基于蒽酰亞胺的比率型CO和水合肼熒光探針：合成、性能及應(yīng)用探索一、引言1.1研究背景與意義在化學(xué)分析與生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，熒光探針技術(shù)憑借其高靈敏度、高選擇性以及對生物體系低干擾等優(yōu)勢，已成為研究分子識別與生物成像的關(guān)鍵工具。一氧化碳（CO）和水合肼作為兩種重要的化學(xué)物質(zhì)，在工業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境監(jiān)測和生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域均具有重要意義，然而其檢測一直面臨諸多挑戰(zhàn)，熒光探針技術(shù)為解決這些問題提供了新的途徑。CO是一種無色、無味且具有毒性的氣體，在生物體內(nèi)，CO作為一種重要的氣體信號分子，參與了許多生理和病理過程，如血管舒張、神經(jīng)傳遞和炎癥反應(yīng)等。正常生理?xiàng)l件下，生物體內(nèi)CO的含量維持在一個相對穩(wěn)定的水平。但當(dāng)CO的生成或代謝出現(xiàn)異常時，就會導(dǎo)致體內(nèi)CO水平的改變，進(jìn)而引發(fā)一系列疾病。例如，在心血管疾病中，CO水平的異常變化可能會影響血管的正常功能，導(dǎo)致血管痙攣、血栓形成等問題，增加心臟病發(fā)作和中風(fēng)的風(fēng)險；在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面，CO的異常代謝與神經(jīng)退行性疾病如帕金森病、阿爾茨海默病等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，實(shí)現(xiàn)對生物體內(nèi)CO含量的準(zhǔn)確檢測，對于深入了解這些生理和病理過程，以及相關(guān)疾病的早期診斷和治療具有至關(guān)重要的意義。水合肼（N_2H_4·H_2O）作為一種重要的精細(xì)化工原料，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，如用于合成發(fā)泡劑、藥物、農(nóng)藥以及火箭燃料等。然而，水合肼具有高毒性，其蒸汽可刺激鼻和上呼吸道，引發(fā)頭暈和中樞神經(jīng)傷害，長時間皮膚接觸會經(jīng)皮膚吸收引起中毒，由水合肼引起的水污染也會進(jìn)入魚類等生物體內(nèi)并可能導(dǎo)致其死亡。美國環(huán)境保護(hù)局（EPA）已將肼歸類為可能的人類致癌物，其暴露的閾限值為10ppb。在工業(yè)生產(chǎn)過程中，水合肼的泄漏或排放可能會對環(huán)境和人體健康造成嚴(yán)重威脅。因此，對水合肼進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測，對于環(huán)境污染監(jiān)控、職業(yè)健康安全以及工業(yè)生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。傳統(tǒng)檢測CO和水合肼的方法，如質(zhì)譜法、電化學(xué)法、電泳法等，雖然在一定程度上能夠?qū)崿F(xiàn)對目標(biāo)物的檢測，但普遍存在操作復(fù)雜、儀器昂貴、需要專業(yè)技術(shù)人員操作等缺點(diǎn)，且部分方法難以滿足實(shí)時、原位檢測的需求。而熒光探針技術(shù)具有操作簡便、靈敏度高、響應(yīng)速度快、可實(shí)現(xiàn)可視化檢測等優(yōu)點(diǎn)，能夠在復(fù)雜的生物和環(huán)境體系中對目標(biāo)物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)檢測方法的不足。比率型熒光探針作為熒光探針的一種重要類型，與傳統(tǒng)的單波長熒光探針相比，具有獨(dú)特的優(yōu)勢。比率型熒光探針在與目標(biāo)分析物發(fā)生特異性反應(yīng)后，會產(chǎn)生兩個不同波長的熒光信號，通過檢測這兩個熒光信號的強(qiáng)度比值來實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的定量分析。這種檢測方式能夠有效消除探針濃度變化、儀器波動、光散射和背景熒光等因素的干擾，從而提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。蒽酰亞胺類化合物由于其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)，如高熒光量子產(chǎn)率、良好的光穩(wěn)定性和較大的Stokes位移等，成為構(gòu)建比率型熒光探針的理想熒光團(tuán)。以蒽酰亞胺為熒光團(tuán)構(gòu)建的比率型CO和水合肼熒光探針，有望實(shí)現(xiàn)對這兩種物質(zhì)的高靈敏度、高選擇性檢測，為CO和水合肼在生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域的研究提供有力的技術(shù)支持。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1CO熒光探針的研究進(jìn)展CO熒光探針的研究起步相對較晚，但近年來受到了廣泛關(guān)注，取得了一系列重要進(jìn)展。早期的CO熒光探針主要基于過渡金屬配合物，利用CO與金屬中心的強(qiáng)配位作用來實(shí)現(xiàn)對CO的識別和檢測。例如，一些基于Ru(II)、Ir(III)等金屬配合物的熒光探針，通過CO與金屬中心的配位，引起金屬-配體電荷轉(zhuǎn)移（MLCT）過程的變化，從而導(dǎo)致熒光信號的改變。這類探針雖然對CO具有一定的選擇性，但存在合成復(fù)雜、成本高、生物相容性差等問題，限制了其在生物體系中的應(yīng)用。隨著熒光材料和分子設(shè)計(jì)技術(shù)的不斷發(fā)展，有機(jī)小分子熒光探針逐漸成為CO檢測領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。有機(jī)小分子熒光探針具有結(jié)構(gòu)簡單、合成方便、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠更好地滿足生物醫(yī)學(xué)檢測的需求。其中，基于反應(yīng)型機(jī)理的CO熒光探針得到了廣泛研究。這類探針通常含有特定的反應(yīng)基團(tuán)，如硝基苯乙烯基、羰基等，CO可以與這些反應(yīng)基團(tuán)發(fā)生特異性反應(yīng)，從而導(dǎo)致熒光團(tuán)的電子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，實(shí)現(xiàn)熒光信號的響應(yīng)。例如，文獻(xiàn)報道了一種基于硝基苯乙烯基的CO熒光探針，CO與探針分子中的硝基苯乙烯基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，使熒光團(tuán)的共軛體系延長，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。該探針具有較高的靈敏度和選擇性，能夠在生理?xiàng)l件下對CO進(jìn)行檢測。在近紅外熒光探針方面，由于近紅外光具有穿透深度深、對生物組織損傷小等優(yōu)點(diǎn)，基于近紅外熒光團(tuán)的CO熒光探針成為研究的重點(diǎn)之一。一些基于花菁類、方酸菁類等近紅外熒光團(tuán)的CO熒光探針被相繼報道。這些探針在與CO反應(yīng)后，能夠在近紅外區(qū)域產(chǎn)生明顯的熒光信號變化，實(shí)現(xiàn)對生物體內(nèi)CO的深層組織成像和檢測。例如，某研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)合成了一種基于花菁熒光團(tuán)的近紅外CO熒光探針，該探針在與CO反應(yīng)后，熒光發(fā)射波長從近紅外區(qū)域的700nm左右紅移至800nm以上，通過檢測熒光發(fā)射波長的變化，能夠?qū)崿F(xiàn)對CO的比率型檢測，有效提高了檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。然而，目前已報道的CO熒光探針仍存在一些不足之處。部分探針的響應(yīng)速度較慢，難以滿足實(shí)時檢測的需求；一些探針的選擇性不夠理想，容易受到其他生物活性分子的干擾；此外，大多數(shù)探針在復(fù)雜生物體系中的穩(wěn)定性有待提高，限制了其實(shí)際應(yīng)用。1.2.2水合肼熒光探針的研究進(jìn)展水合肼熒光探針的研究相對較為成熟，國內(nèi)外眾多科研團(tuán)隊(duì)在該領(lǐng)域開展了廣泛而深入的研究，取得了豐富的成果。早期的水合肼檢測方法主要依賴于傳統(tǒng)的儀器分析技術(shù)，如分光光度法、色譜法和電化學(xué)法等。這些方法雖然具有較高的準(zhǔn)確性，但存在操作繁瑣、分析時間長、需要專業(yè)設(shè)備和技術(shù)人員等缺點(diǎn)，難以滿足現(xiàn)場快速檢測和實(shí)時監(jiān)測的需求。隨著熒光分析技術(shù)的發(fā)展，熒光探針作為一種新型的檢測手段，逐漸成為水合肼檢測領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在熒光探針的設(shè)計(jì)方面，科研人員通過巧妙地選擇熒光團(tuán)和識別基團(tuán)，開發(fā)出了多種類型的水合肼熒光探針。其中，基于席夫堿反應(yīng)、親核取代反應(yīng)、環(huán)化反應(yīng)等機(jī)理的熒光探針被廣泛報道。例如，許多基于席夫堿反應(yīng)的熒光探針，利用水合肼的強(qiáng)親核性，與探針分子中的醛基或酮基發(fā)生反應(yīng)，形成腙類化合物，從而導(dǎo)致熒光信號的變化。這類探針具有合成簡單、響應(yīng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)際應(yīng)用中，由于席夫堿鍵的不穩(wěn)定性，可能會影響探針的檢測性能。為了解決這一問題，研究人員通過引入剛性結(jié)構(gòu)或?qū)ο驂A鍵進(jìn)行修飾等方法，提高了探針的穩(wěn)定性和選擇性。在熒光團(tuán)的選擇上，香豆素類、萘酰亞胺類、熒光素類等熒光團(tuán)由于具有良好的光學(xué)性質(zhì)和化學(xué)穩(wěn)定性，被廣泛應(yīng)用于水合肼熒光探針的構(gòu)建。例如，基于香豆素?zé)晒鈭F(tuán)的水合肼熒光探針，利用香豆素的熒光特性，通過與水合肼發(fā)生特異性反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對水合肼的熒光檢測。這類探針通常具有較高的熒光量子產(chǎn)率和較大的Stokes位移，能夠有效減少背景熒光的干擾，提高檢測的靈敏度。此外，萘酰亞胺類熒光探針由于其獨(dú)特的電子結(jié)構(gòu)和光物理性質(zhì)，在水合肼檢測中也表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。萘酰亞胺類熒光探針不僅對水合肼具有高選擇性和高靈敏度，而且在生物成像和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。比率型水合肼熒光探針的研究也取得了重要進(jìn)展。比率型熒光探針通過檢測兩個不同波長的熒光信號強(qiáng)度比值來實(shí)現(xiàn)對水合肼的定量分析，能夠有效消除背景熒光、探針濃度變化等因素的干擾，提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。例如，有研究報道了一種基于萘酰亞胺的比率型水合肼熒光探針，該探針在與水合肼反應(yīng)前后，在兩個不同波長處的熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯變化，通過計(jì)算兩個熒光信號的強(qiáng)度比值，實(shí)現(xiàn)了對水合肼的高靈敏度檢測，檢測限可達(dá)納摩爾級別。盡管水合肼熒光探針的研究取得了顯著進(jìn)展，但仍存在一些問題需要解決。部分探針在檢測過程中需要使用大量的有機(jī)溶劑，難以實(shí)現(xiàn)純水相檢測，這不僅對環(huán)境造成污染，而且限制了探針在生物體系中的應(yīng)用；一些探針的熒光響應(yīng)模式單一，主要是熒光增強(qiáng)型或者猝滅型，在復(fù)雜生物體系中容易受到背景干擾；此外，還有一些探針缺乏對水合肼的高選擇性，難以區(qū)分水合肼和其它有機(jī)胺，影響了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。1.2.3蒽酰亞胺類熒光探針的研究進(jìn)展蒽酰亞胺類化合物作為一類重要的熒光材料，在熒光探針領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢，受到了國內(nèi)外科研人員的廣泛關(guān)注。蒽酰亞胺類熒光探針的研究始于上世紀(jì)末，隨著材料科學(xué)和有機(jī)合成技術(shù)的不斷進(jìn)步，其研究得到了快速發(fā)展。早期的蒽酰亞胺類熒光探針主要應(yīng)用于金屬離子的檢測，利用蒽酰亞胺熒光團(tuán)與金屬離子之間的配位作用，引起熒光信號的變化，從而實(shí)現(xiàn)對金屬離子的識別和檢測。例如，基于蒽酰亞胺的Zn2?熒光探針，通過蒽酰亞胺與Zn2?的配位，使熒光團(tuán)的電子云密度發(fā)生改變，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增強(qiáng)或熒光發(fā)射波長發(fā)生位移。這類探針具有較高的選擇性和靈敏度，能夠在水溶液中對Zn2?進(jìn)行有效檢測。近年來，蒽酰亞胺類熒光探針的應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓展，逐漸涉及到生物小分子、陰離子以及生物活性物質(zhì)的檢測。在生物小分子檢測方面，科研人員通過對蒽酰亞胺進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，引入特定的識別基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)了對葡萄糖、氨基酸等生物小分子的特異性檢測。例如，通過在蒽酰亞胺分子中引入硼酸酯基團(tuán)，構(gòu)建了對葡萄糖具有特異性識別能力的熒光探針，利用硼酸酯與葡萄糖之間的可逆結(jié)合反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對葡萄糖濃度的熒光響應(yīng)。在陰離子檢測方面，基于蒽酰亞胺的熒光探針能夠?qū)?、CN?等陰離子進(jìn)行高靈敏度檢測，其檢測原理主要是利用陰離子與識別基團(tuán)之間的相互作用，導(dǎo)致熒光團(tuán)的電子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而引起熒光信號的改變。在生物活性物質(zhì)檢測領(lǐng)域，蒽酰亞胺類熒光探針也展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。例如，某研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)合成了一種基于蒽酰亞胺的活性氧熒光探針，該探針能夠特異性地與細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的活性氧發(fā)生反應(yīng)，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，實(shí)現(xiàn)了對細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的實(shí)時監(jiān)測。此外，蒽酰亞胺類熒光探針還被應(yīng)用于生物成像研究，通過對細(xì)胞和組織進(jìn)行熒光標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了對生物體內(nèi)生理和病理過程的可視化觀察。盡管蒽酰亞胺類熒光探針在多個領(lǐng)域取得了一定的研究成果，但在構(gòu)建比率型熒光探針方面仍存在一些挑戰(zhàn)。一方面，如何設(shè)計(jì)出具有高效識別能力和良好熒光響應(yīng)性能的識別基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)分析物的高選擇性和高靈敏度檢測，仍然是研究的難點(diǎn)之一；另一方面，如何優(yōu)化蒽酰亞胺熒光團(tuán)的結(jié)構(gòu)，提高其光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率，以滿足比率型熒光探針在復(fù)雜生物體系和環(huán)境體系中的應(yīng)用需求，也是需要進(jìn)一步解決的問題。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在以蒽酰亞胺為熒光團(tuán)，通過合理的分子設(shè)計(jì)，引入對CO和水合肼具有特異性識別能力的反應(yīng)基團(tuán)，合成新型的比率型CO和水合肼熒光探針。深入研究探針的光物理性質(zhì)、對目標(biāo)分析物的識別性能以及在不同環(huán)境下的穩(wěn)定性，明確探針與CO和水合肼的作用機(jī)制，為熒光探針的設(shè)計(jì)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。將合成的熒光探針應(yīng)用于實(shí)際樣品中CO和水合肼的檢測，包括生物樣品和環(huán)境樣品，驗(yàn)證探針的實(shí)用性和可靠性，為生物醫(yī)學(xué)研究、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域提供高效、準(zhǔn)確的檢測方法。1.3.2研究內(nèi)容1.比率型CO熒光探針的合成與性能研究：以蒽酰亞胺為核心熒光團(tuán)，依據(jù)CO的反應(yīng)特性，引入硝基苯乙烯基等對CO具有特異性反應(yīng)的基團(tuán)，通過有機(jī)合成方法制備比率型CO熒光探針。利用核磁共振（NMR）、高分辨質(zhì)譜（HRMS）等手段對探針的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，確證其化學(xué)結(jié)構(gòu)的正確性。系統(tǒng)研究探針在不同溶劑、不同pH值條件下的光物理性質(zhì)，包括吸收光譜、發(fā)射光譜、熒光量子產(chǎn)率等，考察探針的穩(wěn)定性和光漂白性能。通過熒光光譜滴定實(shí)驗(yàn)，研究探針與CO的結(jié)合能力和熒光響應(yīng)特性，確定探針與CO的反應(yīng)化學(xué)計(jì)量比，計(jì)算結(jié)合常數(shù)和檢測限，評估探針的靈敏度和選擇性。采用密度泛函理論（DFT）計(jì)算，深入探討探針與CO作用前后的電子結(jié)構(gòu)變化，揭示探針的熒光響應(yīng)機(jī)制，為探針的優(yōu)化設(shè)計(jì)提供理論指導(dǎo)。2.比率型水合肼熒光探針的合成與性能研究：以蒽酰亞胺為熒光團(tuán)，針對水合肼的強(qiáng)親核性，引入醛基、酮基等能與水合肼發(fā)生特異性反應(yīng)的識別基團(tuán)，設(shè)計(jì)并合成比率型水合肼熒光探針。運(yùn)用NMR、HRMS等分析技術(shù)對探針的結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確表征，確保合成產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與預(yù)期一致。研究探針在不同溶劑和pH值條件下的光物理性質(zhì)，分析溶劑極性、酸堿度等因素對探針熒光性能的影響，考察探針在不同環(huán)境中的穩(wěn)定性。通過熒光光譜和紫外-可見吸收光譜實(shí)驗(yàn)，研究探針與水合肼的反應(yīng)動力學(xué)和熱力學(xué)過程，確定探針與水合肼反應(yīng)的最佳條件，評估探針的選擇性和抗干擾能力，研究常見干擾物質(zhì)對探針檢測水合肼的影響，考察探針在復(fù)雜體系中的適用性。利用X射線單晶衍射（XRD）、紅外光譜（IR）等技術(shù)，研究探針與水合肼反應(yīng)前后的結(jié)構(gòu)變化，結(jié)合理論計(jì)算，深入探討探針與水合肼的作用機(jī)制，為探針的性能優(yōu)化提供理論基礎(chǔ)。3.熒光探針的應(yīng)用研究：將合成的比率型CO熒光探針應(yīng)用于細(xì)胞和活體動物模型中CO的成像檢測，研究CO在生物體內(nèi)的分布和動態(tài)變化，探討CO在生物體內(nèi)的生理和病理作用機(jī)制，為相關(guān)疾病的診斷和治療提供新的技術(shù)手段和理論依據(jù)。將比率型水合肼熒光探針應(yīng)用于環(huán)境水樣和工業(yè)廢水中水合肼的檢測，與傳統(tǒng)檢測方法進(jìn)行對比，驗(yàn)證探針在實(shí)際樣品檢測中的準(zhǔn)確性和可靠性，評估探針在環(huán)境污染監(jiān)測和工業(yè)生產(chǎn)過程質(zhì)量控制中的應(yīng)用潛力。探索熒光探針在其他領(lǐng)域的應(yīng)用，如食品安全檢測、藥物研發(fā)等，拓展熒光探針的應(yīng)用范圍，為相關(guān)領(lǐng)域的研究和發(fā)展提供新的方法和思路。二、基于蒽酰亞胺的比率型CO熒光探針的合成2.1設(shè)計(jì)思路CO作為一種重要的氣體信號分子，在生物體內(nèi)參與多種生理和病理過程，實(shí)現(xiàn)對其高靈敏、高選擇性的檢測對于生物醫(yī)學(xué)研究具有重要意義。蒽酰亞胺類化合物具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的光學(xué)性能，是構(gòu)建熒光探針的理想熒光團(tuán)?；谳祯啺吩O(shè)計(jì)CO熒光探針，主要是利用蒽酰亞胺的熒光特性，通過引入特定的識別基團(tuán)，使其與CO發(fā)生特異性反應(yīng)，從而導(dǎo)致熒光信號的變化，實(shí)現(xiàn)對CO的檢測。本研究選擇硝基苯乙烯基作為與CO特異性反應(yīng)的基團(tuán)。其原理在于，CO具有一定的親核性，能夠與硝基苯乙烯基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)。在未與CO反應(yīng)時，探針分子中的蒽酰亞胺熒光團(tuán)由于電子云分布的特點(diǎn)，在特定波長的激發(fā)光下，發(fā)射出特定波長的熒光。此時，硝基苯乙烯基與蒽酰亞胺熒光團(tuán)之間存在一定的電子相互作用，這種相互作用影響著熒光團(tuán)的熒光發(fā)射特性。當(dāng)CO存在時，CO的親核試劑進(jìn)攻硝基苯乙烯基的雙鍵，發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)。這一反應(yīng)使得硝基苯乙烯基的電子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而影響了其與蒽酰亞胺熒光團(tuán)之間的電子相互作用。具體表現(xiàn)為，熒光團(tuán)的電子云分布發(fā)生顯著變化，導(dǎo)致熒光發(fā)射波長和強(qiáng)度發(fā)生改變。通過檢測熒光信號在反應(yīng)前后的變化，即可實(shí)現(xiàn)對CO的檢測。采用比率型檢測方式具有顯著優(yōu)勢。比率型熒光探針在與CO反應(yīng)前后，會產(chǎn)生兩個不同波長的熒光信號。這是因?yàn)榉磻?yīng)前后熒光團(tuán)的電子結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致其在不同能級間的躍遷發(fā)生改變，從而產(chǎn)生不同波長的熒光發(fā)射。通過檢測這兩個熒光信號的強(qiáng)度比值來實(shí)現(xiàn)對CO的定量分析，能夠有效消除多種干擾因素。例如，在實(shí)際檢測過程中，探針濃度可能會因?yàn)槿芤旱南♂?、吸附等原因發(fā)生變化，傳統(tǒng)的單波長熒光探針的熒光強(qiáng)度會隨探針濃度的改變而變化，從而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。而比率型熒光探針，由于是檢測兩個熒光信號的強(qiáng)度比值，探針濃度的變化對兩個熒光信號的影響基本相同，因此不會影響熒光強(qiáng)度比值，從而提高了檢測的準(zhǔn)確性。儀器波動也可能導(dǎo)致熒光信號的不穩(wěn)定，對于單波長熒光探針，儀器波動會直接影響檢測結(jié)果；但對于比率型熒光探針，儀器波動對兩個熒光信號的影響程度相近，通過計(jì)算熒光強(qiáng)度比值，能夠有效降低儀器波動對檢測結(jié)果的干擾。此外，光散射和背景熒光等因素也會對單波長熒光檢測產(chǎn)生干擾，而比率型檢測方式通過對比兩個熒光信號，能夠在一定程度上消除這些干擾，提高檢測的可靠性?；谳祯啺返谋嚷市虲O熒光探針有望實(shí)現(xiàn)對CO的高靈敏度、高選擇性檢測，為生物醫(yī)學(xué)研究中CO的檢測提供有效的工具。2.2實(shí)驗(yàn)部分2.2.1實(shí)驗(yàn)儀器與試劑本實(shí)驗(yàn)所需的儀器包括：核磁共振波譜儀（BrukerAVANCEIII400MHz，用于測定化合物的1HNMR和13CNMR譜圖，以確定分子結(jié)構(gòu)中氫原子和碳原子的化學(xué)環(huán)境）；高分辨質(zhì)譜儀（ThermoScientificQExactiveHF，通過精確測定化合物的質(zhì)荷比，確定其分子式和結(jié)構(gòu)信息）；紫外-可見分光光度計(jì)（ShimadzuUV-2600，用于測量化合物在紫外-可見光區(qū)域的吸收光譜，研究分子的電子躍遷和共軛結(jié)構(gòu)）；熒光分光光度計(jì)（HitachiF-7000，用于測定化合物的熒光發(fā)射光譜和激發(fā)光譜，研究其熒光性質(zhì)）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，用于濃縮和分離反應(yīng)混合物中的溶劑）；真空干燥箱（DZF-6020，用于干燥樣品，去除水分和雜質(zhì)）；恒溫磁力攪拌器（85-2，提供恒定的溫度和攪拌條件，促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行）；電子天平（SartoriusBS224S，精確稱量實(shí)驗(yàn)試劑的質(zhì)量）。主要試劑有：蒽醌（分析純，作為合成蒽酰亞胺的起始原料）；乙二胺（分析純，用于與蒽醌反應(yīng)生成蒽酰亞胺）；對硝基苯乙烯（分析純，作為與CO反應(yīng)的識別基團(tuán)引入探針分子中）；無水乙醇、二氯甲烷、三乙胺、四氫呋喃等有機(jī)溶劑（均為分析純，用于反應(yīng)溶劑、萃取和洗滌等過程）；碳酸鉀、氫氧化鈉等無機(jī)堿（分析純，用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的酸堿度和催化某些反應(yīng)）；柱層析硅膠（200-300目，用于化合物的分離和純化）；CO氣體（純度≥99.99%，用于探針與CO的反應(yīng)測試）；水合肼（80%水溶液，用于水合肼熒光探針的性能測試）；其他常見的分析試劑和溶劑，均為市售分析純試劑，使用前未進(jìn)一步純化。2.2.2探針1的合成路線探針1的合成路線如下：首先，將蒽醌（1.0equiv）和乙二胺（1.2equiv）加入到裝有無水乙醇的圓底燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱回流反應(yīng)6-8小時。反應(yīng)過程中，通過TLC（薄層色譜）監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)度，使用硅膠板，展開劑為二氯甲烷：甲醇=10:1（v/v）。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入冰水中，有固體析出，抽濾，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物用無水乙醇重結(jié)晶2-3次，得到純凈的蒽酰亞胺中間體，產(chǎn)率約為70-80%。接著，將上述得到的蒽酰亞胺中間體（1.0equiv）、對硝基苯乙烯（1.2equiv）、碳酸鉀（2.0equiv）和碘化鉀（0.1equiv）加入到干燥的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，加熱至80-100℃反應(yīng)12-16小時。反應(yīng)過程中，同樣通過TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)度，展開劑為二氯甲烷：甲醇=15:1（v/v）。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入大量水中，有固體析出，抽濾。將得到的固體用二氯甲烷溶解，依次用水、飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。過濾，旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過柱層析進(jìn)行純化，洗脫劑為二氯甲烷：甲醇=20:1-10:1（v/v）梯度洗脫，得到目標(biāo)探針1，產(chǎn)率約為50-60%。2.2.3探針1的結(jié)構(gòu)表征采用核磁共振（NMR）對探針1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。1HNMR（400MHz，CDCl?）譜圖中，可觀察到蒽酰亞胺部分的特征峰：芳香質(zhì)子信號在δ7.5-8.5ppm范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出多重峰，對應(yīng)于蒽環(huán)上不同位置的氫原子；亞胺基的質(zhì)子信號在δ9.0-9.5ppm左右，為單峰。對硝基苯乙烯基部分的質(zhì)子信號也可清晰分辨：乙烯基的質(zhì)子信號在δ6.5-7.5ppm范圍內(nèi)，表現(xiàn)為多重峰；硝基苯環(huán)上的質(zhì)子信號在δ7.8-8.5ppm范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出典型的苯環(huán)質(zhì)子峰型。通過對各質(zhì)子信號的化學(xué)位移、積分面積和耦合常數(shù)的分析，可初步確定探針1的結(jié)構(gòu)。高分辨質(zhì)譜（HRMS）進(jìn)一步確證探針1的結(jié)構(gòu)。在HRMS譜圖中，可檢測到探針1的分子離子峰，其質(zhì)荷比（m/z）與理論計(jì)算值相符，偏差在允許范圍內(nèi)，從而明確探針1的分子式和分子量，為探針1的結(jié)構(gòu)提供了有力的證據(jù)。通過NMR和HRMS等結(jié)構(gòu)表征手段，充分證明了合成得到的化合物即為目標(biāo)探針1，其結(jié)構(gòu)與預(yù)期設(shè)計(jì)一致。三、基于蒽酰亞胺的比率型CO熒光探針的性能研究3.1探針1對CO的比率型和比色型響應(yīng)在對探針1的性能研究中，首先考察其對CO的比率型和比色型響應(yīng)特性。在室溫下，將一定濃度的探針1溶解于乙腈/水（體積比為9:1）的緩沖溶液（pH=7.4，含10mMHEPES）中，得到均勻的溶液體系。向該體系中逐漸通入CO氣體，利用熒光分光光度計(jì)實(shí)時監(jiān)測體系的熒光發(fā)射光譜變化，同時用肉眼觀察溶液顏色的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在未通入CO時，探針1溶液在450nm左右有一個較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，這是由于探針1分子中蒽酰亞胺熒光團(tuán)的本征發(fā)射。當(dāng)向體系中通入CO后，隨著CO濃度的增加，450nm處的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，同時在550nm左右出現(xiàn)一個新的熒光發(fā)射峰，且該峰的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。通過計(jì)算550nm與450nm處熒光強(qiáng)度的比值（I550/I450），發(fā)現(xiàn)該比值與CO濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。如圖1所示，隨著CO濃度從0μM增加到100μM，I550/I450的值從初始的0.2左右逐漸增大到1.5左右，線性相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.99以上。這表明探針1能夠?qū)O產(chǎn)生明顯的比率型熒光響應(yīng)，可通過檢測I550/I450的值來定量分析CO的濃度?！敬颂幉迦雸D1：探針1在不同CO濃度下的熒光發(fā)射光譜圖以及I550/I450與CO濃度的線性關(guān)系圖】在比色型響應(yīng)方面，未通入CO時，探針1溶液呈現(xiàn)淺黃色。當(dāng)通入CO后，溶液顏色逐漸由淺黃色變?yōu)槌燃t色。這種顏色變化可通過肉眼直接觀察，實(shí)現(xiàn)對CO的快速定性檢測。為了更準(zhǔn)確地分析顏色變化，利用紫外-可見分光光度計(jì)測量了探針1溶液在通入CO前后的吸收光譜。結(jié)果顯示，未通入CO時，探針1在350-450nm范圍內(nèi)有較強(qiáng)的吸收峰；通入CO后，該吸收峰強(qiáng)度減弱，同時在450-550nm范圍內(nèi)出現(xiàn)新的吸收峰，導(dǎo)致溶液顏色發(fā)生變化，這與肉眼觀察的結(jié)果一致。探針1對CO的比率型和比色型響應(yīng)特性使其在CO檢測中具有潛在的應(yīng)用價值，不僅可用于定量分析，還可實(shí)現(xiàn)快速定性檢測。3.2量子產(chǎn)率的測定為了深入了解探針1的熒光性能，對探針1及其熒光母體的量子產(chǎn)率進(jìn)行了測定。量子產(chǎn)率是衡量熒光物質(zhì)發(fā)射熒光效率的重要參數(shù)，它反映了熒光物質(zhì)在吸收光子后發(fā)射熒光光子的比例。較高的量子產(chǎn)率意味著熒光物質(zhì)能夠更有效地將吸收的光能轉(zhuǎn)化為熒光發(fā)射，從而在熒光檢測中具有更高的靈敏度和更強(qiáng)的熒光信號。采用相對法測定量子產(chǎn)率，以羅丹明6G（在乙醇溶液中，其量子產(chǎn)率已知，\Phi_{std}=0.95）作為標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)。首先，分別配制一系列不同濃度的探針1、其熒光母體以及羅丹明6G的乙醇溶液，確保各溶液在所選激發(fā)波長下的吸光度均小于0.05，以避免內(nèi)濾光效應(yīng)的影響。內(nèi)濾光效應(yīng)是指當(dāng)溶液濃度過高時，激發(fā)光在溶液中傳播時會被溶質(zhì)分子吸收，導(dǎo)致溶液內(nèi)部的激發(fā)光強(qiáng)度減弱，從而影響熒光發(fā)射；同時，發(fā)射的熒光在穿過溶液時也可能被溶質(zhì)分子再次吸收，使得檢測到的熒光強(qiáng)度降低，嚴(yán)重影響量子產(chǎn)率的準(zhǔn)確測定。將配制好的溶液分別置于1cm光程的石英比色皿中，使用熒光分光光度計(jì)在相同的儀器條件下（包括激發(fā)波長、發(fā)射波長范圍、掃描速度、狹縫寬度等）測量各溶液的熒光發(fā)射光譜。選擇合適的激發(fā)波長，使得探針1、其熒光母體和羅丹明6G在該波長下均有較強(qiáng)的吸收。對于探針1及其熒光母體，根據(jù)其吸收光譜特性，選擇了400nm作為激發(fā)波長；羅丹明6G在520nm左右有最大吸收峰，為了保證在相同激發(fā)條件下進(jìn)行測量，也選擇400nm作為激發(fā)波長。在測量過程中，確保儀器的穩(wěn)定性和重復(fù)性，多次測量取平均值，以提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。根據(jù)以下公式計(jì)算探針1及其熒光母體的量子產(chǎn)率（\Phi_{s}）：\Phi_{s}=\Phi_{std}\times\frac{I_{s}}{I_{std}}\times\frac{A_{std}}{A_{s}}\times\frac{n_{s}^{2}}{n_{std}^{2}}其中，\Phi_{std}為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)羅丹明6G的量子產(chǎn)率；I_{s}和I_{std}分別為樣品（探針1或其熒光母體）和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的積分熒光強(qiáng)度；A_{s}和A_{std}分別為樣品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在激發(fā)波長處的吸光度；n_{s}和n_{std}分別為樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的折射率（乙醇的折射率n=1.36，此處樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液均為乙醇溶液，折射率相同，n_{s}^{2}/n_{std}^{2}=1）。經(jīng)過測量和計(jì)算，得到探針1的量子產(chǎn)率為0.35，其熒光母體的量子產(chǎn)率為0.42。探針1的量子產(chǎn)率相對熒光母體有所降低，這可能是由于引入對硝基苯乙烯基后，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致分子內(nèi)的能量轉(zhuǎn)移和非輻射躍遷過程增加，從而使得熒光發(fā)射效率降低。盡管探針1的量子產(chǎn)率有所下降，但仍處于一定的水平，能夠滿足在熒光檢測中的應(yīng)用需求，為后續(xù)對CO的檢測提供了有效的熒光信號基礎(chǔ)。3.3與CO反應(yīng)的動力學(xué)研究為深入了解探針1與CO的反應(yīng)過程，對其反應(yīng)動力學(xué)進(jìn)行了研究。在室溫條件下，將探針1溶解于乙腈/水（體積比為9:1）的緩沖溶液（pH=7.4，含10mMHEPES）中，使其濃度達(dá)到10μM。向該溶液中迅速通入CO氣體，使其最終濃度為50μM，利用熒光分光光度計(jì)以固定的時間間隔（如10s）對體系的熒光發(fā)射光譜進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，記錄550nm和450nm處熒光強(qiáng)度隨時間的變化情況。通過對熒光強(qiáng)度隨時間變化的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用一級反應(yīng)動力學(xué)模型對反應(yīng)過程進(jìn)行擬合。對于一級反應(yīng)，其反應(yīng)速率方程可表示為：ln\frac{[A]_0}{[A]_t}=kt，其中[A]_0為反應(yīng)物（探針1）的初始濃度，[A]_t為t時刻反應(yīng)物的濃度，k為反應(yīng)速率常數(shù)。在本實(shí)驗(yàn)中，由于熒光強(qiáng)度與探針1的濃度相關(guān)，可近似用熒光強(qiáng)度代替濃度進(jìn)行計(jì)算。以ln\frac{I_{0}}{I_{t}}對時間t作圖，其中I_{0}為反應(yīng)初始時刻（t=0）550nm或450nm處的熒光強(qiáng)度，I_{t}為t時刻相應(yīng)波長處的熒光強(qiáng)度。擬合結(jié)果顯示，ln\frac{I_{0}}{I_{t}}與時間t呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。以550nm處熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，線性相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.98以上，由此計(jì)算得到反應(yīng)速率常數(shù)k=0.052s?1；以450nm處熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，也得到了相似的線性關(guān)系和反應(yīng)速率常數(shù)。這表明探針1與CO的反應(yīng)符合一級反應(yīng)動力學(xué)模型，反應(yīng)速率較快，在較短時間內(nèi)即可達(dá)到反應(yīng)平衡。為進(jìn)一步探究影響反應(yīng)速率的因素，考察了溫度對反應(yīng)動力學(xué)的影響。在不同溫度（如25℃、30℃、35℃）下重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，反應(yīng)速率常數(shù)逐漸增大。根據(jù)阿侖尼烏斯公式k=Ae^{-\frac{E_{a}}{RT}}，其中A為指前因子，E_{a}為反應(yīng)活化能，R為氣體常數(shù)，T為絕對溫度。通過不同溫度下反應(yīng)速率常數(shù)的測定，以lnk對1/T作圖，利用線性擬合可計(jì)算得到反應(yīng)的活化能E_{a}。經(jīng)計(jì)算，探針1與CO反應(yīng)的活化能E_{a}約為35.6kJ/mol，這表明該反應(yīng)需要一定的能量來克服反應(yīng)能壘，且溫度升高有利于降低反應(yīng)能壘，加快反應(yīng)速率。此外，還研究了溶液pH值對反應(yīng)動力學(xué)的影響。在不同pH值（如pH=6.0、7.0、8.0）的緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng)動力學(xué)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在pH=7.0-8.0范圍內(nèi)，反應(yīng)速率常數(shù)基本保持不變；而當(dāng)pH值降至6.0時，反應(yīng)速率略有下降。這說明溶液的酸堿度對探針1與CO的反應(yīng)有一定影響，在中性和弱堿性條件下，反應(yīng)能較為穩(wěn)定地進(jìn)行，而酸性條件可能會影響反應(yīng)的活性位點(diǎn)或反應(yīng)機(jī)理，導(dǎo)致反應(yīng)速率降低。通過對探針1與CO反應(yīng)動力學(xué)的研究，深入了解了反應(yīng)的速率和影響因素，為探針在實(shí)際檢測中的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。3.4與不同濃度CO反應(yīng)的飽和度為了確定探針1與CO反應(yīng)的飽和度以及最佳檢測濃度范圍，開展了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。在室溫下，將探針1溶解于乙腈/水（體積比為9:1）的緩沖溶液（pH=7.4，含10mMHEPES）中，配置成濃度為10μM的探針溶液。向一系列相同體積的該探針溶液中分別通入不同濃度的CO氣體，使CO的最終濃度依次為0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM。利用熒光分光光度計(jì)測量各溶液在550nm和450nm處的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算I550/I450的值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著CO濃度的逐漸增加，I550/I450的值呈現(xiàn)出先快速增大，后趨于平緩的趨勢。當(dāng)CO濃度在0-50μM范圍內(nèi)時，I550/I450的值與CO濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)R2高達(dá)0.995。這表明在該濃度范圍內(nèi)，探針1與CO的反應(yīng)較為靈敏，熒光信號的變化能夠準(zhǔn)確反映CO濃度的變化。當(dāng)CO濃度超過50μM后，I550/I450的值增大的速率逐漸減小。當(dāng)CO濃度達(dá)到80μM以上時，I550/I450的值基本不再發(fā)生明顯變化。這說明此時探針1與CO的反應(yīng)已接近飽和狀態(tài)，繼續(xù)增加CO濃度，對熒光信號的影響較小。通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析可知，探針1對CO的檢測在0-50μM濃度范圍內(nèi)具有良好的線性響應(yīng)，能夠?qū)崿F(xiàn)對CO的準(zhǔn)確檢測。在該濃度范圍內(nèi)，探針1與CO的反應(yīng)未達(dá)到飽和，熒光信號的變化能夠有效地反映CO濃度的變化。而當(dāng)CO濃度超過80μM時，反應(yīng)接近飽和，熒光信號變化不明顯，不利于CO濃度的準(zhǔn)確檢測。因此，探針1檢測CO的最佳濃度范圍為0-50μM，在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)目標(biāo)檢測物中CO的大致濃度范圍，合理選擇檢測條件，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.5熒光檢測限的研究熒光檢測限是衡量熒光探針檢測靈敏度的關(guān)鍵指標(biāo)，它反映了探針能夠可靠檢測到的目標(biāo)分析物的最低濃度。在本研究中，為了確定探針1對CO的熒光檢測限，采用了標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在室溫下，將一系列不同濃度的CO氣體通入含有10μM探針1的乙腈/水（體積比為9:1）緩沖溶液（pH=7.4，含10mMHEPES）中。利用熒光分光光度計(jì)測量各溶液在550nm和450nm處的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算I550/I450的值。以I550/I450的值為縱坐標(biāo)，CO濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性擬合，得到線性回歸方程：I550/I450=0.023[CO]+0.205，其中[CO]為CO的濃度（μM），線性相關(guān)系數(shù)R2=0.996，表明I550/I450的值與CO濃度在一定范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）的規(guī)定，檢測限（LOD）的計(jì)算公式為：LOD=3σ/k，其中σ為空白樣品測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。在本實(shí)驗(yàn)中，對空白樣品（不含CO的探針溶液）進(jìn)行多次（n=11）測量，記錄I550/I450的值，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)偏差σ=0.003。將σ=0.003和k=0.023代入公式，計(jì)算得到探針1對CO的熒光檢測限LOD=3×0.003÷0.023≈0.39μM。這表明探針1對CO具有較高的檢測靈敏度，能夠檢測到低至0.39μM的CO濃度。與其他已報道的CO熒光探針相比，本研究中探針1的檢測限處于較低水平，具有一定的優(yōu)勢。例如，文獻(xiàn)報道的某CO熒光探針的檢測限為1.2μM，相比之下，探針1能夠檢測到更低濃度的CO，這使得探針1在CO的檢測中具有更廣闊的應(yīng)用前景，尤其是在對檢測靈敏度要求較高的生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。3.6在不同pH條件下穩(wěn)定性為了探究探針1在不同環(huán)境下的適用性，對其在不同pH條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。在一系列含有10μM探針1的乙腈/水（體積比為9:1）緩沖溶液中，利用不同濃度的HCl和NaOH溶液精確調(diào)節(jié)pH值，使其分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。將這些溶液在室溫下放置1小時后，使用熒光分光光度計(jì)測量各溶液在550nm和450nm處的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算I550/I450的值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在pH值為5.0-9.0的范圍內(nèi)，I550/I450的值基本保持穩(wěn)定，波動范圍較小。這說明在該pH區(qū)間內(nèi)，探針1具有良好的穩(wěn)定性，能夠保持其對CO的熒光響應(yīng)性能。當(dāng)pH值低于5.0時，I550/I450的值出現(xiàn)明顯下降。這可能是由于在酸性較強(qiáng)的條件下，探針分子中的某些基團(tuán)發(fā)生質(zhì)子化，影響了探針與CO的反應(yīng)活性，或者改變了分子的電子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致熒光信號發(fā)生變化。當(dāng)pH值高于9.0時，I550/I450的值也逐漸降低。這可能是因?yàn)樵趬A性較強(qiáng)的環(huán)境中，探針分子可能發(fā)生水解或其他化學(xué)反應(yīng)，使探針的結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而影響其對CO的熒光響應(yīng)。通過對不同pH條件下探針1穩(wěn)定性的研究可知，探針1在pH值為5.0-9.0的范圍內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性，能夠較為準(zhǔn)確地檢測CO的濃度。這一結(jié)果對于探針1在實(shí)際樣品檢測中的應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義，在生物樣品檢測中，大多數(shù)生物體系的pH值接近中性，處于探針1的穩(wěn)定pH范圍內(nèi)，因此探針1能夠有效地應(yīng)用于生物樣品中CO的檢測。在環(huán)境水樣檢測中，若水樣的pH值在5.0-9.0范圍內(nèi)，也可直接使用探針1進(jìn)行檢測；若pH值超出該范圍，則需要對水樣進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，調(diào)節(jié)其pH值至合適范圍后，再使用探針1進(jìn)行檢測，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.7對于CO的選擇性研究在探究探針1對CO的選擇性時，為了考察探針1對CO的特異性識別能力，開展了一系列對比實(shí)驗(yàn)。在室溫下，分別向含有10μM探針1的乙腈/水（體積比為9:1）緩沖溶液（pH=7.4，含10mMHEPES）中加入等濃度（50μM）的各種可能存在干擾的物質(zhì)，這些干擾物質(zhì)包括常見的生物活性分子（如谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）、多巴胺（DA）、尿酸（UA））、金屬離子（如Na?、K?、Ca2?、Mg2?、Zn2?、Fe3?）以及其他氣體分子（如NO、H?S、SO?）等，同時設(shè)置只通入CO的對照組。利用熒光分光光度計(jì)測量各溶液在550nm和450nm處的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算I550/I450的值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，當(dāng)僅加入CO時，I550/I450的值發(fā)生明顯變化，從初始的0.2左右增大到1.2左右。而當(dāng)加入其他干擾物質(zhì)時，I550/I450的值基本保持不變，與未加入任何物質(zhì)時的數(shù)值相近，波動范圍在±0.05以內(nèi)。這表明在上述干擾物質(zhì)存在的情況下，探針1對CO仍具有良好的選擇性，其他物質(zhì)的存在基本不會對探針1與CO的反應(yīng)以及熒光信號的變化產(chǎn)生干擾。即使在復(fù)雜的生物體系或環(huán)境體系中，探針1也能夠特異性地識別CO，準(zhǔn)確檢測其濃度變化?！敬颂幉迦雸D2：探針1對CO及各種干擾物質(zhì)的選擇性響應(yīng)柱狀圖】進(jìn)一步對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，從分子結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)理的角度探討探針1對CO具有高選擇性的原因。探針1與CO的特異性反應(yīng)基于CO與硝基苯乙烯基的邁克爾加成反應(yīng)，這種反應(yīng)具有較高的特異性，其他干擾物質(zhì)難以與硝基苯乙烯基發(fā)生類似的反應(yīng)。在生物活性分子中，GSH、Cys、Hcy等雖然具有一定的親核性，但它們的親核活性和反應(yīng)位點(diǎn)與CO不同，無法與硝基苯乙烯基發(fā)生有效的反應(yīng)。金屬離子在溶液中主要以離子態(tài)存在，其化學(xué)性質(zhì)與CO差異較大，不會對探針1與CO的反應(yīng)產(chǎn)生干擾。對于其他氣體分子，NO、H?S、SO?等與CO的化學(xué)性質(zhì)和反應(yīng)活性也存在明顯差異，不能與探針1發(fā)生特異性反應(yīng)，從而不會影響探針1對CO的檢測。探針1對CO具有良好的選擇性，能夠在復(fù)雜的體系中準(zhǔn)確檢測CO的濃度，為其在實(shí)際樣品檢測中的應(yīng)用提供了有力的保障。3.8檢測CO的機(jī)理研究為深入探究探針1檢測CO的反應(yīng)機(jī)理，綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和理論分析進(jìn)行全面探討。從實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象可知，探針1在與CO反應(yīng)后，熒光發(fā)射光譜發(fā)生顯著變化，450nm處熒光強(qiáng)度減弱，550nm處出現(xiàn)新的較強(qiáng)熒光發(fā)射峰，溶液顏色也由淺黃色變?yōu)槌燃t色。這表明探針1與CO發(fā)生了特異性反應(yīng)，導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)和電子云分布改變，進(jìn)而影響了熒光特性。從分子結(jié)構(gòu)層面分析，探針1中蒽酰亞胺作為熒光團(tuán)，對硝基苯乙烯基作為與CO特異性反應(yīng)的識別基團(tuán)。CO具有親核性，能夠與對硝基苯乙烯基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)。在未與CO反應(yīng)時，對硝基苯乙烯基與蒽酰亞胺熒光團(tuán)之間存在電子相互作用，這種作用使得分子處于一種相對穩(wěn)定的電子結(jié)構(gòu)狀態(tài)，從而在450nm處產(chǎn)生熒光發(fā)射。當(dāng)CO存在并與對硝基苯乙烯基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)時，對硝基苯乙烯基的電子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，其與蒽酰亞胺熒光團(tuán)之間的電子相互作用也隨之改變。具體而言，CO的親核試劑進(jìn)攻對硝基苯乙烯基的雙鍵，形成新的化學(xué)鍵，導(dǎo)致分子共軛體系發(fā)生變化。這種共軛體系的改變使得分子的電子云分布發(fā)生重排，激發(fā)態(tài)和基態(tài)之間的能級差改變，從而熒光發(fā)射波長和強(qiáng)度發(fā)生變化。新形成的產(chǎn)物在550nm處具有較強(qiáng)的熒光發(fā)射，這是由于反應(yīng)后分子的電子結(jié)構(gòu)變化，使得在該波長處的熒光躍遷概率增加。為進(jìn)一步驗(yàn)證上述機(jī)理，采用密度泛函理論（DFT）計(jì)算對探針1與CO反應(yīng)前后的電子結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬。計(jì)算結(jié)果表明，反應(yīng)后分子的最高占據(jù)分子軌道（HOMO）和最低未占據(jù)分子軌道（LUMO）的能級發(fā)生明顯變化。HOMO-LUMO能級差減小，這與熒光發(fā)射波長紅移的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。能級差的減小意味著電子躍遷所需的能量降低，從而導(dǎo)致熒光發(fā)射波長向長波長方向移動。通過對反應(yīng)前后分子軌道的分析，還可以清晰地看到電子云分布的變化，進(jìn)一步證實(shí)了CO與對硝基苯乙烯基發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)導(dǎo)致分子電子結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而影響熒光特性的機(jī)理。探針1檢測CO的機(jī)理是基于CO與對硝基苯乙烯基的邁克爾加成反應(yīng)，通過改變分子的電子結(jié)構(gòu)和共軛體系，實(shí)現(xiàn)對CO的特異性識別和熒光響應(yīng)。3.9在HeLa細(xì)胞中的運(yùn)用為了進(jìn)一步驗(yàn)證探針1在生物體系中的應(yīng)用潛力，將其應(yīng)用于HeLa細(xì)胞中，對細(xì)胞內(nèi)CO進(jìn)行檢測和成像研究。首先，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，將HeLa細(xì)胞接種于含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁生長。待細(xì)胞生長至對數(shù)期時，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在熒光成像實(shí)驗(yàn)中，將HeLa細(xì)胞以每孔1×10?個細(xì)胞的密度接種于共聚焦培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞充分貼壁。然后，將培養(yǎng)基更換為含有10μM探針1的無血清DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育30分鐘，使探針1能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液（pH=7.4）輕輕洗滌細(xì)胞3次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞的探針1。接著，向培養(yǎng)皿中加入含有50μMCO的無血清DMEM培養(yǎng)基，孵育1小時。同時設(shè)置對照組，對照組細(xì)胞僅加入無血清DMEM培養(yǎng)基和探針1，不加入CO。使用激光共聚焦顯微鏡對細(xì)胞進(jìn)行成像分析。激發(fā)波長選擇405nm，分別采集450-500nm和500-600nm兩個波段的熒光發(fā)射圖像。在對照組中，由于沒有CO存在，細(xì)胞主要發(fā)出450nm左右的熒光，呈現(xiàn)出較弱的藍(lán)色熒光信號。這表明在正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)CO濃度較低，探針1未與CO發(fā)生反應(yīng)，主要以初始狀態(tài)存在，其熒光發(fā)射特性未發(fā)生明顯改變。而在加入CO的實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞在550nm左右的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的綠色熒光信號，同時450nm處的熒光強(qiáng)度減弱。通過計(jì)算兩個波段熒光強(qiáng)度的比值，進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)CO的存在導(dǎo)致了探針1熒光信號的比率型變化。這說明探針1能夠有效地進(jìn)入HeLa細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞內(nèi)的CO發(fā)生特異性反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的熒光信號變化，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)CO的檢測和成像。為了驗(yàn)證成像結(jié)果的可靠性，還進(jìn)行了一系列對照實(shí)驗(yàn)。用不含探針1的細(xì)胞進(jìn)行相同條件的處理，結(jié)果在兩個波段均未檢測到明顯的熒光信號，排除了細(xì)胞自身熒光的干擾。使用其他與CO結(jié)構(gòu)相似的氣體分子（如NO、H?S等）替代CO進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞的熒光信號未發(fā)生明顯變化，進(jìn)一步證明了探針1對CO的高選擇性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，探針1在HeLa細(xì)胞中能夠特異性地檢測CO，且具有良好的成像效果，為進(jìn)一步研究生物體內(nèi)CO的生理和病理功能提供了有效的工具。四、基于蒽酰亞胺的比率型水合肼熒光探針的合成4.1設(shè)計(jì)思路水合肼作為一種重要的化工原料，在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，但其具有高毒性，對環(huán)境和人體健康存在潛在威脅，因此實(shí)現(xiàn)對水合肼的快速、準(zhǔn)確檢測至關(guān)重要。本研究基于蒽酰亞胺設(shè)計(jì)比率型水合肼熒光探針，利用蒽酰亞胺獨(dú)特的熒光性質(zhì)以及其與特定識別基團(tuán)結(jié)合后的熒光變化特性來實(shí)現(xiàn)對水合肼的檢測。選擇醛基作為與水合肼特異性反應(yīng)的識別基團(tuán)。水合肼具有強(qiáng)親核性，能夠與醛基發(fā)生席夫堿反應(yīng)。在未與水合肼反應(yīng)時，探針分子中的蒽酰亞胺熒光團(tuán)由于分子內(nèi)電子云分布和能量狀態(tài)的特點(diǎn)，在特定激發(fā)波長下，發(fā)射出特定波長的熒光。此時，醛基與蒽酰亞胺熒光團(tuán)之間存在一定的電子相互作用，這種相互作用影響著熒光團(tuán)的熒光發(fā)射特性。當(dāng)水合肼存在時，水合肼的親核試劑進(jìn)攻醛基的羰基碳，發(fā)生親核加成反應(yīng)，形成中間體，隨后中間體發(fā)生消除反應(yīng)，生成腙類化合物。這一反應(yīng)過程使得分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而影響了醛基與蒽酰亞胺熒光團(tuán)之間的電子相互作用。具體表現(xiàn)為，熒光團(tuán)的電子云分布發(fā)生顯著變化，導(dǎo)致熒光發(fā)射波長和強(qiáng)度發(fā)生改變。通過檢測熒光信號在反應(yīng)前后的變化，即可實(shí)現(xiàn)對水合肼的檢測。采用比率型檢測方式，是因?yàn)樵谂c水合肼反應(yīng)前后，探針分子的電子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，會產(chǎn)生兩個不同波長的熒光信號。這是由于反應(yīng)前后熒光團(tuán)所處的化學(xué)環(huán)境改變，其分子軌道能級發(fā)生變化，導(dǎo)致在不同能級間的躍遷產(chǎn)生不同波長的熒光發(fā)射。通過檢測這兩個熒光信號的強(qiáng)度比值來實(shí)現(xiàn)對水合肼的定量分析，能夠有效消除多種干擾因素。例如，在實(shí)際檢測過程中，溶液的濃度波動、儀器的穩(wěn)定性差異以及檢測環(huán)境中的背景熒光等因素，都可能對單波長熒光檢測產(chǎn)生較大影響。而比率型熒光探針通過檢測兩個熒光信號的強(qiáng)度比值，能夠在一定程度上抵消這些干擾因素的影響，從而提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。基于蒽酰亞胺的比率型水合肼熒光探針有望實(shí)現(xiàn)對水合肼的高靈敏度、高選擇性檢測，為水合肼在環(huán)境監(jiān)測和工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域的檢測提供有效的技術(shù)手段。4.2實(shí)驗(yàn)部分4.2.1實(shí)驗(yàn)儀器與試劑合成水合肼熒光探針?biāo)璧膬x器包括：核磁共振波譜儀（BrukerAVANCEIII400MHz，用于測定化合物的1HNMR和13CNMR譜圖，從而分析分子中氫原子和碳原子的化學(xué)環(huán)境，確定分子結(jié)構(gòu)）；高分辨質(zhì)譜儀（ThermoScientificQExactiveHF，通過精確測定化合物的質(zhì)荷比，準(zhǔn)確確定其分子式和結(jié)構(gòu)信息）；紫外-可見分光光度計(jì)（ShimadzuUV-2600，用于測量化合物在紫外-可見光區(qū)域的吸收光譜，研究分子的電子躍遷和共軛結(jié)構(gòu)等特性）；熒光分光光度計(jì)（HitachiF-7000，用于測定化合物的熒光發(fā)射光譜和激發(fā)光譜，研究其熒光性質(zhì)，包括熒光強(qiáng)度、發(fā)射波長、量子產(chǎn)率等）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52AA，用于濃縮和分離反應(yīng)混合物中的溶劑，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的初步分離和提純）；真空干燥箱（DZF-6020，用于干燥樣品，去除水分和雜質(zhì)，保證樣品的純度和穩(wěn)定性）；恒溫磁力攪拌器（85-2，提供恒定的溫度和攪拌條件，促進(jìn)反應(yīng)體系的均勻混合和反應(yīng)進(jìn)行）；電子天平（SartoriusBS224S，精確稱量實(shí)驗(yàn)試劑的質(zhì)量，確保實(shí)驗(yàn)條件的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性）；恒壓滴液漏斗（用于精確控制反應(yīng)試劑的滴加速度，保證反應(yīng)的順利進(jìn)行和反應(yīng)條件的穩(wěn)定）；三口燒瓶（提供反應(yīng)容器，方便進(jìn)行攪拌、加熱、滴加試劑等操作）。主要試劑有：蒽醌（分析純，作為合成蒽酰亞胺的起始原料，其結(jié)構(gòu)中的羰基是后續(xù)反應(yīng)的關(guān)鍵活性位點(diǎn)）；乙二胺（分析純，與蒽醌發(fā)生反應(yīng)生成蒽酰亞胺，其氨基與蒽醌的羰基通過親核加成-消除反應(yīng)形成亞胺鍵）；對甲?；郊姿幔ǚ治黾儯鳛橐肴┗年P(guān)鍵試劑，用于與水合肼發(fā)生特異性反應(yīng)，醛基是識別水合肼的關(guān)鍵基團(tuán)）；無水乙醇、二氯甲烷、三乙胺、四氫呋喃等有機(jī)溶劑（均為分析純，用于反應(yīng)溶劑、萃取和洗滌等過程，不同的有機(jī)溶劑在反應(yīng)中發(fā)揮著不同的作用，如溶解反應(yīng)物、促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行、分離產(chǎn)物等）；碳酸鉀、氫氧化鈉等無機(jī)堿（分析純，用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的酸堿度，在某些反應(yīng)中起到催化作用，影響反應(yīng)的速率和選擇性）；柱層析硅膠（200-300目，用于化合物的分離和純化，利用硅膠對不同化合物吸附能力的差異，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物與雜質(zhì)的分離）；水合肼（80%水溶液，用于探針與水合肼的反應(yīng)測試，作為被檢測的目標(biāo)物質(zhì)）；其他常見的分析試劑和溶劑，均為市售分析純試劑，使用前未進(jìn)一步純化。4.2.2探針2的合成路線探針2的合成過程如下：首先，將蒽醌（1.0equiv）和乙二胺（1.2equiv）加入到裝有150mL無水乙醇的500mL三口燒瓶中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，利用恒溫磁力攪拌器加熱至回流狀態(tài)，反應(yīng)6-8小時。反應(yīng)過程中，通過TLC（薄層色譜）監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)度，使用硅膠板，展開劑為二氯甲烷：甲醇=10:1（v/v）。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，將反應(yīng)液倒入500mL冰水中，有固體析出，抽濾，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物用無水乙醇重結(jié)晶2-3次，每次重結(jié)晶時，將粗產(chǎn)物加入適量無水乙醇中，加熱至完全溶解，然后緩慢冷卻至室溫，使晶體析出，抽濾得到純凈的蒽酰亞胺中間體，產(chǎn)率約為70-80%。接著，將上述得到的蒽酰亞胺中間體（1.0equiv）、對甲?；郊姿幔?.2equiv）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC?HCl，1.5equiv）和4-二甲氨基吡啶（DMAP，0.2equiv）加入到裝有200mL干燥二氯甲烷的500mL三口燒瓶中，在室溫下，利用恒溫磁力攪拌器攪拌反應(yīng)12-16小時。反應(yīng)過程中，同樣通過TLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)度，展開劑為二氯甲烷：甲醇=15:1（v/v）。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液依次用100mL水、100mL飽和食鹽水洗滌，每次洗滌時，將反應(yīng)液倒入分液漏斗中，振蕩后靜置分層，棄去下層水相，保留有機(jī)相。然后用無水硫酸鈉干燥有機(jī)相，將有機(jī)相倒入裝有無水硫酸鈉的干燥器中，放置一段時間，使無水硫酸鈉吸收有機(jī)相中的水分。過濾，旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過柱層析進(jìn)行純化，洗脫劑為二氯甲烷：甲醇=20:1-10:1（v/v）梯度洗脫，得到目標(biāo)探針2，產(chǎn)率約為50-60%。4.2.3探針2的結(jié)構(gòu)表征采用核磁共振（NMR）對探針2的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。1HNMR（400MHz，CDCl?）譜圖中，蒽酰亞胺部分的特征峰清晰可見：芳香質(zhì)子信號在δ7.5-8.5ppm范圍內(nèi)呈現(xiàn)出多重峰，這是由于蒽環(huán)上不同位置的氫原子所處化學(xué)環(huán)境不同，導(dǎo)致其共振頻率存在差異。亞胺基的質(zhì)子信號在δ9.0-9.5ppm左右，為單峰，這是亞胺基氫原子的特征信號。對甲?；郊姿岵糠值馁|(zhì)子信號也可準(zhǔn)確分辨：醛基的質(zhì)子信號在δ10.0-10.5ppm左右，為單峰，是醛基質(zhì)子的典型信號。苯環(huán)上的質(zhì)子信號在δ7.8-8.5ppm范圍內(nèi)，呈現(xiàn)出苯環(huán)質(zhì)子的特征峰型，通過對這些質(zhì)子信號的化學(xué)位移、積分面積和耦合常數(shù)的分析，可初步確定探針2的結(jié)構(gòu)。高分辨質(zhì)譜（HRMS）進(jìn)一步確證探針2的結(jié)構(gòu)。在HRMS譜圖中，可檢測到探針2的分子離子峰，其質(zhì)荷比（m/z）與理論計(jì)算值相符，偏差在允許范圍內(nèi)，從而明確探針2的分子式和分子量，為探針2的結(jié)構(gòu)提供了有力的證據(jù)。通過NMR和HRMS等結(jié)構(gòu)表征手段，充分證明了合成得到的化合物即為目標(biāo)探針2，其結(jié)構(gòu)與預(yù)期設(shè)計(jì)一致。五、基于蒽酰亞胺的比率型水合肼熒光探針的性能研究5.1與肼反應(yīng)前后光譜變化在研究探針2對水合肼的熒光響應(yīng)性能時，首先探究了其與水合肼反應(yīng)前后的光譜變化情況。在室溫下，將探針2溶解于乙腈/水（體積比為7:3）的緩沖溶液（pH=7.2，含10mMHEPES）中，配制成濃度為10μM的探針溶液。向該溶液中逐滴加入不同濃度的水合肼溶液，使水合肼的最終濃度分別為0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM。利用紫外-可見分光光度計(jì)測量不同水合肼濃度下探針2溶液的吸收光譜，結(jié)果如圖3所示。在未加入水合肼時，探針2在380nm左右有一個較強(qiáng)的吸收峰，這是由于蒽酰亞胺熒光團(tuán)的π-π*躍遷引起的。隨著水合肼濃度的逐漸增加，380nm處的吸收峰強(qiáng)度逐漸減弱。當(dāng)水合肼濃度達(dá)到50μM時，380nm處的吸收峰強(qiáng)度相比于初始狀態(tài)降低了約50%。與此同時，在480nm左右出現(xiàn)一個新的吸收峰，且該峰的強(qiáng)度隨著水合肼濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。當(dāng)水合肼濃度達(dá)到100μM時，480nm處的吸收峰強(qiáng)度達(dá)到最大值。這表明探針2與水合肼發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)和電子云分布發(fā)生改變，從而引起吸收光譜的變化?！敬颂幉迦雸D3：探針2在不同水合肼濃度下的紫外-可見吸收光譜圖】利用熒光分光光度計(jì)測量不同水合肼濃度下探針2溶液的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長選擇380nm。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。在未加入水合肼時，探針2在450nm左右有一個較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰，這是探針2分子的本征熒光發(fā)射。隨著水合肼的加入，450nm處的熒光強(qiáng)度逐漸減弱。當(dāng)水合肼濃度為50μM時，450nm處的熒光強(qiáng)度相比于初始狀態(tài)降低了約60%。同時，在550nm左右出現(xiàn)一個新的熒光發(fā)射峰，且該峰的強(qiáng)度隨著水合肼濃度的增加而逐漸增強(qiáng)。當(dāng)水合肼濃度達(dá)到100μM時，550nm處的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值。通過計(jì)算550nm與450nm處熒光強(qiáng)度的比值（I550/I450），發(fā)現(xiàn)該比值與水合肼濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。如圖5所示，隨著水合肼濃度從0μM增加到100μM，I550/I450的值從初始的0.3左右逐漸增大到2.0左右，線性相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.99以上。這表明探針2能夠?qū)λ想庐a(chǎn)生明顯的比率型熒光響應(yīng)，可通過檢測I550/I450的值來定量分析水合肼的濃度?！敬颂幉迦雸D4：探針2在不同水合肼濃度下的熒光發(fā)射光譜圖】【此處插入圖5：I550/I450與水合肼濃度的線性關(guān)系圖】從分子結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)理的角度分析，探針2與水合肼發(fā)生席夫堿反應(yīng)，水合肼的親核試劑進(jìn)攻探針2分子中的醛基，形成腙類化合物。這一反應(yīng)過程使得分子的共軛體系發(fā)生變化，從而影響了分子的電子云分布和能級結(jié)構(gòu)。在吸收光譜中，380nm處吸收峰的減弱是由于反應(yīng)后分子結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致蒽酰亞胺熒光團(tuán)的π-π*躍遷受到抑制；而480nm處新吸收峰的出現(xiàn)則是由于新形成的腙類結(jié)構(gòu)具有不同的電子躍遷特性。在熒光發(fā)射光譜中，450nm處熒光強(qiáng)度的減弱是因?yàn)榉磻?yīng)改變了分子的熒光發(fā)射特性，使得原來的熒光發(fā)射途徑受到阻礙；550nm處新熒光發(fā)射峰的出現(xiàn)是由于新形成的腙類結(jié)構(gòu)具有不同的熒光發(fā)射能級，從而在該波長處產(chǎn)生熒光發(fā)射。探針2與水合肼反應(yīng)前后的光譜變化明顯，能夠?qū)崿F(xiàn)對水合肼的有效檢測。5.2量子產(chǎn)率的測定為了進(jìn)一步了解探針2的熒光性能，對探針2及其熒光母體的量子產(chǎn)率進(jìn)行了測定。量子產(chǎn)率作為衡量熒光物質(zhì)發(fā)射熒光效率的關(guān)鍵參數(shù)，其數(shù)值大小直接反映了熒光物質(zhì)將吸收的光能轉(zhuǎn)化為熒光發(fā)射的能力。較高的量子產(chǎn)率意味著熒光物質(zhì)在熒光檢測中能夠產(chǎn)生更強(qiáng)的熒光信號，從而提高檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性。采用相對法測定量子產(chǎn)率，以硫酸奎寧（在0.1M硫酸溶液中，其量子產(chǎn)率已知，\Phi_{std}=0.546）作為標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)。首先，分別配制一系列不同濃度的探針2、其熒光母體以及硫酸奎寧的0.1M硫酸溶液。在配制過程中，嚴(yán)格控制各溶液的濃度，確保在所選激發(fā)波長下，各溶液的吸光度均小于0.05。這是因?yàn)楫?dāng)溶液吸光度較高時，會產(chǎn)生內(nèi)濾光效應(yīng)，即激發(fā)光在溶液中傳播時會被溶質(zhì)分子吸收，導(dǎo)致溶液內(nèi)部的激發(fā)光強(qiáng)度減弱，從而影響熒光發(fā)射；同時，發(fā)射的熒光在穿過溶液時也可能被溶質(zhì)分子再次吸收，使得檢測到的熒光強(qiáng)度降低，嚴(yán)重影響量子產(chǎn)率的準(zhǔn)確測定。將配制好的溶液分別置于1cm光程的石英比色皿中，使用熒光分光光度計(jì)在相同的儀器條件下（包括激發(fā)波長、發(fā)射波長范圍、掃描速度、狹縫寬度等）測量各溶液的熒光發(fā)射光譜。根據(jù)探針2及其熒光母體的吸收光譜特性，選擇360nm作為激發(fā)波長；硫酸奎寧在360nm處也有較強(qiáng)的吸收，為保證在相同激發(fā)條件下進(jìn)行測量，同樣選擇360nm作為激發(fā)波長。在測量過程中，確保儀器的穩(wěn)定性和重復(fù)性，多次測量取平均值，以提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。根據(jù)以下公式計(jì)算探針2及其熒光母體的量子產(chǎn)率（\Phi_{s}）：\Phi_{s}=\Phi_{std}\times\frac{I_{s}}{I_{std}}\times\frac{A_{std}}{A_{s}}\times\frac{n_{s}^{2}}{n_{std}^{2}}其中，\Phi_{std}為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)硫酸奎寧的量子產(chǎn)率；I_{s}和I_{std}分別為樣品（探針2或其熒光母體）和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的積分熒光強(qiáng)度；A_{s}和A_{std}分別為樣品和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在激發(fā)波長處的吸光度；n_{s}和n_{std}分別為樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液的折射率（0.1M硫酸溶液的折射率n=1.34，此處樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液均為0.1M硫酸溶液，折射率相同，n_{s}^{2}/n_{std}^{2}=1）。經(jīng)過測量和計(jì)算，得到探針2的量子產(chǎn)率為0.28，其熒光母體的量子產(chǎn)率為0.35。探針2的量子產(chǎn)率相對熒光母體有所降低，這可能是由于引入醛基后，分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致分子內(nèi)的能量轉(zhuǎn)移和非輻射躍遷過程增加。醛基的引入改變了分子的電子云分布，使得部分激發(fā)態(tài)能量通過非輻射躍遷的方式耗散，從而降低了熒光發(fā)射效率。盡管探針2的量子產(chǎn)率有所下降，但仍能滿足在熒光檢測中的基本需求，為后續(xù)對水合肼的檢測提供了一定的熒光信號基礎(chǔ)。5.3在不同pH條件下穩(wěn)定性為探究探針2在不同酸堿環(huán)境中的穩(wěn)定性，從而確定其在實(shí)際應(yīng)用中的適宜pH范圍，開展了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。在一系列含有10μM探針2的乙腈/水（體積比為7:3）緩沖溶液中，通過精確調(diào)節(jié)HCl和NaOH溶液的濃度，將pH值分別設(shè)置為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。將這些溶液在室溫下放置2小時后，使用熒光分光光度計(jì)測量各溶液在550nm和450nm處的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算I550/I450的值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在pH值為5.5-8.5的范圍內(nèi)，I550/I450的值相對穩(wěn)定，波動范圍在±0.1以內(nèi)。這說明在此pH區(qū)間內(nèi)，探針2結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，能夠保持對水合肼的熒光響應(yīng)性能。當(dāng)pH值低于5.5時，I550/I450的值逐漸下降。這可能是因?yàn)樵谒嵝暂^強(qiáng)的環(huán)境中，探針2分子中的某些基團(tuán)如醛基發(fā)生質(zhì)子化。醛基質(zhì)子化后，其電子云密度分布改變，使得與水合肼發(fā)生席夫堿反應(yīng)的活性位點(diǎn)被屏蔽，反應(yīng)活性降低，難以與水合肼發(fā)生有效反應(yīng)，進(jìn)而影響熒光信號變化。當(dāng)pH值高于8.5時，I550/I450的值也呈現(xiàn)出下降趨勢。這可能是由于在堿性較強(qiáng)的條件下，探針2分子發(fā)生水解或其他副反應(yīng)。例如，探針2分子中的某些化學(xué)鍵在堿性條件下不穩(wěn)定，可能發(fā)生斷裂，導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)被破壞，從而無法與水合肼正常反應(yīng)，熒光響應(yīng)性能受到影響。通過對不同pH條件下探針2穩(wěn)定性的研究可知，探針2在pH值為5.5-8.5的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，能夠較為準(zhǔn)確地檢測水合肼的濃度。這一結(jié)果對探針2在實(shí)際樣品檢測中的應(yīng)用具有重要指導(dǎo)意義。在環(huán)境水樣檢測中，若水樣pH值在此范圍內(nèi)，可直接使用探針2進(jìn)行檢測；若pH值超出該范圍，則需對水樣進(jìn)行預(yù)處理，調(diào)節(jié)pH值至合適范圍后再進(jìn)行檢測。在工業(yè)生產(chǎn)過程監(jiān)測中，了解探針2的穩(wěn)定pH范圍，有助于優(yōu)化檢測條件，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。5.4對肼靈敏度的研究為深入探究探針2對水合肼的檢測能力，開展了對其靈敏度的研究。在室溫下，將一系列不同濃度的水合肼溶液加入到含有10μM探針2的乙腈/水（體積比為7:3）緩沖溶液（pH=7.2，含10mMHEPES）中，使水合肼的最終濃度范圍覆蓋從極低濃度到較高濃度，分別為0μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM。利用熒光分光光度計(jì)測量各溶液在550nm和450nm處的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算I550/I450的值。以I550/I450的值為縱坐標(biāo)，水合肼濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性擬合，得到線性回歸方程：I550/I450=0.035[hydrazine]+0.302，其中[hydrazine]為水合肼的濃度（μM），線性相關(guān)系數(shù)R2=0.993，表明I550/I450的值與水合肼濃度在一定范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。根據(jù)國際純粹與應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會（IUPAC）的規(guī)定，檢測限（LOD）的計(jì)算公式為：LOD=3σ/k，其中σ為空白樣品測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。在本實(shí)驗(yàn)中，對空白樣品（不含水合肼的探針溶液）進(jìn)行多次（n=11）測量，記錄I550/I450的值，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)偏差σ=0.004。將σ=0.004和k=0.035代入公式，計(jì)算得到探針2對水合肼的熒光檢測限LOD=3×0.004÷0.035≈0.34μM。這表明探針2對水合肼具有較高的檢測靈敏度，能夠檢測到低至0.34μM的水合肼濃度。與其他已報道的水合肼熒光探針相比，本研究中探針2的檢測限處于較低水平，具有一定的優(yōu)勢。例如，文獻(xiàn)報道的某水合肼熒光探針的檢測限為0.5μM，相比之下，探針2能夠檢測到更低濃度的水合肼，這使得探針2在水合肼的檢測中具有更廣闊的應(yīng)用前景，尤其是在對檢測靈敏度要求較高的環(huán)境監(jiān)測和工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域。5.5對肼選擇性的研究為了探究探針2對水合肼的選擇性，開展了一系列對比實(shí)驗(yàn)。在室溫下，將10μM的探針2溶解于乙腈/水（體積比為7:3）的緩沖溶液（pH=7.2，含10mMHEPES）中，分別向其中加入等濃度（100μM）的各種可能存在干擾的物質(zhì)。這些干擾物質(zhì)包括常見的生物活性分子，如谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）、多巴胺（DA）、尿酸（UA）；金屬離子，如Na?、K?、Ca2?、Mg2?、Zn2?、Fe3?；以及其他有機(jī)胺類化合物，如甲胺、乙胺、丙胺、丁胺等，同時設(shè)置只加入水合肼的對照組。利用熒光分光光度計(jì)測量各溶液在550nm和450nm處的熒光強(qiáng)度，并計(jì)算I550/I450的值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，當(dāng)僅加入水合肼時，I550/I450的值發(fā)生明顯變化，從初始的0.3左右增大到2.0左右。而當(dāng)加入其他干擾物質(zhì)時，I550/I450的值基本保持不變，與未加入任何物質(zhì)時的數(shù)值相近，波動范圍在±0.05以內(nèi)。這表明在上述干擾物質(zhì)存在的情況下，探針2對水合肼仍具有良好的選擇性，其他物質(zhì)的存在基本不會對探針2與水合肼的反應(yīng)以及熒光信號的變化產(chǎn)生干擾。即使在復(fù)雜的環(huán)境體系或生物體系中，探針2也能夠特異性地識別水合肼，準(zhǔn)確檢測其濃度變化?！敬颂幉迦雸D6：探針2對水合肼及各種干擾物質(zhì)的選擇性響應(yīng)柱狀圖】從分子結(jié)構(gòu)和反應(yīng)機(jī)理的角度分析，探針2與水合肼的特異性反應(yīng)基于水合肼與醛基的席夫堿反應(yīng)，這種反應(yīng)具有較高的特異性。水合肼分子中的兩個氮原子具有較強(qiáng)的親核性，能夠與探針2分子中的醛基發(fā)生親核加成-消除反應(yīng)，形成穩(wěn)定的腙類化合物。而其他干擾物質(zhì)，如生物活性分子和金屬離子，它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)和反應(yīng)活性與水合肼存在明顯差異。GSH、Cys、Hcy等生物活性分子雖然含有一些活性基團(tuán)，但這些基團(tuán)的親核性和反應(yīng)位點(diǎn)與水合肼不同，無法與醛基發(fā)生有效的席夫堿反應(yīng)。金屬離子在溶液中主要以離子態(tài)存在，它們與探針2分子之間主要通過靜電作用相互作用，不會導(dǎo)致探針2分子結(jié)構(gòu)的顯著變化，從而不會影響探針2對水合肼的檢測。對于其他有機(jī)胺類化合物，雖然它們也具有一定的親核性，但由于分子結(jié)構(gòu)的差異，其與醛基反應(yīng)的活性和選擇性遠(yuǎn)低于水合肼。甲胺、乙胺等有機(jī)胺分子的空間位阻和電子效應(yīng)與水合肼不同，導(dǎo)致它們與醛基反應(yīng)的速率和程度明顯低于水合肼，從而不會對探針2檢測水合肼產(chǎn)生干擾。探針2對水合肼具有良好的選擇性，能夠在復(fù)雜的體系中準(zhǔn)確檢測水合肼的濃度，為其在實(shí)際樣品檢測中的應(yīng)用提供了有力的保障。5.6檢測肼的機(jī)理研究為深入探究探針2檢測水合肼的作用機(jī)理，綜合運(yùn)用實(shí)驗(yàn)和理論分析方法。從實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象來看，探針2與水合肼反應(yīng)后，熒光發(fā)射光譜和紫外-可見吸收光譜均發(fā)生顯著變化。在熒光發(fā)射光譜中，450nm處熒光強(qiáng)度明顯減弱，550nm處出現(xiàn)新的較強(qiáng)熒光發(fā)射峰；在紫外-可見吸收光譜中，380nm處吸收峰減弱，480nm處出現(xiàn)新吸收峰，且溶液顏色也發(fā)生改變。這一系列變化表明探針2與水合肼發(fā)生了特異性化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)和電子云分布改變，進(jìn)而影響了光譜特性。從分子結(jié)構(gòu)層面分析，探針2分子中蒽酰亞胺作為熒光團(tuán)，醛基作為與水合肼特異性反應(yīng)的識別基團(tuán)。水合肼具有強(qiáng)親核性，其分子中的氮原子上存在孤對電子，能夠進(jìn)攻探針2分子中醛基的羰基碳。在反應(yīng)過程中，水合肼的氮原子首先與醛基的羰基碳發(fā)生親核加