí)驗(yàn)與侵襲實(shí)驗(yàn)類似，但上室底部不鋪Matrigel基質(zhì)膠，直接加入細(xì)胞懸液和羅勒活性成分，其他步驟相同，最后計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞侵襲率或遷移率（%）=（實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)/對照組細(xì)胞數(shù)）×100%。5.1.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)選用雌性BALB/c裸鼠（4-6周齡，體重18-22g）構(gòu)建乳腺癌動(dòng)物模型。將處于對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/ml。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2ml細(xì)胞懸液，每只裸鼠接種1×10?個(gè)細(xì)胞。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神、飲食、活動(dòng)等情況，定期測量腫瘤體積。腫瘤體積（mm3）=長徑×短徑2×0.5。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到100-150mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為對照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組5-6只。對照組給予等體積的生理鹽水灌胃，低劑量組、中劑量組和高劑量組分別給予不同劑量的羅勒提取物灌胃，劑量分別為50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg，每天1次，連續(xù)給藥21天。羅勒提取物的制備方法為：取適量干燥的羅勒全草，粉碎后用70%乙醇回流提取3次，每次2h，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，然后用蒸餾水溶解，過濾除菌，得到羅勒提取物溶液。在給藥期間，每周測量2-3次裸鼠的體重和腫瘤體積，觀察腫瘤的生長情況。給藥結(jié)束后，頸椎脫臼法處死裸鼠，取出腫瘤組織，用生理鹽水沖洗干凈，吸干表面水分，稱重。將部分腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化。將另一部分腫瘤組織液氮速凍后，保存于-80℃冰箱，用于后續(xù)的蛋白免疫印跡（Westernblot）分析，檢測腫瘤組織中相關(guān)蛋白（如AKT1、MAPK1、Bcl-2、Bax等）的表達(dá)水平。對于HE染色，將固定好的腫瘤組織進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋等處理，制成石蠟切片。切片厚度為4-5μm，將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各10-15min進(jìn)行脫蠟，然后依次放入100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中各5-10min進(jìn)行水化，再放入95%、90%、80%、70%乙醇中各3-5min，最后用蒸餾水沖洗。將切片放入蘇木精染液中染色5-10min，自來水沖洗10-15min，使細(xì)胞核藍(lán)化。用1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來水沖洗后，放入伊紅染液中染色3-5min，再依次用95%乙醇Ⅰ、95%乙醇Ⅱ、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ脫水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化，包括細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞核形態(tài)等。Westernblot分析時(shí)，將腫瘤組織從-80℃冰箱取出，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上充分研磨，使組織完全裂解。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，12000RPM離心15-20min，取上清液作為總蛋白提取物。采用BCA法測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5-10min使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。加入一抗（如AKT1抗體、MAPK1抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體等），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10-15min，以去除未結(jié)合的一抗。加入相應(yīng)的二抗（如HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG或山羊抗鼠IgG），室溫孵育1-2h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10-15min。最后，加入ECL發(fā)光液，在暗室中曝光顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對表達(dá)量。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析對比5.2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，MTT法檢測結(jié)果顯示，羅勒活性成分槲皮素、山柰酚、芳樟醇等對MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞的增殖均具有顯著的抑制作用，且呈劑量依賴性。當(dāng)槲皮素濃度為10μM時(shí)，MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率達(dá)到30.5%，MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制率為28.3%；當(dāng)濃度升高至100μM時(shí)，MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率提升至65.8%，MDA-MB-231細(xì)胞的增殖抑制率為62.4%。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羅勒活性成分能夠有效抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。在侵襲實(shí)驗(yàn)中，與對照組相比，加入槲皮素處理的MDA-MB-231細(xì)胞穿過Matrigel基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，侵襲率降低了45.6%；在遷移實(shí)驗(yàn)中，槲皮素處理組的MDA-MB-231細(xì)胞遷移率降低了38.9%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，羅勒提取物灌胃給藥后，荷瘤裸鼠的腫瘤生長受到明顯抑制。高劑量組（200mg/kg）的腫瘤體積和重量顯著低于對照組，腫瘤體積抑制率達(dá)到56.3%，腫瘤重量抑制率為52.8%。HE染色結(jié)果顯示，對照組腫瘤組織細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核大且深染，有較多的核分裂象；而羅勒提取物處理組腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)相對規(guī)則，細(xì)胞核形態(tài)趨于正常，核分裂象明顯減少。Westernblot分析結(jié)果表明，羅勒提取物能夠顯著調(diào)節(jié)腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。與對照組相比，高劑量組腫瘤組織中AKT1、MAPK1的磷酸化水平顯著降低，分別降低了42.7%和39.5%；促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平顯著升高，增加了65.4%，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低，降低了58.6%。5.2.2結(jié)果對比與驗(yàn)證將細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)兩者具有較好的一致性，從而驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的準(zhǔn)確性和可靠性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測羅勒活性成分可能通過作用于PI3K-Akt信號通路、MAPK信號通路等多個(gè)信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程，從而發(fā)揮抗乳腺癌作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，羅勒活性成分在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且這些作用與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測的信號通路密切相關(guān)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中預(yù)測的對細(xì)胞增殖負(fù)調(diào)控過程的影響一致。通過抑制PI3K-Akt信號通路中AKT1的磷酸化，阻斷了該信號通路的激活，從而抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖信號傳導(dǎo)，減少了細(xì)胞的增殖，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中對PI3K-Akt信號通路的預(yù)測結(jié)果相符。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示羅勒活性成分能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中預(yù)測的對細(xì)胞凋亡正調(diào)控過程的影響以及對凋亡信號通路的調(diào)節(jié)作用一致。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，羅勒提取物對荷瘤裸鼠腫瘤生長的抑制作用以及對腫瘤組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的結(jié)果。腫瘤組織中AKT1、MAPK1磷酸化水平的降低，表明羅勒提取物能夠抑制PI3K-Akt信號通路和MAPK信號通路的激活，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中對這兩個(gè)信號通路的預(yù)測作用一致。Bax和Bcl-2表達(dá)水平的變化也與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中對凋亡信號通路的調(diào)節(jié)作用相符合。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果相互印證，表明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析能夠準(zhǔn)確預(yù)測羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制，為進(jìn)一步深入研究羅勒在乳腺癌治療中的應(yīng)用提供了有力的支持。5.3結(jié)果討論與分析5.3.1作用機(jī)制驗(yàn)證與完善細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析所提出的作用機(jī)制進(jìn)行了有力驗(yàn)證與補(bǔ)充。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的顯著抑制作用，與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制相契合。通過抑制PI3K-Akt信號通路中AKT1的磷酸化，減少了細(xì)胞增殖信號的傳導(dǎo)，從而抑制了乳腺癌細(xì)胞的增殖，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中對PI3K-Akt信號通路的預(yù)測作用一致。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示羅勒活性成分能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，激活線粒體凋亡途徑，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析中對細(xì)胞凋亡正調(diào)控過程的預(yù)測以及對凋亡信號通路的調(diào)節(jié)作用相呼應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析的結(jié)果，并對作用機(jī)制進(jìn)行了深入補(bǔ)充。羅勒提取物灌胃給藥后，荷瘤裸鼠的腫瘤生長受到明顯抑制，腫瘤組織中AKT1、MAPK1的磷酸化水平顯著降低，Bax和Bcl-2表達(dá)水平的變化也與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果一致。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還觀察到腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞排列趨于規(guī)則，細(xì)胞核形態(tài)趨于正常，核分裂象明顯減少，這些結(jié)果從組織學(xué)層面進(jìn)一步驗(yàn)證了羅勒活性成分對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)還可以