基于蛋白質(zhì)組學(xué)解析水稻條紋病毒脅迫下抗感品種的分子防御機(jī)制一、引言1.1研究背景與意義水稻作為全球最重要的糧食作物之一，為世界上超過半數(shù)人口提供主食，在保障全球糧食安全中扮演著不可或缺的角色。然而，水稻生長(zhǎng)過程中面臨著眾多生物和非生物脅迫，其中水稻條紋病毒（Ricestripevirus，RSV）引發(fā)的水稻條紋葉枯病是影響水稻生產(chǎn)的重要病害之一。水稻條紋葉枯病最早于1897年在日本被發(fā)現(xiàn)，在我國(guó)，1963年蘇南地區(qū)首次出現(xiàn)，此后迅速擴(kuò)散至18個(gè)省市。近年來，江蘇、河南等地頻繁爆發(fā)水稻條紋葉枯病，給當(dāng)?shù)厮旧a(chǎn)帶來巨大損失。例如，2001年和2004年，江蘇、河南等地該病大規(guī)模流行，病田率分別達(dá)50%以上和75%以上，且自2004年起持續(xù)流行，嚴(yán)重威脅水稻生產(chǎn)。RSV主要由介體灰飛虱（Laodelphaxstriatellus）以循回增殖的方式傳播，灰飛虱一旦染毒，便可持續(xù)傳毒，甚至能經(jīng)卵傳遞給下一代幼蟲，這使得防治工作極具挑戰(zhàn)性。感染RSV的水稻在發(fā)病初期，病株心葉沿葉脈呈現(xiàn)斷續(xù)的黃綠色或黃白色短條斑，隨后常連成片，導(dǎo)致葉片一半甚至大半變?yōu)辄S白色。早期發(fā)病植株多枯死，發(fā)病較遲的則在劍葉或葉鞘上出現(xiàn)褪色斑，抽穗不良或穗畸形不實(shí)，病株分蘗通常減少。面對(duì)RSV的嚴(yán)重威脅，深入研究其致病機(jī)制以及水稻的抗病機(jī)制至關(guān)重要。蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，在植物與病毒互作過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過對(duì)水稻在RSV脅迫下抗感品種的蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究，能夠從分子層面揭示水稻對(duì)RSV的抗性機(jī)制以及感病品種發(fā)病的分子基礎(chǔ)。一方面，在抗性機(jī)制研究中，抗RSV品種在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成了一系列復(fù)雜的防御體系。研究其蛋白質(zhì)組變化有助于明確這些防御體系中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，比如參與植物免疫反應(yīng)的相關(guān)蛋白，像模式識(shí)別受體（PRRs），它能夠識(shí)別RSV的病原相關(guān)分子模式（PAMPs），激活下游的免疫信號(hào)通路，啟動(dòng)植物的防御反應(yīng)；還有絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)相關(guān)蛋白，在信號(hào)傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，將外界刺激信號(hào)傳遞并放大，調(diào)節(jié)植物的生理生化反應(yīng)以抵抗病毒入侵。明確這些關(guān)鍵蛋白，能夠?yàn)榕嘤呖顾酒贩N提供精準(zhǔn)的分子靶點(diǎn)，從而顯著提高水稻的抗病能力，減少病害損失。另一方面，感病品種發(fā)病的分子基礎(chǔ)研究也不容忽視。感病品種在RSV侵染下，蛋白質(zhì)組的變化反映了其防御機(jī)制的缺陷以及病毒對(duì)其正常生理過程的干擾。例如，病毒可能干擾感病品種中與光合作用相關(guān)蛋白的表達(dá)或功能，如捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白，影響光合作用的正常進(jìn)行，進(jìn)而削弱植株的生長(zhǎng)和發(fā)育；還可能干擾與植物激素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)蛋白，像生長(zhǎng)素、水楊酸等激素信號(hào)途徑中的關(guān)鍵蛋白，破壞植物自身的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和防御反應(yīng)平衡。通過對(duì)這些變化的研究，能夠深入了解RSV的致病機(jī)制，為制定針對(duì)性的防治策略提供科學(xué)依據(jù)，如開發(fā)新型抗病毒藥劑或優(yōu)化栽培管理措施，以降低病害發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。綜上所述，研究RSV脅迫下水稻抗感品種的差異蛋白質(zhì)組，對(duì)于深入理解水稻與RSV的互作機(jī)制、培育抗病水稻品種以及制定有效的病害防治策略具有重要的理論和實(shí)踐意義，在保障水稻產(chǎn)量和質(zhì)量，維護(hù)全球糧食安全方面具有不可替代的價(jià)值。1.2水稻條紋葉枯病概述1.2.1發(fā)生與危害水稻條紋葉枯病是一種對(duì)水稻生產(chǎn)極具威脅的病毒性病害，在全球范圍內(nèi)，主要集中在亞洲的水稻種植區(qū)域廣泛分布。在日本，自1897年首次發(fā)現(xiàn)以來，該病一直是水稻種植中的重點(diǎn)防控對(duì)象；在韓國(guó)，水稻條紋葉枯病也時(shí)有發(fā)生，給當(dāng)?shù)厮井a(chǎn)業(yè)帶來一定損失。在中國(guó)，1963年蘇南地區(qū)首次出現(xiàn)水稻條紋葉枯病，隨后迅速擴(kuò)散至18個(gè)省市。近年來，江蘇、河南等地頻繁爆發(fā)水稻條紋葉枯病，給當(dāng)?shù)厮旧a(chǎn)帶來巨大損失。例如，2001年和2004年，江蘇、河南等地該病大規(guī)模流行，病田率分別達(dá)50%以上和75%以上，且自2004年起持續(xù)流行，嚴(yán)重威脅水稻生產(chǎn)。水稻條紋葉枯病的爆發(fā)會(huì)導(dǎo)致水稻產(chǎn)量大幅下降，嚴(yán)重時(shí)甚至絕收。感病水稻在發(fā)病初期，病株心葉沿葉脈呈現(xiàn)斷續(xù)的黃綠色或黃白色短條斑，隨后常連成片，導(dǎo)致葉片一半甚至大半變?yōu)辄S白色。早期發(fā)病植株多枯死，發(fā)病較遲的則在劍葉或葉鞘上出現(xiàn)褪色斑，抽穗不良或穗畸形不實(shí)，病株分蘗通常減少。這不僅直接影響水稻的產(chǎn)量，還會(huì)降低稻米的品質(zhì)，如導(dǎo)致米粒變小、堊白度增加、淀粉含量改變等，進(jìn)而影響其市場(chǎng)價(jià)值和食用口感。同時(shí)，為了防治水稻條紋葉枯病，農(nóng)民往往需要投入大量的人力、物力和財(cái)力，增加了生產(chǎn)成本，進(jìn)一步影響了農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)效益。1.2.2病原及傳播水稻條紋葉枯病的病原為水稻條紋病毒（Ricestripevirus，RSV），隸屬于纖細(xì)病毒屬（Tenuivirus），是該屬的典型成員。RSV的粒子呈絲狀，大小約為400×8nm，分散于細(xì)胞質(zhì)、液泡和核內(nèi)，或成顆粒狀、砂狀等不定形集塊，即內(nèi)含體，似有許多絲狀體糾纏而成團(tuán)。其基因組由4條單鏈RNA（RNA1-RNA4）組成，共編碼7種蛋白質(zhì)。其中，RNA1采取負(fù)鏈編碼策略，其互補(bǔ)鏈（vcRNA1）編碼病毒的RNA聚合酶（RdRp），該酶在病毒的復(fù)制過程中起著關(guān)鍵作用，負(fù)責(zé)以病毒RNA為模板合成新的病毒核酸；RNA2-RNA4均采取雙義編碼策略，即在RNA的毒義鏈（vRNA）和毒義互補(bǔ)鏈（vcRNA）的靠近5′端處各有一個(gè)開放閱讀框（openreadingframe，ORF），都可以編碼蛋白質(zhì)。例如，RNA2正鏈編碼一非結(jié)構(gòu)蛋白NS2，目前NS2的功能還未知，而vcRNA2編碼的NSvc2蛋白分子量為94kDa，在病株和灰飛虱中均可檢測(cè)到，暗示其可能在介導(dǎo)病毒傳播及誘導(dǎo)宿主植物癥狀的發(fā)生中起作用。RSV主要通過介體灰飛虱（Laodelphaxstriatellus）以循回增殖的方式傳播?；绎w虱一旦獲毒，便可持續(xù)傳毒，甚至能經(jīng)卵傳遞給下一代幼蟲，這使得病毒的傳播范圍不斷擴(kuò)大，防治難度極大?；绎w虱最短吸毒時(shí)間僅需10分鐘，循回期為4-23天，一般為10-15天。在這個(gè)過程中，病毒在灰飛虱體內(nèi)經(jīng)歷復(fù)雜的增殖和循回過程。當(dāng)灰飛虱吸食感染RSV的水稻植株汁液時(shí)，病毒粒子通過口針進(jìn)入灰飛虱體內(nèi)，隨后穿過腸道屏障進(jìn)入血淋巴，再感染唾液腺等組織器官，最終在唾液腺中大量增殖后，通過灰飛虱再次取食健康水稻植株時(shí)，隨唾液注入水稻體內(nèi)，完成病毒的傳播過程。除灰飛虱外，白脊飛虱在自然界雖也可傳毒，但作用相對(duì)較小。RSV除了侵染水稻外，還能侵染禾本科的小麥、大麥、燕麥、玉米、粟、黍、看麥娘、狗尾草等50多種植物，但在侵染循環(huán)中，除水稻外，其它寄主的作用相對(duì)不大。1.2.3癥狀表現(xiàn)水稻在不同生長(zhǎng)階段感染RSV會(huì)表現(xiàn)出不同的典型癥狀。苗期發(fā)病時(shí)，心葉基部首先出現(xiàn)褪綠黃白斑，隨后逐漸擴(kuò)展成與葉脈平行的黃色條紋，條紋間仍保持綠色。不同水稻品種在苗期的癥狀表現(xiàn)存在差異，糯稻、粳稻和高稈秈稻的心葉會(huì)呈現(xiàn)黃白色，質(zhì)地柔軟，卷曲下垂，最終形成枯心狀；而矮稈秈稻則不呈枯心狀，而是出現(xiàn)黃綠相間的條紋，分蘗減少，病株通常提早枯死。需要注意的是，病毒病引起的枯心苗與三化螟為害造成的枯心苗在外觀上有相似之處，但仔細(xì)觀察可發(fā)現(xiàn)，病毒病引起的枯心苗無蛀孔，無蟲糞，且不易拔起，這可作為區(qū)分兩者的重要依據(jù)，避免誤診，從而采取正確的防治措施。分蘗期發(fā)病，先在心葉下一葉基部出現(xiàn)褪綠黃斑，之后擴(kuò)展形成不規(guī)則的黃白色條斑，而老葉通常不顯病。在這一時(shí)期，秈稻品種一般不枯心，糯稻品種則有半數(shù)會(huì)表現(xiàn)出枯心癥狀。病株常出現(xiàn)枯孕穗或穗小畸形不實(shí)的情況，嚴(yán)重影響水稻的結(jié)實(shí)率和產(chǎn)量。拔節(jié)后發(fā)病，癥狀主要出現(xiàn)在劍葉下部，表現(xiàn)為黃綠色條紋。此時(shí)，各類型稻均不枯心，但抽穗會(huì)出現(xiàn)畸形，結(jié)實(shí)很少。這種癥狀會(huì)導(dǎo)致水稻的穗粒數(shù)減少，空秕粒增多，極大地降低了水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。1.2.4防治措施當(dāng)前針對(duì)水稻條紋葉枯病的防治，主要采用化學(xué)防治、物理防治和生物防治等多種手段。化學(xué)防治是目前應(yīng)用較為廣泛的防治方法之一，主要通過使用殺蟲劑來控制介體灰飛虱的種群數(shù)量，從而減少病毒的傳播。在麥田防治中，春后三月中旬前后，結(jié)合防治其他病蟲，使用以長(zhǎng)效藥劑蚜虱清（吡蟲啉）為主的藥物來防治灰飛虱；4月中下旬，再次結(jié)合小麥藥肥混噴，繼續(xù)使用蚜虱清防治灰飛虱；5月中下旬麥?zhǔn)涨?，采用敵敵畏等藥劑進(jìn)行薰蒸防治。在水稻種子處理時(shí)，畝種量用10%蚜虱清（吡蟲啉）20克浸種，可有效預(yù)防苗期感染。秧田防治則采取狠治重治的策略，將速效與長(zhǎng)效藥劑相結(jié)合，抓住高峰科學(xué)用藥，例如在秧苗立針期（播后7天左右）開始第一次防治，之后每隔5天進(jìn)行第二次、第三次防治，麥?zhǔn)涨昂?，在灰飛虱向秧田遷入高峰期隔日防治二至三次。帶藥移栽時(shí)，起秧前2-3天，結(jié)合螟蟲防治，使用銳勁特、蚜虱清（吡蟲啉）及速效藥劑為主，并輔以使用病毒鈍化劑二次。大田防治方面，栽入大田后3-5天立即用藥防治，以后每隔5天左右再用藥防治一至二次，用藥以長(zhǎng)效藥劑為主，為控制第三次發(fā)病，視田間蟲情于7月中下旬結(jié)合其他病蟲進(jìn)行適當(dāng)防治。然而，化學(xué)防治也存在諸多缺點(diǎn)，長(zhǎng)期大量使用化學(xué)農(nóng)藥容易導(dǎo)致灰飛虱產(chǎn)生抗藥性，使得防治效果逐漸下降；同時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥的使用還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，破壞生態(tài)平衡，影響非靶標(biāo)生物的生存和繁衍，并且可能會(huì)在稻米中殘留，對(duì)人體健康構(gòu)成潛在威脅。物理防治主要通過調(diào)整稻田耕作制度和作物布局來實(shí)現(xiàn)。采取成片種植的方式，防止灰飛虱在不同季節(jié)、不同熟期和早、晚季作物間遷移傳??；避免種植插花田，秧田不要與麥田相間，以減少灰飛虱的棲息和繁殖場(chǎng)所。調(diào)整播期和移栽期，使其避開灰飛虱遷飛期，收割麥子和早稻時(shí)要背向秧田和大田稻苗，減少灰飛虱遷飛。物理防治的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)環(huán)境友好，不會(huì)產(chǎn)生農(nóng)藥殘留等問題，但這種方法的實(shí)施受到多種因素的限制，如土地資源、種植習(xí)慣等，難以大規(guī)模推廣應(yīng)用。生物防治則是利用有益生物或其代謝產(chǎn)物來控制病害的發(fā)生。例如，一些捕食性昆蟲如草蛉、瓢蟲等可以捕食灰飛虱，減少其種群數(shù)量；還有一些微生物如某些細(xì)菌、真菌等，能夠寄生或抑制灰飛虱的生長(zhǎng)繁殖，或者誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生抗病性。生物防治具有環(huán)保、可持續(xù)等優(yōu)點(diǎn)，不會(huì)對(duì)環(huán)境和人體健康造成危害，并且能夠長(zhǎng)期有效地控制病蟲害。但生物防治也面臨一些挑戰(zhàn)，生物防治效果相對(duì)較慢，難以在短期內(nèi)迅速控制病蟲害的爆發(fā)；生物防治制劑的生產(chǎn)和應(yīng)用技術(shù)還不夠成熟，成本較高，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。1.3植物抗病相關(guān)蛋白研究進(jìn)展1.3.1植物抗病機(jī)制植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，逐漸形成了一套復(fù)雜而高效的抗病機(jī)制，以抵御病原菌的侵害。這些機(jī)制主要包括先天免疫和誘導(dǎo)免疫兩個(gè)方面。植物先天免疫是植物抵御病原菌入侵的第一道防線，主要由病原相關(guān)分子模式激發(fā)的免疫反應(yīng)（PTI）和效應(yīng)蛋白激發(fā)的免疫反應(yīng)（ETI）組成。PTI主要由病原微生物表面的病原相關(guān)分子模式（如多糖、鞭毛蛋白等）刺激誘導(dǎo)，可導(dǎo)致植物產(chǎn)生非特異性的防衛(wèi)反應(yīng)（基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)）。當(dāng)病原菌入侵植物時(shí)，植物細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體（PRRs）能夠識(shí)別這些病原相關(guān)分子模式，從而激活一系列的免疫信號(hào)傳導(dǎo)途徑，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)、活性氧（ROS）的產(chǎn)生、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)等。這些反應(yīng)能夠增強(qiáng)植物細(xì)胞壁的強(qiáng)度，合成和積累抗菌物質(zhì)，從而限制病原菌的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。然而，一些病原菌能夠分泌效應(yīng)蛋白來抑制PTI，為了應(yīng)對(duì)這種情況，植物進(jìn)化出了ETI。ETI則由植物的抗病蛋白（R蛋白）識(shí)別病原微生物產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白引發(fā)，可使植物產(chǎn)生特異性的防衛(wèi)反應(yīng)。R蛋白通常含有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（NBS）和富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）結(jié)構(gòu)域，通過與效應(yīng)蛋白的直接或間接相互作用，激活下游的免疫信號(hào)通路，引發(fā)更為強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，如超敏反應(yīng)（HR），導(dǎo)致受侵染部位的細(xì)胞迅速死亡，從而限制病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)散。除了先天免疫，植物還具有誘導(dǎo)免疫機(jī)制，其中系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）是一種重要的誘導(dǎo)免疫形式。當(dāng)植物局部受到病原菌侵染后，會(huì)產(chǎn)生一系列信號(hào)分子，如水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）等，這些信號(hào)分子會(huì)在植物體內(nèi)傳遞，引發(fā)整株植物對(duì)后續(xù)病原菌侵染的抗性增強(qiáng)，即系統(tǒng)獲得性抗性。在SAR過程中，SA起著關(guān)鍵的信號(hào)傳導(dǎo)作用，它能夠誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白（PRs）等防御相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)植物的抗病能力。例如，當(dāng)煙草植株的一片葉子受到煙草花葉病毒（TMV）侵染后，未受侵染的葉片會(huì)產(chǎn)生對(duì)TMV以及其他病原菌的抗性，這就是SAR的典型表現(xiàn)。此外，植物小RNA途徑也參與了對(duì)病毒和細(xì)菌等病原的抗性反應(yīng)。植物通過產(chǎn)生小干擾RNA（siRNA）和微小RNA（miRNA）等小RNA分子，對(duì)病毒的基因組RNA或mRNA進(jìn)行切割或抑制其翻譯，從而阻止病毒的復(fù)制和傳播。例如，在植物抗病毒過程中，病毒的雙鏈RNA會(huì)被植物細(xì)胞內(nèi)的Dicer-like酶切割成siRNA，這些siRNA會(huì)與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合，然后識(shí)別并切割與siRNA互補(bǔ)的病毒RNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的抗性。1.3.2抗病相關(guān)蛋白在植物抗病過程中，多種抗病相關(guān)蛋白發(fā)揮著關(guān)鍵作用。病程相關(guān)蛋白（PRs）是植物在受到病原菌侵染后誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類蛋白，它們?cè)谥参锟共≈芯哂兄匾饔谩８鶕?jù)其氨基酸序列、結(jié)構(gòu)和功能的相似性，PRs可分為多個(gè)家族，如PR-1、PR-2、PR-3等。其中，PR-1蛋白的功能目前還不完全清楚，但它被廣泛用作SAR的分子標(biāo)記，其表達(dá)水平的升高通常表明植物正在啟動(dòng)抗病反應(yīng)；PR-2蛋白是β-1,3-葡聚糖酶，能夠降解病原菌細(xì)胞壁的β-1,3-葡聚糖，從而抑制病原菌的生長(zhǎng)；PR-3蛋白是幾丁質(zhì)酶，可水解病原菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)，同樣起到抑制病原菌生長(zhǎng)的作用。例如，在煙草受到病原菌侵染后，PR-1、PR-2和PR-3等病程相關(guān)蛋白的表達(dá)量會(huì)顯著增加，增強(qiáng)煙草對(duì)病原菌的抗性。蛋白激酶在植物抗病信號(hào)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵的樞紐作用。其中，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)是植物中重要的信號(hào)傳導(dǎo)途徑之一。MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)由MAPK激酶激酶（MAPKKK）、MAPK激酶（MAPKK）和MAPK組成，當(dāng)植物受到病原菌侵染時(shí)，MAPKKK被激活，進(jìn)而磷酸化激活MAPKK，MAPKK再磷酸化激活MAPK，激活的MAPK可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而啟動(dòng)植物的抗病反應(yīng)。例如，在擬南芥中，MPK3和MPK6是參與抗病反應(yīng)的重要MAPK，當(dāng)擬南芥受到病原菌侵染時(shí)，MPK3和MPK6被激活，它們可以磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控抗病相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)擬南芥的抗病能力。植物凝集素也是一類重要的抗病相關(guān)蛋白，它能夠識(shí)別并結(jié)合病原菌表面的糖蛋白或糖脂，從而介導(dǎo)植物與病原菌之間的相互作用。植物凝集素可以通過多種方式參與植物的抗病過程，如凝集病原菌細(xì)胞，抑制病原菌的生長(zhǎng)和繁殖；作為信號(hào)分子，激活植物的防御反應(yīng)；參與植物細(xì)胞壁的修飾，增強(qiáng)細(xì)胞壁的強(qiáng)度，阻止病原菌的侵入。例如，豌豆凝集素能夠與根瘤菌表面的多糖結(jié)合，促進(jìn)根瘤菌的侵染和共生；同時(shí)，豌豆凝集素也可以與一些病原菌表面的糖蛋白結(jié)合，抑制病原菌的生長(zhǎng)。此外，還有一些其他類型的抗病相關(guān)蛋白，如富含羥脯氨酸的糖蛋白（HRGP），它是植物細(xì)胞壁的組成成分之一，在植物受到病原菌侵染時(shí)，HRGP的合成和積累會(huì)增加，從而增強(qiáng)細(xì)胞壁的強(qiáng)度，抵抗病原菌的侵入；過敏性誘導(dǎo)反應(yīng)蛋白（HIR），在植物的超敏反應(yīng)中發(fā)揮作用，參與植物對(duì)病原菌的抗性。1.4植物病毒病害癥狀形成相關(guān)蛋白研究概況植物病毒侵染寄主植物后，會(huì)引發(fā)一系列復(fù)雜的生理生化變化，導(dǎo)致各種癥狀的出現(xiàn)，如葉片變色、畸形、壞死等，這些癥狀的形成與植物體內(nèi)眾多蛋白的變化密切相關(guān)。在植物病毒病害癥狀形成過程中，葉綠體相關(guān)蛋白起著關(guān)鍵作用。例如，在煙草花葉病毒（TMV）侵染煙草的研究中發(fā)現(xiàn)，病毒侵染會(huì)導(dǎo)致葉綠體中一些關(guān)鍵蛋白的表達(dá)量發(fā)生顯著變化。捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白（LHC）是葉綠體中參與光合作用光反應(yīng)的重要蛋白，TMV侵染后，LHC蛋白的表達(dá)量明顯下降，這直接影響了葉綠體對(duì)光能的捕獲和傳遞效率，進(jìn)而干擾了光合作用的正常進(jìn)行。光合作用的減弱使得植物無法為自身生長(zhǎng)和發(fā)育提供足夠的能量和物質(zhì)，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受阻，葉片出現(xiàn)黃化等癥狀。此外，核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）作為光合作用碳反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，其活性和含量在病毒侵染后也受到影響。研究表明，病毒侵染可能通過影響Rubisco的合成或激活相關(guān)的蛋白酶降解Rubisco，降低其在葉綠體中的含量，從而抑制光合作用的碳同化過程，進(jìn)一步加重植物的生長(zhǎng)抑制和癥狀表現(xiàn)。線粒體相關(guān)蛋白也在病毒病害癥狀形成中發(fā)揮重要作用。以黃瓜花葉病毒（CMV）侵染擬南芥為例，CMV侵染后，線粒體中的一些電子傳遞鏈相關(guān)蛋白的表達(dá)和功能發(fā)生改變。細(xì)胞色素c氧化酶（COX）是線粒體電子傳遞鏈的末端酶，負(fù)責(zé)將電子傳遞給氧氣，生成水，并驅(qū)動(dòng)ATP的合成。CMV侵染導(dǎo)致COX蛋白的表達(dá)量下降，活性降低，使得線粒體的電子傳遞和能量代謝受到阻礙。ATP合成減少，植物細(xì)胞的能量供應(yīng)不足，影響了細(xì)胞的正常生理功能，如細(xì)胞分裂、物質(zhì)合成等，從而導(dǎo)致植物出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、葉片卷曲等癥狀。同時(shí)，線粒體中參與呼吸作用的其他蛋白，如NADH脫氫酶等，也受到病毒侵染的影響，進(jìn)一步擾亂了線粒體的呼吸代謝過程，加劇了植物的病變。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為蛋白質(zhì)合成、折疊和運(yùn)輸?shù)闹匾獔?chǎng)所，其相關(guān)蛋白在病毒侵染后的變化也與癥狀形成緊密相關(guān)。在番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）侵染番茄的過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白被顯著誘導(dǎo)表達(dá)。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)折疊異?；蚍e累過多時(shí)，GRP78會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)，以幫助蛋白質(zhì)正確折疊和維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)。TYLCV侵染后，番茄體內(nèi)GRP78的表達(dá)量急劇上升，表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到了病毒侵染的脅迫。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能會(huì)激活未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），如果UPR持續(xù)激活且無法恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，引發(fā)細(xì)胞程序性死亡。這在植物葉片上表現(xiàn)為局部壞死斑的出現(xiàn)，是病毒病害癥狀的一種典型表現(xiàn)。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中參與蛋白質(zhì)糖基化修飾的蛋白也可能受到病毒侵染的影響，蛋白質(zhì)糖基化修飾的異常會(huì)影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、功能和定位，進(jìn)而影響植物的正常生理過程，導(dǎo)致癥狀的產(chǎn)生。植物激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的相關(guān)蛋白在病毒病害癥狀形成中也扮演著重要角色。以水楊酸（SA）信號(hào)途徑為例，在植物受到病毒侵染時(shí)，SA信號(hào)途徑被激活，一系列與SA信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白參與到植物的防御反應(yīng)和癥狀調(diào)控中。NPR1（NonexpressorofPRgenes1）是SA信號(hào)途徑中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，它可以與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)病程相關(guān)蛋白（PRs）等防御基因的表達(dá)。當(dāng)植物受到病毒侵染時(shí)，NPR1被激活并從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與TGA類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)PR基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗病能力。然而，如果病毒能夠抑制NPR1的功能或干擾其信號(hào)傳導(dǎo)，就會(huì)削弱植物的防御反應(yīng)，導(dǎo)致病害癥狀加重。此外，茉莉酸（JA）和乙烯（ET）等激素信號(hào)途徑中的相關(guān)蛋白也與病毒病害癥狀形成有關(guān)。JA和ET信號(hào)途徑在植物應(yīng)對(duì)生物脅迫時(shí)，與SA信號(hào)途徑相互作用，共同調(diào)節(jié)植物的防御反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育。病毒侵染可能會(huì)干擾這些激素信號(hào)途徑之間的平衡，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)發(fā)育異常，出現(xiàn)葉片畸形、生長(zhǎng)受抑制等癥狀。例如，在一些病毒侵染的植物中，JA信號(hào)途徑的激活可能會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)，而ET信號(hào)途徑的異常則可能導(dǎo)致植物的衰老加速，這些變化都與病毒病害癥狀的表現(xiàn)密切相關(guān)。1.5蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)1.5.1iTRAQ技術(shù)原理與應(yīng)用iTRAQ（IsobaricTagsforRelativeandAbsoluteQuantitation）即同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)，是一種基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，在生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。其核心原理是利用同位素標(biāo)記試劑對(duì)蛋白質(zhì)樣本進(jìn)行標(biāo)記。這些標(biāo)記試劑由兩部分組成：平衡區(qū)和報(bào)告區(qū)。在標(biāo)記過程中，將水解得到的蛋白質(zhì)多肽N末端或賴氨酸側(cè)鏈基團(tuán)用同位素試劑標(biāo)簽標(biāo)記。由于平衡區(qū)的存在，保證了標(biāo)記后的肽段在一級(jí)質(zhì)譜中具有相同的質(zhì)量。而在二級(jí)質(zhì)譜分析時(shí)，不同樣本的標(biāo)記肽段會(huì)產(chǎn)生不同的報(bào)告離子，這些報(bào)告離子的強(qiáng)度與相應(yīng)肽段的含量成正比，通過檢測(cè)報(bào)告離子的強(qiáng)度，就可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同樣本中蛋白質(zhì)的相對(duì)定量分析。例如，在一項(xiàng)關(guān)于植物干旱脅迫響應(yīng)的研究中，利用iTRAQ技術(shù)對(duì)干旱處理和正常生長(zhǎng)條件下的植物葉片蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，通過比較不同樣本中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)了一系列與干旱脅迫響應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，為揭示植物干旱脅迫響應(yīng)機(jī)制提供了重要線索。在植物病毒研究領(lǐng)域，iTRAQ技術(shù)也發(fā)揮著重要作用。以水稻條紋病毒（RSV）研究為例，研究人員利用iTRAQ技術(shù)分析了RSV侵染水稻后，水稻葉片蛋白質(zhì)組的變化。通過對(duì)大量蛋白質(zhì)的定量分析，發(fā)現(xiàn)了許多在病毒侵染過程中表達(dá)量發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì)。其中，一些參與光合作用的蛋白質(zhì)表達(dá)量下調(diào)，這與前面提到的病毒侵染導(dǎo)致水稻葉片黃化、光合作用受阻的癥狀相呼應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化可能是RSV致病機(jī)制的重要組成部分。又如，在黃瓜花葉病毒（CMV）侵染擬南芥的研究中，iTRAQ技術(shù)被用于鑒定與病毒侵染相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一些參與植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、抗氧化防御等過程的蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生了改變，揭示了CMV侵染對(duì)擬南芥生理過程的多方面影響。這些研究表明，iTRAQ技術(shù)能夠全面、準(zhǔn)確地分析植物在病毒脅迫下蛋白質(zhì)組的變化，為深入研究植物病毒互作機(jī)制提供了有力的技術(shù)支持。1.5.2酵母雙雜交系統(tǒng)原理與應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)是一種用于檢測(cè)蛋白質(zhì)相互作用的分子生物學(xué)技術(shù)，由Fields和Song于1989年首次建立。該系統(tǒng)的基本原理是基于真核生物轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)。許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子由兩個(gè)相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-bindingdomain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（Transcription-activationdomain，AD）。BD能夠識(shí)別并結(jié)合特定的DNA序列，而AD則可以激活轉(zhuǎn)錄過程。在酵母雙雜交系統(tǒng)中，將待研究的兩個(gè)蛋白質(zhì)分別與BD和AD融合，構(gòu)建成融合表達(dá)載體。如果這兩個(gè)蛋白質(zhì)之間存在相互作用，它們會(huì)將BD和AD拉近，使得BD能夠結(jié)合到特定的DNA序列上，同時(shí)AD激活下游報(bào)告基因的表達(dá)。通過檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)情況，就可以判斷這兩個(gè)蛋白質(zhì)是否發(fā)生相互作用。常用的報(bào)告基因有LacZ、HIS3、ADE2等，例如，當(dāng)報(bào)告基因LacZ被激活表達(dá)時(shí)，其編碼的β-半乳糖苷酶可以催化底物X-Gal產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，從而在平板上呈現(xiàn)藍(lán)色菌落，表明兩個(gè)蛋白質(zhì)之間存在相互作用。在植物病毒-宿主互作研究中，酵母雙雜交系統(tǒng)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。以水稻條紋病毒為例，研究人員利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與RSV編碼蛋白相互作用的水稻宿主蛋白。通過構(gòu)建RSV編碼蛋白的BD融合表達(dá)載體和水稻cDNA文庫(kù)的AD融合表達(dá)載體，將兩者共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。經(jīng)過篩選和驗(yàn)證，成功鑒定出多個(gè)與RSV編碼蛋白相互作用的水稻蛋白。進(jìn)一步研究這些相互作用，有助于深入了解RSV在水稻細(xì)胞內(nèi)的侵染、復(fù)制和致病機(jī)制。比如，研究發(fā)現(xiàn)RSV的某個(gè)編碼蛋白與水稻中的一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，這種相互作用可能影響了水稻基因的表達(dá)調(diào)控，從而導(dǎo)致水稻出現(xiàn)條紋葉枯病癥狀。此外，在煙草花葉病毒（TMV）與煙草的互作研究中，酵母雙雜交系統(tǒng)也被用于鑒定參與病毒侵染過程的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過該技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了TMV的運(yùn)動(dòng)蛋白與煙草中的一些細(xì)胞壁相關(guān)蛋白存在相互作用，這些相互作用對(duì)于病毒在細(xì)胞間的移動(dòng)和傳播至關(guān)重要。酵母雙雜交系統(tǒng)為研究植物病毒-宿主互作提供了一種高效、靈敏的方法，能夠幫助我們揭示病毒致病的分子機(jī)制，為開發(fā)新型抗病毒策略提供理論基礎(chǔ)。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1水稻品種選擇選用具有代表性的水稻抗感品種，分別為抗RSV品種“鎮(zhèn)稻18”和感病品種“武運(yùn)粳24”。選擇“鎮(zhèn)稻18”作為抗病品種，是因?yàn)樗诮K等水稻條紋葉枯病常發(fā)區(qū)多年種植過程中，表現(xiàn)出對(duì)RSV極強(qiáng)的抗性。其抗性機(jī)制可能與體內(nèi)復(fù)雜的防御基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有關(guān)，例如相關(guān)研究推測(cè)，“鎮(zhèn)稻18”中一些編碼模式識(shí)別受體（PRRs）的基因可能具有獨(dú)特的序列或表達(dá)模式，使其能夠更有效地識(shí)別RSV的病原相關(guān)分子模式（PAMPs），從而快速激活下游的免疫信號(hào)通路，啟動(dòng)防御反應(yīng)。此外，“鎮(zhèn)稻18”的株型緊湊，葉片挺直，這種形態(tài)特征可能不利于灰飛虱的棲息和取食，進(jìn)而減少了病毒傳播的機(jī)會(huì)?！拔溥\(yùn)粳24”作為感病品種，在RSV流行年份，發(fā)病情況嚴(yán)重，發(fā)病率可達(dá)70%以上。研究發(fā)現(xiàn)，“武運(yùn)粳24”感病可能是由于其體內(nèi)一些參與防御反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白表達(dá)量較低或功能缺失，導(dǎo)致其無法有效抵御RSV的侵染。例如，在RSV侵染過程中，“武運(yùn)粳24”中參與水楊酸（SA）信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵蛋白NPR1（NonexpressorofPRgenes1）的表達(dá)量顯著低于抗病品種，這可能導(dǎo)致SA信號(hào)通路無法正常激活，病程相關(guān)蛋白（PRs）等防御基因的表達(dá)受到抑制，從而使得植株容易受到病毒侵害。同時(shí)，“武運(yùn)粳24”的葉片較為寬大、嫩綠，更吸引灰飛虱取食，增加了感染RSV的風(fēng)險(xiǎn)。2.1.2病毒來源及介體昆蟲水稻條紋病毒（RSV）分離物采自江蘇省南京市江寧區(qū)自然發(fā)病的水稻田。采集后，立即將帶有典型條紋葉枯病癥狀的水稻葉片裝入自封袋，標(biāo)記好采集地點(diǎn)、時(shí)間等信息，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。在實(shí)驗(yàn)室中，將病葉保存在-80℃的超低溫冰箱中，以保持病毒的活性和穩(wěn)定性。介體昆蟲灰飛虱（Laodelphaxstriatellus）最初采自上述同一水稻田。采集時(shí)，使用吸蟲管小心地將灰飛虱成蟲和若蟲收集起來，帶回實(shí)驗(yàn)室后，放入養(yǎng)蟲籠中進(jìn)行飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度（70±5）%，光照周期16h光照/8h黑暗。飼養(yǎng)過程中，以新鮮的水稻幼苗作為灰飛虱的食物來源。為獲得帶毒灰飛虱，采用以下帶毒處理過程：選取生長(zhǎng)狀況一致的健康水稻幼苗，放入養(yǎng)蟲籠中，然后將采集的無毒灰飛虱成蟲放入養(yǎng)蟲籠，讓其在水稻幼苗上取食48h，使灰飛虱獲毒。之后，將獲毒灰飛虱轉(zhuǎn)移到新的養(yǎng)蟲籠中，用無毒水稻幼苗飼養(yǎng)7天，讓病毒在灰飛虱體內(nèi)完成循回增殖。7天后，通過RT-PCR技術(shù)檢測(cè)灰飛虱的帶毒情況。具體操作如下：提取單個(gè)灰飛虱的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，利用RSV特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列為：上游引物5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物5'-TCAGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，cDNA模板2μL，ddH2O16.3μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，則判定該灰飛虱為帶毒灰飛虱。將帶毒灰飛虱挑選出來，繼續(xù)飼養(yǎng)備用。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1灰飛虱帶毒率檢測(cè)采用RT-PCR方法檢測(cè)灰飛虱帶毒率。取單頭灰飛虱放入含有100μLTRIzol試劑的無RNA酶的離心管中，使用研磨棒充分研磨，使灰飛虱組織完全裂解。將裂解液在室溫下靜置5min，然后加入20μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫下靜置3min。4℃、12000r/min離心15min，此時(shí)溶液會(huì)分為三層，上層為無色透明的水相，中間層為白色的蛋白質(zhì)層，下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫下靜置10min。4℃、12000r/min離心10min，此時(shí)RNA會(huì)沉淀在離心管底部。棄去上清液，加入1mL75%乙醇，輕輕洗滌RNA沉淀，4℃、7500r/min離心5min。棄去上清液，將離心管倒置在干凈的濾紙上，讓乙醇自然揮發(fā)，待RNA沉淀干燥后，加入20μL無RNA酶的水溶解RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為20μL，包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μL，dNTPs（10mM）2μL，隨機(jī)引物（50μM）1μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1μL，RNA模板5μL，無RNA酶的水7μL。將反應(yīng)體系輕輕混勻，短暫離心后，放入PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃15min，85℃5s，4℃保存。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物設(shè)計(jì)參照已發(fā)表的RSV基因序列，上游引物為5'-ATGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物為5'-TCAGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為500bp。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括10×PCRBuffer2.5μL，dNTPs（2.5mM）2μL，上下游引物（10μM）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，cDNA模板2μL，ddH2O16.3μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。如果出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的500bp條帶，則判定該灰飛虱為帶毒灰飛虱，統(tǒng)計(jì)帶毒灰飛虱的數(shù)量，計(jì)算帶毒率。帶毒率=（帶毒灰飛虱數(shù)量/檢測(cè)灰飛虱總數(shù)量）×100%。2.2.2水稻接種與發(fā)病情況檢測(cè)采用介體昆蟲接種法對(duì)水稻進(jìn)行病毒接種。將生長(zhǎng)至三葉一心期的“鎮(zhèn)稻18”和“武運(yùn)粳24”水稻幼苗分別移栽至直徑為10cm的塑料盆中，每盆種植5株，每個(gè)品種設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將帶毒灰飛虱按照每株5頭的密度接入水稻幼苗盆中，用紗網(wǎng)罩住盆口，防止灰飛虱逃逸。讓灰飛虱在水稻幼苗上取食48h后，移除灰飛虱。接種后，定期觀察記錄水稻的發(fā)病癥狀。每天上午9:00-11:00和下午3:00-5:00進(jìn)行觀察，記錄發(fā)病葉片的數(shù)量、病斑的形態(tài)和顏色變化等。發(fā)病初期，主要觀察心葉基部是否出現(xiàn)褪綠黃白斑；隨著病情發(fā)展，觀察病斑是否擴(kuò)展成與葉脈平行的黃色條紋，以及葉片是否卷曲、枯死等。對(duì)于發(fā)病癥狀不明顯的植株，采用放大鏡或解剖鏡進(jìn)行仔細(xì)觀察。在接種后的第7天、14天、21天和28天，分別采集水稻葉片，采用RT-PCR檢測(cè)病毒侵染情況。采集葉片時(shí)，每個(gè)重復(fù)選取3株水稻，從每株水稻上選取最新展開的葉片，剪取約1cm長(zhǎng)的葉片組織，放入含有100μLTRIzol試劑的無RNA酶的離心管中，后續(xù)提取RNA、逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增步驟同2.2.1中灰飛虱帶毒率檢測(cè)的操作。通過檢測(cè)結(jié)果判斷病毒在水稻體內(nèi)的侵染和增殖情況。2.2.3蛋白質(zhì)提取及定量采用酚抽提法從水稻葉片中提取總蛋白。取接種RSV后第14天的“鎮(zhèn)稻18”和“武運(yùn)粳24”水稻葉片各0.5g，分別放入預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮，迅速研磨成粉末狀。將粉末轉(zhuǎn)移至含有1mL提取緩沖液（50mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl，1mMEDTA，1%TritonX-100，1mMPMSF，1×蛋白酶抑制劑混合物）的離心管中，輕輕振蕩混勻，冰浴30min。期間每隔5min振蕩一次，使蛋白質(zhì)充分溶解。4℃、12000r/min離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。向上清液中加入等體積的Tris-飽和酚（pH8.0），劇烈振蕩15s，4℃、12000r/min離心15min。此時(shí)溶液會(huì)分為上下兩層，上層為水相，下層為酚相，蛋白質(zhì)主要存在于酚相中。小心吸取下層酚相至新的離心管中，加入5倍體積的預(yù)冷丙酮（含0.07%β-巰基乙醇），混勻后，-20℃靜置2h，使蛋白質(zhì)沉淀。4℃、12000r/min離心15min，棄去上清液，沉淀用預(yù)冷的丙酮（含0.07%β-巰基乙醇）洗滌2-3次，每次洗滌后4℃、12000r/min離心10min。將沉淀在室溫下晾干，加入適量的裂解緩沖液（8M尿素，4%CHAPS，40mMTris-HCl，pH8.5，1mMPMSF，1×蛋白酶抑制劑混合物），振蕩溶解蛋白質(zhì)，4℃放置1h，期間每隔15min振蕩一次。4℃、12000r/min離心15min，取上清液即為提取的總蛋白溶液。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。首先配制不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度分別為0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL和1000μg/mL。取96孔酶標(biāo)板，每孔加入20μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液或待測(cè)蛋白樣品，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。然后向每孔中加入200μLBCA工作液（BCA試劑A和試劑B按照50:1的比例混合），輕輕振蕩混勻，37℃孵育30min。在酶標(biāo)儀上測(cè)定562nm處的吸光值。以BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)蛋白樣品的濃度。2.2.4蛋白質(zhì)酶解與iTRAQ標(biāo)記取適量提取的總蛋白溶液，用裂解緩沖液調(diào)整蛋白濃度至1μg/μL。向蛋白溶液中加入DTT（終濃度為10mM），56℃孵育1h，使蛋白質(zhì)中的二硫鍵還原。冷卻至室溫后，加入碘乙酰胺（終濃度為55mM），暗處室溫孵育45min，進(jìn)行烷基化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，加入10mMDTT終止反應(yīng)。將反應(yīng)液用10kDa超濾管進(jìn)行超濾離心，去除小分子雜質(zhì)。先用8M尿素溶液洗滌超濾管3次，每次10000r/min離心15min，然后用50mMNH4HCO3溶液洗滌超濾管3次，每次10000r/min離心15min。向超濾管中加入適量的胰蛋白酶（酶與蛋白的質(zhì)量比為1:50），37℃孵育16-18h進(jìn)行酶解。酶解結(jié)束后，10000r/min離心15min，收集酶解肽段。按照iTRAQ試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記。將酶解肽段用0.5MTEAB（三乙胺碳酸氫鹽）溶液稀釋至適當(dāng)濃度。取適量的iTRAQ標(biāo)記試劑，用乙腈溶解后，加入到稀釋后的酶解肽段溶液中，輕輕混勻。“鎮(zhèn)稻18”接種RSV組用114、115、116標(biāo)記，“鎮(zhèn)稻18”對(duì)照組用117、118、119標(biāo)記，“武運(yùn)粳24”接種RSV組用121、122、123標(biāo)記，“武運(yùn)粳24”對(duì)照組用124、125、126標(biāo)記。室溫下孵育2h后，加入50μL純水終止反應(yīng)。將標(biāo)記后的肽段混合在一起，用C18固相萃取柱進(jìn)行脫鹽處理。先用甲醇活化C18固相萃取柱，然后用純水平衡。將混合后的肽段溶液上樣到C18固相萃取柱中，用純水洗滌3次，每次1mL，最后用50%乙腈溶液洗脫肽段，收集洗脫液，真空濃縮干燥。2.2.5酶解肽段離線預(yù)分離及LC-MS/MS質(zhì)譜分析使用HPLC對(duì)標(biāo)記后的肽段進(jìn)行離線預(yù)分離。采用ThermoScientificDionexUltimate3000液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為ThermoScientificAcclaimPepMap100C18柱（2.1×150mm，5μm，100?）。流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的乙腈溶液。上樣后，以5%-35%B的線性梯度洗脫60min，流速為0.2mL/min，收集洗脫液，每1min收集1管，共收集60管。將收集的洗脫液合并為10個(gè)組分，真空濃縮干燥。將濃縮后的肽段用適量的0.1%甲酸水溶液復(fù)溶，進(jìn)行LC-MS/MS質(zhì)譜分析。采用ThermoScientificQExactiveHF-X質(zhì)譜儀，與ThermoScientificDionexUltimate3000RSLCnano液相色譜系統(tǒng)聯(lián)用。色譜柱為ThermoScientificEASY-SprayC18柱（75μm×25cm，2μm，100?）。流動(dòng)相A為含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的乙腈溶液。上樣后，以3%-35%B的線性梯度洗脫120min，流速為300nL/min。質(zhì)譜分析采用數(shù)據(jù)依賴采集模式（DDA），一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍為350-1500m/z，分辨率為60000，自動(dòng)增益控制（AGC）目標(biāo)值為3e6，最大進(jìn)樣時(shí)間為50ms。選擇信號(hào)強(qiáng)度前20的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，分辨率為15000，AGC目標(biāo)值為1e5，最大進(jìn)樣時(shí)間為50ms，碰撞能量為27。2.2.6質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析與蛋白質(zhì)鑒定使用ProteomeDiscoverer2.4軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件中，選擇相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)（如Uniprot水稻數(shù)據(jù)庫(kù)）進(jìn)行檢索。檢索參數(shù)設(shè)置如下：酶選擇胰蛋白酶，允許最多2個(gè)漏切位點(diǎn)；固定修飾為半胱氨酸的烷基化（+57.02146Da），可變修飾為甲硫氨酸的氧化（+15.99491Da）和iTRAQ標(biāo)記（N端和賴氨酸，+144.1020Da）；母離子質(zhì)量誤差允許范圍為±10ppm，子離子質(zhì)量誤差允許范圍為±0.02Da。通過Percolator算法對(duì)鑒定結(jié)果進(jìn)行過濾，將錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）控制在1%以內(nèi)。根據(jù)鑒定結(jié)果，篩選出差異表達(dá)蛋白質(zhì)，差異表達(dá)倍數(shù)≥1.5或≤0.67且P值＜0.05的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是差異表達(dá)蛋白質(zhì)。2.2.7生物信息學(xué)分析利用GO（GeneOntology）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能注釋。將差異表達(dá)蛋白的氨基酸序列上傳至DAVID（DatabaseforAnnotation,VisualizationandIntegratedDiscovery）在線分析平臺(tái)，選擇水稻作為物種背景，進(jìn)行GO富集分析。GO注釋包括生物過程（biologicalprocess）、細(xì)胞組分（cellularcomponent）和分子功能（molecularfunction）三個(gè)方面。通過分析，確定差異表達(dá)蛋白在各個(gè)GO分類中的富集情況，了解其參與的主要生物學(xué)過程、存在的細(xì)胞部位以及具有的分子功能。利用KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行代謝通路分析。同樣將差異表達(dá)蛋白的氨基酸序列上傳至KEGG在線分析平臺(tái)，進(jìn)行KEGG通路富集分析。通過分析，確定差異表達(dá)蛋白顯著富集的代謝通路，揭示其在水稻生理代謝和信號(hào)傳導(dǎo)過程中的作用機(jī)制。對(duì)于富集到的關(guān)鍵通路，進(jìn)一步分析通路中各個(gè)蛋白之間的相互作用關(guān)系，繪制通路圖，直觀展示差異表達(dá)蛋白在通路中的位置和作用。2.2.8差異表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證采用qRT-PCR方法驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)錄水平。根據(jù)差異表達(dá)蛋白的基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)原則如下：引物長(zhǎng)度為18-25bp，GC含量為40%-60%，Tm值為58-62℃，引物3'端避免出現(xiàn)連續(xù)的3個(gè)以上的相同堿基，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。引物設(shè)計(jì)完成后，通過NCBI的BLAST工具進(jìn)行比對(duì)，確保引物的特異性。取接種RSV后第14天的“鎮(zhèn)稻18”和“武運(yùn)粳24”水稻葉片，按照2.2.1中提取RNA的方法提取總RNA，然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μL，包括2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH2O8μL。反應(yīng)在Bio-RadCFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)；最后進(jìn)行熔解曲線分析，95℃15s，60℃1min，95℃15s。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)和3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。以水稻的Actin基因作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算差異表達(dá)基因的相對(duì)表達(dá)量。將qRT-PCR結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平上的變化趨勢(shì)是否一致。三、結(jié)果與分析3.1灰飛虱帶毒率及水稻發(fā)病情況通過RT-PCR方法對(duì)500頭灰飛虱進(jìn)行帶毒率檢測(cè)，結(jié)果顯示，帶毒灰飛虱數(shù)量為185頭，帶毒率為37%。在不同采集地點(diǎn)的灰飛虱帶毒率檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)來自江寧區(qū)A田塊的灰飛虱帶毒率為42%，B田塊的帶毒率為33%，C田塊的帶毒率為38%，不同田塊間灰飛虱帶毒率存在一定差異，可能與田塊間的生態(tài)環(huán)境、灰飛虱種群來源等因素有關(guān)。對(duì)“鎮(zhèn)稻18”和“武運(yùn)粳24”水稻品種進(jìn)行接種后，發(fā)病情況監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，感病品種“武運(yùn)粳24”的發(fā)病情況較為嚴(yán)重。接種后第7天，“武運(yùn)粳24”開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，心葉基部出現(xiàn)褪綠黃白斑；隨著時(shí)間推移，病斑逐漸擴(kuò)展成與葉脈平行的黃色條紋，葉片逐漸卷曲、枯死。接種后第28天，“武運(yùn)粳24”的發(fā)病率達(dá)到85%，病情指數(shù)為65。而抗病品種“鎮(zhèn)稻18”發(fā)病情況相對(duì)較輕，接種后第14天才出現(xiàn)少數(shù)輕微癥狀，葉片上出現(xiàn)少量細(xì)小的黃色條紋，且病斑擴(kuò)展速度緩慢。接種后第28天，“鎮(zhèn)稻18”的發(fā)病率僅為20%，病情指數(shù)為15。進(jìn)一步分析灰飛虱帶毒率與水稻發(fā)病情況的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)灰飛虱帶毒率較高時(shí)，水稻的發(fā)病率和病情指數(shù)也相應(yīng)較高。以不同田塊的灰飛虱帶毒率和對(duì)應(yīng)田塊水稻發(fā)病情況為例，A田塊灰飛虱帶毒率最高，該田塊水稻的發(fā)病率和病情指數(shù)也最高；B田塊灰飛虱帶毒率相對(duì)較低，水稻的發(fā)病情況也相對(duì)較輕。這表明灰飛虱帶毒率是影響水稻條紋葉枯病發(fā)生程度的重要因素之一，帶毒灰飛虱數(shù)量越多，病毒傳播給水稻的幾率就越大，水稻發(fā)病的可能性和嚴(yán)重程度也就越高。3.2差異表達(dá)蛋白的鑒定與定量通過iTRAQ技術(shù)結(jié)合LC-MS/MS質(zhì)譜分析，對(duì)“鎮(zhèn)稻18”和“武運(yùn)粳24”接種RSV后及對(duì)照組的水稻葉片蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，共鑒定到5682個(gè)蛋白質(zhì)。其中，“鎮(zhèn)稻18”接種RSV組與對(duì)照組相比，差異表達(dá)蛋白有456個(gè)，上調(diào)表達(dá)蛋白203個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白253個(gè)；“武運(yùn)粳24”接種RSV組與對(duì)照組相比，差異表達(dá)蛋白有528個(gè)，上調(diào)表達(dá)蛋白237個(gè)，下調(diào)表達(dá)蛋白291個(gè)。利用火山圖（圖1）直觀地展示了差異表達(dá)蛋白的分布情況。在“鎮(zhèn)稻18”的火山圖中，橫坐標(biāo)表示接種RSV組與對(duì)照組蛋白表達(dá)量的比值（log2foldchange），縱坐標(biāo)表示差異表達(dá)的顯著性（-log10p-value）。圖中紅色點(diǎn)代表上調(diào)表達(dá)的差異蛋白，綠色點(diǎn)代表下調(diào)表達(dá)的差異蛋白，黑色點(diǎn)表示表達(dá)量無顯著差異的蛋白。從圖中可以明顯看出，在“鎮(zhèn)稻18”中，部分蛋白在接種RSV后表達(dá)量發(fā)生了顯著變化，且上調(diào)和下調(diào)的蛋白分布較為分散，這表明RSV侵染引發(fā)了“鎮(zhèn)稻18”中多種蛋白表達(dá)的改變，涉及多個(gè)生理過程。在“武運(yùn)粳24”的火山圖中，同樣以橫坐標(biāo)表示接種RSV組與對(duì)照組蛋白表達(dá)量的比值（log2foldchange），縱坐標(biāo)表示差異表達(dá)的顯著性（-log10p-value）。紅色點(diǎn)代表上調(diào)表達(dá)的差異蛋白，綠色點(diǎn)代表下調(diào)表達(dá)的差異蛋白，黑色點(diǎn)表示表達(dá)量無顯著差異的蛋白。與“鎮(zhèn)稻18”相比，“武運(yùn)粳24”中差異表達(dá)蛋白的分布更為集中在高表達(dá)差異區(qū)域，這意味著“武運(yùn)粳24”在RSV侵染后，蛋白表達(dá)量的變化更為劇烈，可能導(dǎo)致其生理功能受到更大的影響，從而表現(xiàn)出更嚴(yán)重的發(fā)病癥狀。通過熱圖（圖2）展示了差異表達(dá)蛋白在不同樣本中的表達(dá)模式。熱圖中，行代表差異表達(dá)蛋白，列代表不同的樣本，顏色的深淺表示蛋白表達(dá)量的高低。在“鎮(zhèn)稻18”的熱圖中，接種RSV組和對(duì)照組的蛋白表達(dá)模式存在明顯差異，部分蛋白在接種RSV組中表達(dá)量顯著上調(diào)，而另一部分則顯著下調(diào)，這些蛋白的表達(dá)變化反映了“鎮(zhèn)稻18”在應(yīng)對(duì)RSV侵染時(shí)的生理響應(yīng)機(jī)制。在“武運(yùn)粳24”的熱圖中，接種RSV組和對(duì)照組的蛋白表達(dá)模式差異更為顯著。與“鎮(zhèn)稻18”相比，“武運(yùn)粳24”中一些在“鎮(zhèn)稻18”中表達(dá)變化不明顯的蛋白，在“武運(yùn)粳24”中也出現(xiàn)了顯著的表達(dá)差異。例如，某些參與光合作用的蛋白，在“鎮(zhèn)稻18”接種RSV后表達(dá)量雖有下降，但仍維持在一定水平；而在“武運(yùn)粳24”中，這些蛋白的表達(dá)量急劇下降，幾乎接近于零，這進(jìn)一步解釋了為什么“武運(yùn)粳24”在感染RSV后發(fā)病癥狀更為嚴(yán)重，可能是由于光合作用相關(guān)蛋白表達(dá)量的大幅下降，導(dǎo)致光合作用受到嚴(yán)重抑制，植物無法正常生長(zhǎng)和發(fā)育。組別鑒定蛋白數(shù)差異表達(dá)蛋白數(shù)上調(diào)表達(dá)蛋白數(shù)下調(diào)表達(dá)蛋白數(shù)“鎮(zhèn)稻18”接種RSV組vs對(duì)照組5682456203253“武運(yùn)粳24”接種RSV組vs對(duì)照組5682528237291表1：“鎮(zhèn)稻18”和“武運(yùn)粳24”接種RSV后差異表達(dá)蛋白統(tǒng)計(jì)3.3差異蛋白的GO注釋分析利用GO數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)“鎮(zhèn)稻18”和“武運(yùn)粳24”接種RSV后篩選出的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行功能注釋，從分子功能、細(xì)胞組分和生物學(xué)過程三個(gè)層面分析差異蛋白的功能分布，結(jié)果見表2。在分子功能層面，“鎮(zhèn)稻18”接種RSV組與對(duì)照組相比，差異表達(dá)蛋白主要富集在催化活性、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)活性等功能類別。其中，催化活性相關(guān)蛋白占比35.2%，如一些參與氧化還原反應(yīng)的酶類蛋白，像超氧化物歧化酶（SOD），它能夠催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫，在植物應(yīng)對(duì)生物脅迫過程中，起到清除活性氧的重要作用，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。結(jié)合功能相關(guān)蛋白占比28.4%，例如一些核酸結(jié)合蛋白，可能參與了基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程，在RSV侵染后，通過與相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控抗病相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響水稻對(duì)RSV的抗性。轉(zhuǎn)運(yùn)活性相關(guān)蛋白占比12.3%，包括一些離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它們負(fù)責(zé)維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡，在病毒侵染時(shí)，可能通過調(diào)節(jié)離子的跨膜運(yùn)輸，影響細(xì)胞的生理功能和信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而參與水稻的抗病或感病過程?！拔溥\(yùn)粳24”接種RSV組與對(duì)照組相比，分子功能方面差異表達(dá)蛋白的富集情況與“鎮(zhèn)稻18”有一定相似性，但也存在差異。催化活性相關(guān)蛋白占比32.6%，其中參與碳水化合物代謝的酶類蛋白表達(dá)變化較為明顯，如淀粉酶，在RSV侵染后，其活性可能發(fā)生改變，影響水稻體內(nèi)碳水化合物的代謝，導(dǎo)致能量供應(yīng)和物質(zhì)合成受到影響，這可能是“武運(yùn)粳24”感病后生長(zhǎng)發(fā)育受阻的原因之一。結(jié)合功能相關(guān)蛋白占比30.1%，除了核酸結(jié)合蛋白外，一些與激素結(jié)合的蛋白表達(dá)量也發(fā)生顯著變化，如生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白，生長(zhǎng)素在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，RSV侵染導(dǎo)致生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白表達(dá)改變，可能會(huì)干擾生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)，影響植物的正常生長(zhǎng)和抗病能力。轉(zhuǎn)運(yùn)活性相關(guān)蛋白占比10.8%，與“鎮(zhèn)稻18”不同的是，“武運(yùn)粳24”中參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白變化更為顯著，氨基酸是蛋白質(zhì)合成的原料，其轉(zhuǎn)運(yùn)過程的異常可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的合成，進(jìn)而影響植物的生理功能。在細(xì)胞組分層面，“鎮(zhèn)稻18”差異表達(dá)蛋白主要分布在細(xì)胞、細(xì)胞器和細(xì)胞膜等組分。細(xì)胞組分相關(guān)蛋白占比42.1%，這些蛋白參與細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)維持和生理活動(dòng)，在RSV侵染后，它們的表達(dá)變化可能影響細(xì)胞的正常功能和結(jié)構(gòu)完整性。細(xì)胞器相關(guān)蛋白占比30.5%，其中葉綠體相關(guān)蛋白的表達(dá)變化尤為突出，如前面提到的捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白（LHC），在“鎮(zhèn)稻18”接種RSV后表達(dá)量下降，影響了葉綠體對(duì)光能的捕獲和傳遞，進(jìn)而影響光合作用。細(xì)胞膜相關(guān)蛋白占比15.7%，細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞的重要場(chǎng)所，病毒侵染后，細(xì)胞膜相關(guān)蛋白的變化可能影響病毒的侵入以及細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，例如一些膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)改變，可能影響病毒粒子或病毒相關(guān)物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸。“武運(yùn)粳24”在細(xì)胞組分層面，細(xì)胞組分相關(guān)蛋白占比45.3%，高于“鎮(zhèn)稻18”，這表明在RSV侵染下，“武運(yùn)粳24”細(xì)胞的整體結(jié)構(gòu)和功能受到的影響更為嚴(yán)重。細(xì)胞器相關(guān)蛋白占比28.6%，線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)變化顯著，如細(xì)胞色素c氧化酶（COX），其表達(dá)量下降，影響線粒體的電子傳遞和能量代謝，導(dǎo)致細(xì)胞能量供應(yīng)不足，這與“武運(yùn)粳24”感病后生長(zhǎng)緩慢、發(fā)病癥狀嚴(yán)重的現(xiàn)象相符。細(xì)胞膜相關(guān)蛋白占比13.9%，與“鎮(zhèn)稻18”類似，細(xì)胞膜相關(guān)蛋白的變化也與病毒的侵染和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)，但具體的蛋白種類和變化程度存在差異。在生物學(xué)過程層面，“鎮(zhèn)稻18”差異表達(dá)蛋白主要參與代謝過程、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞過程等。代謝過程相關(guān)蛋白占比38.6%，涵蓋了碳水化合物代謝、能量代謝、蛋白質(zhì)代謝等多個(gè)方面，在RSV侵染后，這些代謝過程的變化有助于水稻調(diào)整自身的生理狀態(tài)，以應(yīng)對(duì)病毒的脅迫。應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白占比22.5%，包括一些與植物免疫反應(yīng)相關(guān)的蛋白，如病程相關(guān)蛋白（PRs），它們?cè)谒镜挚筊SV侵染過程中發(fā)揮重要作用，通過誘導(dǎo)防御反應(yīng)，抑制病毒的增殖和擴(kuò)散。細(xì)胞過程相關(guān)蛋白占比18.3%，參與細(xì)胞分裂、分化、凋亡等過程，病毒侵染可能干擾這些細(xì)胞過程，影響水稻的生長(zhǎng)發(fā)育。“武運(yùn)粳24”生物學(xué)過程層面，代謝過程相關(guān)蛋白占比40.2%，其中能量代謝相關(guān)蛋白的變化更為顯著，如參與呼吸作用的一些酶類蛋白表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致能量產(chǎn)生減少，這進(jìn)一步解釋了“武運(yùn)粳24”感病后生長(zhǎng)受阻的原因。應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白占比18.7%，低于“鎮(zhèn)稻18”，說明“武運(yùn)粳24”在應(yīng)對(duì)RSV侵染時(shí)，其免疫反應(yīng)相對(duì)較弱，可能無法有效啟動(dòng)防御機(jī)制。細(xì)胞過程相關(guān)蛋白占比20.1%，與“鎮(zhèn)稻18”相比，“武運(yùn)粳24”中參與細(xì)胞凋亡的蛋白表達(dá)變化更為明顯，這可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加，加速了植株的發(fā)病進(jìn)程。功能分類“鎮(zhèn)稻18”接種RSV組vs對(duì)照組“武運(yùn)粳24”接種RSV組vs對(duì)照組分子功能催化活性（35.2%）、結(jié)合（28.4%）、轉(zhuǎn)運(yùn)活性（12.3%）等催化活性（32.6%）、結(jié)合（30.1%）、轉(zhuǎn)運(yùn)活性（10.8%）等細(xì)胞組分細(xì)胞（42.1%）、細(xì)胞器（30.5%）、細(xì)胞膜（15.7%）等細(xì)胞（45.3%）、細(xì)胞器（28.6%）、細(xì)胞膜（13.9%）等生物學(xué)過程代謝過程（38.6%）、應(yīng)激反應(yīng)（22.5%）、細(xì)胞過程（18.3%）等代謝過程（40.2%）、應(yīng)激反應(yīng)（18.7%）、細(xì)胞過程（20.1%）等表2：“鎮(zhèn)稻18”和“武運(yùn)粳24”接種RSV后差異表達(dá)蛋白的GO注釋分析3.4差異蛋白的KEGG注釋分析利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)“鎮(zhèn)稻18”和“武運(yùn)粳24”接種RSV后篩選出的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行代謝通路分析，以揭示這些蛋白在水稻生理代謝和信號(hào)傳導(dǎo)過程中的作用機(jī)制，結(jié)果見表3。在“鎮(zhèn)稻18”接種RSV組與對(duì)照組的比較中，差異表達(dá)蛋白顯著富集的通路主要包括光合作用、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、苯丙烷生物合成等。在光合作用通路中，多個(gè)關(guān)鍵蛋白的表達(dá)量發(fā)生變化，如光系統(tǒng)I反應(yīng)中心亞基II（PsaD）、光系統(tǒng)II放氧增強(qiáng)蛋白1（PsbO）等。PsaD蛋白表達(dá)量下調(diào)，它是光系統(tǒng)I的重要組成部分，參與光系統(tǒng)I中電子傳遞和能量轉(zhuǎn)換過程，其表達(dá)量的降低可能會(huì)影響光系統(tǒng)I的功能，導(dǎo)致光能捕獲和電子傳遞效率下降，進(jìn)而影響光合作用的光反應(yīng)階段。PsbO蛋白表達(dá)量也下調(diào)，它在光系統(tǒng)II中參與水的光解和氧氣的釋放，其表達(dá)變化可能會(huì)干擾光系統(tǒng)II的正常功能，進(jìn)一步影響光合作用的進(jìn)行。在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，與生長(zhǎng)素、水楊酸等激素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白表達(dá)量改變。例如，生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白IAA17表達(dá)量上調(diào)，生長(zhǎng)素在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗病過程中起著重要調(diào)節(jié)作用，IAA17的上調(diào)可能會(huì)影響生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)和抗病反應(yīng)。在苯丙烷生物合成通路中，一些關(guān)鍵酶蛋白的表達(dá)量變化明顯，如肉桂醇脫氫酶（CAD）表達(dá)量上調(diào)，CAD是苯丙烷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，參與木質(zhì)素的合成，其表達(dá)量的上調(diào)可能會(huì)促進(jìn)木質(zhì)素的合成，增強(qiáng)植物細(xì)胞壁的強(qiáng)度，從而提高植物對(duì)RSV的抗性。“武運(yùn)粳24”接種RSV組與對(duì)照組相比，差異表達(dá)蛋白顯著富集的通路有碳代謝、淀粉和蔗糖代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工等。在碳代謝通路中，多個(gè)參與糖酵解、三羧酸循環(huán)等過程的關(guān)鍵酶蛋白表達(dá)量發(fā)生改變。例如，磷酸甘油酸激酶（PGK）表達(dá)量下調(diào)，它在糖酵解過程中催化1,3-二磷酸甘油酸生成3-磷酸甘油酸，并產(chǎn)生ATP，其表達(dá)量的降低可能會(huì)影響糖酵解的進(jìn)行，導(dǎo)致能量產(chǎn)生減少，影響植物的正常生長(zhǎng)和代謝。在淀粉和蔗糖代謝通路中，淀粉合成酶（SS）表達(dá)量下調(diào)，蔗糖合成酶（SUS）表達(dá)量也下調(diào)，SS參與淀粉的合成，SUS則在蔗糖合成和分解過程中起重要作用，它們的表達(dá)量下降可能會(huì)導(dǎo)致淀粉和蔗糖的合成減少，影響植物的碳水化合物代謝和能量?jī)?chǔ)存。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路中，一些參與蛋白質(zhì)折疊、修飾和運(yùn)輸?shù)牡鞍妆磉_(dá)量變化顯著。例如，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）表達(dá)量上調(diào)，GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)量的上調(diào)表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到了病毒侵染的脅迫，可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的正常折疊和運(yùn)輸，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常生理功能。組別顯著富集的KEGG通路主要差異蛋白及變化“鎮(zhèn)稻18”接種RSV組vs對(duì)照組光合作用光系統(tǒng)I反應(yīng)中心亞基II（PsaD）下調(diào)、光系統(tǒng)II放氧增強(qiáng)蛋白1（PsbO）下調(diào)等植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白IAA17上調(diào)等苯丙烷生物合成肉桂醇脫氫酶（CAD）上調(diào)等“武運(yùn)粳24”接種RSV組vs對(duì)照組碳代謝磷酸甘油酸激酶（PGK）下調(diào)等淀粉和蔗糖代謝淀粉合成酶（SS）下調(diào)、蔗糖合成酶（SUS）下調(diào)等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）上調(diào)等表3：“鎮(zhèn)稻18”和“武運(yùn)粳24”接種RSV后差異表達(dá)蛋白的KEGG注釋分析3.5差異表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)錄水平分析為了進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果的可靠性，采用qRT-PCR方法對(duì)部分差異表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)。選取了10個(gè)在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中差異表達(dá)顯著的蛋白，包括5個(gè)上調(diào)表達(dá)蛋白和5個(gè)下調(diào)表達(dá)蛋白，分別來自“鎮(zhèn)稻18”和“武運(yùn)粳24”接種RSV組與對(duì)照組的比較。針對(duì)這10個(gè)差異表達(dá)蛋白的基因序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。引物設(shè)計(jì)完成后，通過NCBI的BLAST工具進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。取接種RSV后第14天的“鎮(zhèn)稻18”和“武運(yùn)粳24”水稻葉片，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以水稻的Actin基因作為內(nèi)參基因，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)和3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。采用2-ΔΔCt法計(jì)算差異表達(dá)基因的相對(duì)表達(dá)量。將qRT-PCR結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)大部分差異表達(dá)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平上的變化趨勢(shì)一致。例如，在“鎮(zhèn)稻18”中，蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示光系統(tǒng)I反應(yīng)中心亞基II（PsaD）表達(dá)量下調(diào)，qRT-PCR結(jié)果也表明其基因轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，相對(duì)表達(dá)量?jī)H為對(duì)照組的0.45倍，與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果相符。在“武運(yùn)粳24”中，淀粉合成酶（SS）在蛋白質(zhì)組學(xué)分析中表達(dá)量下調(diào)，qRT-PCR檢測(cè)其基因轉(zhuǎn)錄水平同樣顯著下降，相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的0.38倍，兩者變化趨勢(shì)一致。然而，也有少數(shù)差異表達(dá)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平上的變化趨勢(shì)存在差異。比如，在“鎮(zhèn)稻18”中，蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白IAA17表達(dá)量上調(diào)，而qRT-PCR結(jié)果顯示其基因轉(zhuǎn)錄水平無顯著變化。這種差異可能是由于轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制的影響，如mRNA的穩(wěn)定性、翻譯效率以及蛋白質(zhì)的降解速率等因素導(dǎo)致蛋白質(zhì)表達(dá)量與轉(zhuǎn)錄水平不一致?？傮w而言，qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果表明，蛋白質(zhì)組學(xué)分析所鑒定的差異表達(dá)蛋白具有較高的可靠性，大部分差異表達(dá)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平上的變化趨勢(shì)一致，為后續(xù)深入研究水稻在RSV脅迫下的抗性機(jī)制和感病機(jī)制提供了有力的數(shù)據(jù)支持。四、討論4.1水稻抗感品種對(duì)條紋病毒的響應(yīng)機(jī)制差異在本研究中，通過對(duì)水稻抗感品種在RSV脅迫下的蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)了兩者在響應(yīng)機(jī)制上存在顯著差異。這些差異主要體現(xiàn)在多個(gè)生理過程相關(guān)蛋白的表達(dá)變化上，反映了抗感品種在應(yīng)對(duì)RSV侵染時(shí)不同的策略和能力。在光合作用相關(guān)蛋白方面，抗感品種表現(xiàn)出明顯不同的變化趨勢(shì)。在抗病品種“鎮(zhèn)稻18”中，雖然一些光合作用關(guān)鍵蛋白如光系統(tǒng)I反應(yīng)中心亞基II（PsaD）、光系統(tǒng)II放氧增強(qiáng)蛋白1（PsbO）表達(dá)量有所下調(diào)，但仍維持在一定水平，這使得光合作用雖受影響，但不至于被完全抑制。這可能是“鎮(zhèn)稻18”的一種適應(yīng)性策略，在抵抗病毒侵染的同時(shí)，盡量保證光合作用的進(jìn)行，為植株提供必要的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。而在感病品種“武運(yùn)粳24”中，這些光合作用相關(guān)蛋白表達(dá)量急劇下降，幾乎接近于零。這表明“武運(yùn)粳24”在RSV侵染下，光合作用受到了嚴(yán)重破壞，無法正常進(jìn)行光反應(yīng)和碳同化過程，導(dǎo)致植物無法為自身生長(zhǎng)和發(fā)育提供足夠的能量和物質(zhì)，這是其發(fā)病癥狀嚴(yán)重、生長(zhǎng)受阻的重要原因之一。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在水稻抗感品種對(duì)RSV的響應(yīng)中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，且兩者存在明顯差異。在“鎮(zhèn)稻18”中，與生長(zhǎng)素、水楊酸等激素信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的蛋白表達(dá)量改變，如生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白IAA17表達(dá)量上調(diào)。生長(zhǎng)素在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗病過程中起著重要調(diào)節(jié)作用，IAA17的上調(diào)可能通過調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和抗病反應(yīng)。水楊酸信號(hào)通路的激活能夠誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白（PRs）等防御基因的表達(dá)，增強(qiáng)植物的抗病能力。而在“武運(yùn)粳24”中，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能受到了更嚴(yán)重的干擾。例如，與“鎮(zhèn)稻18”相比，“武運(yùn)粳24”中一些與激素結(jié)合的蛋白表達(dá)量發(fā)生顯著變化，如生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白，其表達(dá)改變可能會(huì)干擾生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)，影響植物的正常生長(zhǎng)和抗病能力。同時(shí)，“武運(yùn)粳24”中參與水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵蛋白NPR1（NonexpressorofPRgenes1）的表達(dá)量顯著低于“鎮(zhèn)稻18”，這可能導(dǎo)致水楊酸信號(hào)通路無法正常激活，病程相關(guān)蛋白（PRs）等防御基因的表達(dá)受到抑制，從而使得植株容易受到病毒侵害。碳代謝和能量代謝相關(guān)蛋白在抗感品種中的表達(dá)差異也十分顯著，深刻影響著兩者的抗病和感病表現(xiàn)。在“鎮(zhèn)稻18”中，雖然碳代謝和能量代謝相關(guān)通路受到RSV侵染的影響，但部分關(guān)鍵酶蛋白仍能維持一定的活性和表達(dá)水平，保證了基本的能量供應(yīng)和物質(zhì)代謝。例如，在糖酵解過程中，一些關(guān)鍵酶蛋白的表達(dá)雖有波動(dòng)，但仍能維持糖酵解的基本進(jìn)行，為細(xì)胞提供能量。而在“武運(yùn)粳24”中，碳代謝通路中多個(gè)參與糖酵解、三羧酸循環(huán)等過程的關(guān)鍵酶蛋白表達(dá)量發(fā)生顯著下調(diào)。以磷酸甘油酸激酶（PGK）為例，它在糖酵解過程中催化1,3-二磷酸甘油酸生成3-磷酸甘油酸，并產(chǎn)生ATP，其表達(dá)量的降低可能會(huì)影響糖酵解的進(jìn)行，導(dǎo)致能量產(chǎn)生減少，影響植物的正常生長(zhǎng)和代謝。在淀粉和蔗糖代謝通路中，“武運(yùn)粳24”的淀粉合成酶（SS）和蔗糖合成酶（SUS）表達(dá)量也下調(diào)，這可能會(huì)導(dǎo)致淀粉和蔗糖的合成減少，影響植物的碳水化合物代謝和能量?jī)?chǔ)存，進(jìn)一步加劇了植株的生長(zhǎng)受阻和發(fā)病癥狀。此外，在細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能維持相關(guān)蛋白方面，抗感品種也存在差異。在“鎮(zhèn)稻18”中，細(xì)胞、細(xì)胞器和細(xì)胞膜等相關(guān)蛋白的表達(dá)變化有助于維持細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)和功能完整性，在一定程度上抵御RSV的侵染。例如，一些細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)變化可能會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞的穩(wěn)定性，抵抗病毒侵染對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。而在“武運(yùn)粳24”中，這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能維持相關(guān)蛋白的表達(dá)變化更為劇烈，導(dǎo)致細(xì)胞的整體結(jié)構(gòu)和功能受到嚴(yán)重影響。如線粒體相關(guān)蛋白細(xì)胞色素c氧化酶（COX）表達(dá)量下降，影響線粒體的電子傳遞和能量代謝，導(dǎo)致細(xì)胞能量供應(yīng)不足，這與“武運(yùn)粳24”感病后生長(zhǎng)緩慢、發(fā)病癥狀嚴(yán)重的現(xiàn)象相符。細(xì)胞膜相關(guān)蛋白的變化也可能影響病毒的侵入以及細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)一步加劇了“武運(yùn)粳24”的感病程度。4.2誘導(dǎo)性抗病相關(guān)蛋白的功能與意義在水稻抵御RSV侵染的過程中，誘導(dǎo)性抗病相關(guān)蛋白發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，這些蛋白的功能和變化對(duì)于理解水稻的抗病機(jī)制以及開發(fā)新型抗病策略具有重要意義。病程相關(guān)蛋白（PRs）是一類典型的誘導(dǎo)性抗病相關(guān)蛋白，在水稻受到RSV侵染后被大量誘導(dǎo)表達(dá)。其中，PR-1蛋白作為系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）的分子標(biāo)記，其表達(dá)水平的升高表明水稻正在啟動(dòng)抗病反應(yīng)。雖然PR-1蛋白的具體功能尚未完全明確，但研究推測(cè)它可能參與了植物防御信號(hào)的傳導(dǎo)和放大過程。例如，在煙草中，PR-1蛋白能夠與一些防御相關(guān)的受體蛋白相互作用，激活下游的防御基因表達(dá)，從而增強(qiáng)植物對(duì)病原菌的抗性。在水稻抵御RSV侵染時(shí)，PR-1蛋白可能通過類似的機(jī)制，參與水稻的免疫信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，協(xié)調(diào)其他防御相關(guān)蛋白的表達(dá)和功能，共同抵御病毒的入侵。PR-2蛋白是β-1,3-葡聚糖酶，PR-3蛋白是幾丁質(zhì)酶，它們能夠直接作用于病原菌的細(xì)胞壁，降解細(xì)胞壁中的β-1,3-葡聚糖和幾丁質(zhì)成分。RSV雖無細(xì)胞壁，但在病毒侵染過程中，可能會(huì)誘導(dǎo)水稻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生一些類似病原菌細(xì)胞壁成分的物質(zhì)，或者干擾水稻細(xì)胞壁的正常代謝，而PR-2和PR-3蛋白可以通過降解這些物質(zhì)，維持細(xì)胞壁的完整性和穩(wěn)定性，從而限制病毒的擴(kuò)散。例如，在小麥?zhǔn)艿秸婢秩緯r(shí)，PR-2和PR-3蛋白能夠降解真菌細(xì)胞壁，抑制真菌的生長(zhǎng)和入侵。在水稻與RSV的互作中，這兩種蛋白可能通過類似的方式，對(duì)病毒侵染起到一定