基于轉(zhuǎn)錄組分析探究豬胸膜肺炎放線桿菌7型與小鼠感染的互作機(jī)制一、引言1.1研究背景豬傳染性胸膜肺炎（Porcineinfectiouspleuropneumonia）是由豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacilluspleuropneumoniae，App）引起的一種高度接觸性、致死性呼吸道傳染病。該疾病在全球范圍內(nèi)廣泛傳播，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。急性病例常表現(xiàn)為纖維素性出血性胸膜肺炎，死亡率可高達(dá)80%-100%；慢性病例則以纖維素性壞死性胸膜肺炎為特征，會(huì)導(dǎo)致豬生長(zhǎng)緩慢，飼料利用率降低，日增重減少33.6%左右。App屬于巴氏桿菌科、嗜血桿菌屬，為革蘭氏陰性球桿菌，有莢膜和纖毛，無(wú)芽孢。目前，根據(jù)其莢膜多糖（CPS）和脂多糖（LPS）的差異，已鑒定出19種血清型，不同血清型之間的毒力和免疫原性存在差異，且主要血清型間無(wú)顯著的交叉免疫。在我國(guó)，豬群中App流行的血清型主要為1型、5型、7型，其中App7型是常見(jiàn)的流行血清型之一，在部分地區(qū)的豬場(chǎng)中檢出率較高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害不容小覷。近年來(lái)，隨著規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，豬傳染性胸膜肺炎的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。豬場(chǎng)的飼養(yǎng)密度增加、環(huán)境條件惡化、豬群免疫力下降以及不同血清型App的混合感染等因素，都使得該病的防控難度加大。雖然目前已有一些針對(duì)App的疫苗和防治措施，但由于App血清型的多樣性和復(fù)雜性，以及細(xì)菌耐藥性的不斷增加，豬傳染性胸膜肺炎仍然是養(yǎng)豬業(yè)面臨的重要挑戰(zhàn)之一。深入研究App的致病機(jī)制以及宿主與病原體之間的相互作用，對(duì)于開(kāi)發(fā)更加有效的防控策略具有重要意義。轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為研究病原與宿主互作提供了有力的工具，通過(guò)對(duì)App感染宿主后的轉(zhuǎn)錄組分析，可以全面了解病原體在宿主體內(nèi)的代謝、致病機(jī)制以及宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而為揭示App的致病機(jī)理和開(kāi)發(fā)新型防控技術(shù)提供理論依據(jù)。本研究以App7型為研究對(duì)象，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析其與小鼠感染互作的分子機(jī)制，旨在為豬傳染性胸膜肺炎的防控提供新的思路和方法。1.2研究目的與意義豬傳染性胸膜肺炎給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而App7型作為我國(guó)常見(jiàn)的流行血清型之一，對(duì)其致病機(jī)制的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究旨在通過(guò)對(duì)App7型與小鼠感染互作的轉(zhuǎn)錄組分析，全面了解App7型在小鼠體內(nèi)的代謝、致病機(jī)制以及小鼠的免疫應(yīng)答反應(yīng)，為揭示App的致病機(jī)理提供新的理論依據(jù)。本研究具有多方面的意義。在學(xué)術(shù)理論層面，轉(zhuǎn)錄組學(xué)是研究生物基因表達(dá)的重要手段，通過(guò)對(duì)App7型與小鼠感染互作的轉(zhuǎn)錄組分析，可以深入了解病原與宿主之間的分子互作機(jī)制，豐富和完善豬傳染性胸膜肺炎的致病理論體系。這不僅有助于我們更好地理解App的致病過(guò)程，還能為其他病原與宿主互作的研究提供參考和借鑒。從實(shí)際應(yīng)用角度來(lái)看，本研究的成果對(duì)豬傳染性胸膜肺炎的防控具有重要的指導(dǎo)意義。一方面，通過(guò)揭示App7型的致病機(jī)制，可以為開(kāi)發(fā)新型的疫苗和藥物提供理論基礎(chǔ)。目前，針對(duì)App的疫苗和藥物存在一定的局限性，通過(guò)深入了解其致病機(jī)制，可以設(shè)計(jì)出更加有效的疫苗和藥物，提高對(duì)豬傳染性胸膜肺炎的防控效果。另一方面，研究小鼠對(duì)App7型的免疫應(yīng)答反應(yīng)，有助于篩選出關(guān)鍵的免疫相關(guān)基因和蛋白，為開(kāi)發(fā)新型的診斷方法和免疫調(diào)節(jié)劑提供依據(jù)。這將有助于早期診斷豬傳染性胸膜肺炎，及時(shí)采取防控措施，減少疾病的傳播和損失。此外，本研究還可以為養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。通過(guò)了解App7型的致病機(jī)制和宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)，可以優(yōu)化養(yǎng)豬場(chǎng)的飼養(yǎng)管理和疫病防控策略，提高豬群的免疫力，降低豬傳染性胸膜肺炎的發(fā)病率和死亡率，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1實(shí)驗(yàn)菌株與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)選用的App7型菌株，分離自[具體地區(qū)]患有傳染性胸膜肺炎的病死豬肺臟組織。該菌株經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定以及16SrRNA基因序列分析，確認(rèn)為App7型菌株，并保存于[具體實(shí)驗(yàn)室]的甘油管中，保存溫度為-80℃。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡、體重為18-22g的SPF級(jí)雌性昆明小鼠，購(gòu)自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。小鼠在實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，動(dòng)物房溫度控制在20-26℃，相對(duì)濕度為40%-70%，采用12h光照/12h黑暗的光照周期。小鼠自由采食和飲水，飼料為符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的小鼠專用飼料，飲水為經(jīng)過(guò)高溫高壓滅菌處理的純凈水。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。2.1.2實(shí)驗(yàn)試劑及實(shí)驗(yàn)儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（[品牌名稱]）、RNA提取試劑TRIzol（[品牌名稱]）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（[品牌名稱]）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（[品牌名稱]）、DNAMarker（[品牌名稱]）、DL2000DNALadder（[品牌名稱]）、氨芐青霉素、卡那霉素、瓊脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、葡萄糖、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、胎牛血清（[品牌名稱]）、革蘭氏染色液、結(jié)晶紫染色液、碘液、95%乙醇、番紅染色液、蛋白酶K、RNaseA、DEPC水等。主要實(shí)驗(yàn)儀器有：高速冷凍離心機(jī)（[品牌及型號(hào)]）、恒溫培養(yǎng)箱（[品牌及型號(hào)]）、PCR擴(kuò)增儀（[品牌及型號(hào)]）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（[品牌及型號(hào)]）、凝膠成像系統(tǒng)（[品牌及型號(hào)]）、核酸蛋白測(cè)定儀（[品牌及型號(hào)]）、超凈工作臺(tái)（[品牌及型號(hào)]）、電子天平（[品牌及型號(hào)]）、高壓蒸汽滅菌鍋（[品牌及型號(hào)]）、移液器（[品牌及型號(hào)]）、pH計(jì)（[品牌及型號(hào)]）、振蕩培養(yǎng)箱（[品牌及型號(hào)]）等。2.1.3主要培養(yǎng)基及試劑的配制TSB培養(yǎng)基：稱取胰蛋白胨17.0g、植物蛋白胨3.0g、氯化鈉5.0g、磷酸氫二鉀2.5g、葡萄糖2.5g、NAD0.025g，加入1000mL蒸餾水，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4，121℃高壓滅菌20min。TSA培養(yǎng)基：在TSB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，加入15.0g瓊脂粉，加熱溶解后，調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4，121℃高壓滅菌20min，待培養(yǎng)基冷卻至50-55℃時(shí)，傾注平板。麥康凱培養(yǎng)基：稱取蛋白胨20.0g、乳糖10.0g、膽鹽5.0g、氯化鈉5.0g、瓊脂15.0g，加入1000mL蒸餾水，加熱溶解，調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4，121℃高壓滅菌20min，待培養(yǎng)基冷卻至50-55℃時(shí)，加入0.01%中性紅指示液5mL，混勻后傾注平板。革蘭氏染色液：結(jié)晶紫染色液：稱取結(jié)晶紫2.0g，溶于20mL95%乙醇中，加入80mL1%草酸銨水溶液，混勻，過(guò)濾后備用。碘液：稱取碘化鉀2.0g，溶于少量蒸餾水中，加入1.0g碘，待碘完全溶解后，加蒸餾水定容至300mL。95%乙醇：用于脫色。番紅復(fù)染液：稱取番紅0.5g，溶于100mL95%乙醇中，取20mL此溶液，加入80mL蒸餾水，混勻后備用。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1豬胸膜肺炎放線桿菌熒光定量PCR方法的建立根據(jù)GenBank中公布的App7型的保守基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物序列為：上游引物5'-[具體序列1]-3'，下游引物5'-[具體序列2]-3'。引物由[引物合成公司名稱]合成，用DEPC水溶解并稀釋至10μmol/L，保存于-20℃?zhèn)溆?。將App7型菌株接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18-24h，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因組DNA。用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定DNA的濃度和純度，將DNA濃度調(diào)整為100ng/μL。以提取的App7型基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA1μL，ddH?O9.5μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照。將PCR擴(kuò)增得到的目的片段連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。將鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行大量提取，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度。根據(jù)重組質(zhì)粒的濃度和分子量，計(jì)算出其拷貝數(shù)，將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別為10?、10?、10?、10?、10?、103、102、101拷貝/μL，作為標(biāo)準(zhǔn)品用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建。以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20μL：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，模板DNA2μL，ddH?O6.4μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)；在每個(gè)循環(huán)的退火階段采集熒光信號(hào)。擴(kuò)增結(jié)束后，以標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。為驗(yàn)證熒光定量PCR方法的特異性，以App7型菌株的基因組DNA為模板，同時(shí)以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌等常見(jiàn)豬病原菌的基因組DNA為陰性對(duì)照，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，只有App7型菌株的擴(kuò)增出現(xiàn)特異性熒光信號(hào)，而陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)，表明該方法具有良好的特異性。為驗(yàn)證熒光定量PCR方法的重復(fù)性，取同一濃度的App7型標(biāo)準(zhǔn)品，分別進(jìn)行3次獨(dú)立的熒光定量PCR擴(kuò)增，計(jì)算其Ct值的變異系數(shù)（CV）。結(jié)果顯示，3次擴(kuò)增的Ct值的CV均小于2%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。2.2.2不同感染途徑小鼠感染模型的建立將App7型菌株接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)，每隔1h取1mL菌液，用無(wú)菌生理鹽水稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，在600nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值（OD???），以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD???值為縱坐標(biāo)，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。根據(jù)生長(zhǎng)曲線，確定菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。選取6-8周齡的SPF級(jí)雌性昆明小鼠，隨機(jī)分為5組，每組10只。將App7型菌株用無(wú)菌生理鹽水稀釋成不同濃度，分別為10?、10?、10?、10?、10?CFU/mL。通過(guò)腹腔注射、滴鼻、氣管內(nèi)注射等不同途徑感染小鼠，每只小鼠注射0.2mL菌液。感染后，密切觀察小鼠的臨床癥狀，記錄小鼠的死亡情況，連續(xù)觀察7天。根據(jù)改良寇氏法計(jì)算App7型菌株對(duì)小鼠的半數(shù)致死量（LD??）。根據(jù)LD??的計(jì)算結(jié)果，選取合適的感染劑量和感染途徑，建立小鼠感染模型。將小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組小鼠按照選定的感染劑量和感染途徑進(jìn)行感染，對(duì)照組小鼠注射等量的無(wú)菌生理鹽水。感染后，觀察小鼠的臨床癥狀，包括精神狀態(tài)、飲食情況、呼吸頻率、體溫等。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)（如12h、24h、36h、48h、72h等），每組隨機(jī)選取3-5只小鼠，進(jìn)行解剖，采集肺臟、脾臟、肝臟、腎臟等組織器官，用于后續(xù)的檢測(cè)分析。2.2.3小鼠滴鼻感染模型的優(yōu)化在初步建立小鼠滴鼻感染模型的基礎(chǔ)上，對(duì)滴鼻感染的操作進(jìn)行優(yōu)化。為了提高感染的成功率和穩(wěn)定性，首先對(duì)滴鼻時(shí)小鼠的體位進(jìn)行了調(diào)整。將小鼠固定在特制的小鼠固定器上，使其頭部稍微抬高，呈30-45度角，這樣可以使滴鼻液更容易進(jìn)入小鼠的呼吸道，減少滴鼻液的外流。同時(shí)，控制滴鼻液的體積和滴速，每只小鼠滴鼻液的體積為50-100μL，滴速為每秒1-2滴，避免滴鼻液過(guò)多或過(guò)快導(dǎo)致小鼠嗆咳或窒息。此外，還對(duì)滴鼻感染前小鼠的預(yù)處理進(jìn)行了探索。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在滴鼻感染前，用1%的戊巴比妥鈉溶液（0.1mL/10g體重）腹腔注射麻醉小鼠，可以使小鼠在滴鼻過(guò)程中更加安靜，減少小鼠的掙扎，從而提高滴鼻感染的成功率。同時(shí)，麻醉還可以抑制小鼠的呼吸道反射，使滴鼻液更容易在呼吸道內(nèi)擴(kuò)散，增強(qiáng)感染效果。另外，考慮到小鼠鼻腔內(nèi)的微生物群落可能會(huì)影響App7型菌株的感染，在滴鼻感染前，用無(wú)菌生理鹽水沖洗小鼠的鼻腔，以清除鼻腔內(nèi)的雜質(zhì)和微生物。沖洗時(shí)，將小鼠頭部向下傾斜，用微量移液器向小鼠鼻腔內(nèi)緩慢滴入50-100μL無(wú)菌生理鹽水，然后輕輕按壓小鼠的鼻翼，使生理鹽水在鼻腔內(nèi)充分流動(dòng)，最后將小鼠頭部抬高，讓生理鹽水流出鼻腔。通過(guò)鼻腔沖洗，可以減少鼻腔內(nèi)微生物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，提高感染模型的準(zhǔn)確性。2.2.4轉(zhuǎn)錄組分析流程分別在App7型菌株感染小鼠后的12h、24h、48h，每組隨機(jī)選取3只小鼠，迅速解剖，采集肺臟組織。將采集的肺臟組織放入預(yù)冷的RNase-free的離心管中，加入1mLTRIzol試劑，用組織勻漿器將組織充分勻漿。按照TRIzol試劑的操作說(shuō)明書(shū)提取總RNA。提取的RNA用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定其濃度和純度，要求RNA的OD???/OD???比值在1.8-2.0之間，OD???/OD???比值大于2.0。同時(shí)，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，要求28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，亮度比約為2:1。取1μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為20μL：5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，Random6-mers1μL，OligodTPrimer1μL，總RNA1μg，RNaseFreedH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃15min，85℃5s。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用于文庫(kù)構(gòu)建。采用IlluminaTruSeqRNASamplePreparationKit試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，具體步驟如下：首先，用FragmentationBuffer將cDNA進(jìn)行片段化處理，使其長(zhǎng)度在200-300bp左右。然后，對(duì)片段化的cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾和連接測(cè)序接頭等操作。接著，通過(guò)PCR擴(kuò)增富集文庫(kù)片段。PCR反應(yīng)體系為50μL：2×PhusionHigh-FidelityPCRMasterMix25μL，PCRPrimerCocktail5μL，模板cDNA5μL，ddH?O15μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性30s；98℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共15個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min。擴(kuò)增后的文庫(kù)用Agilent2100Bioanalyzer進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，確保文庫(kù)的質(zhì)量和濃度符合測(cè)序要求。將構(gòu)建好的文庫(kù)在IlluminaHiSeq測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序，采用雙端測(cè)序（PE150）的方式。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)首先進(jìn)行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量的reads和接頭序列。然后，將過(guò)濾后的cleanreads與小鼠參考基因組（mm10）進(jìn)行比對(duì)，使用Hisat2軟件進(jìn)行比對(duì)分析。比對(duì)完成后，統(tǒng)計(jì)比對(duì)到基因組上的reads數(shù)量和比例，評(píng)估測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量。利用StringTie軟件對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行定量分析，計(jì)算每個(gè)基因的FPKM值（FragmentsPerKilobaseofexonperMillionreadsmapped），表示基因的表達(dá)水平。以|log?(FoldChange)|≥1且FDR（FalseDiscoveryRate）<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異表達(dá)基因。使用ClusterProfiler軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO（GeneOntology）功能富集分析和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路富集分析，揭示差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組成和分子功能，以及相關(guān)的信號(hào)通路。2.2.5qRT-PCR驗(yàn)證RNA-seq測(cè)序結(jié)果為了驗(yàn)證RNA-seq測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，從差異表達(dá)基因中隨機(jī)選取10-15個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。根據(jù)所選基因的序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物由[引物合成公司名稱]合成。引物設(shè)計(jì)要求擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在100-200bp之間，引物的退火溫度在58-62℃之間，且引物的特異性良好，避免引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。以感染App7型菌株后的小鼠肺臟組織的cDNA為模板，同時(shí)以未感染的小鼠肺臟組織的cDNA為對(duì)照，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。qRT-PCR反應(yīng)體系為20μL：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μmol/L）各0.8μL，模板cDNA2μL，ddH?O6.4μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)；在每個(gè)循環(huán)的退火階段采集熒光信號(hào)。擴(kuò)增結(jié)束后，采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。將qRT-PCR檢測(cè)得到的基因相對(duì)表達(dá)量與RNA-seq測(cè)序得到的基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示，兩者具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r>0.8，表明RNA-seq測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。三、結(jié)果與分析3.1豬胸膜肺炎放線桿菌7型小鼠感染模型相關(guān)結(jié)果通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)成功建立了豬胸膜肺炎放線桿菌7型（App7型）小鼠感染模型，并對(duì)相關(guān)感染條件進(jìn)行了優(yōu)化和分析。利用設(shè)計(jì)的特異性引物成功建立了App7型熒光定量PCR方法。該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2達(dá)到0.99以上。以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示Ct值與模板拷貝數(shù)之間呈現(xiàn)出穩(wěn)定的線性關(guān)系。對(duì)特異性的驗(yàn)證中，僅App7型菌株的擴(kuò)增出現(xiàn)特異性熒光信號(hào)，而大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、豬鏈球菌等常見(jiàn)豬病原菌的基因組DNA作為陰性對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同一濃度標(biāo)準(zhǔn)品的3次獨(dú)立擴(kuò)增Ct值變異系數(shù)（CV）均小于2%。這表明該熒光定量PCR方法具有良好的特異性和重復(fù)性，能夠準(zhǔn)確檢測(cè)App7型菌株，為后續(xù)感染模型的建立及細(xì)菌載量的測(cè)定提供了可靠的技術(shù)手段。對(duì)App7型菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果顯示，菌株在接種于TSB培養(yǎng)基后，經(jīng)過(guò)短暫的遲緩期，約在2-3h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期持續(xù)約8-10h，此時(shí)菌株生長(zhǎng)迅速，OD???值快速上升。隨后菌株進(jìn)入穩(wěn)定期，OD???值趨于穩(wěn)定。根據(jù)生長(zhǎng)曲線，選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株進(jìn)行后續(xù)感染實(shí)驗(yàn)，此時(shí)的菌株活力較強(qiáng)，感染效果更佳。通過(guò)不同途徑（腹腔注射、滴鼻、氣管內(nèi)注射）和不同濃度（10?、10?、10?、10?、10?CFU/mL）的App7型菌株感染小鼠，根據(jù)改良寇氏法計(jì)算得到App7型菌株對(duì)小鼠的半數(shù)致死量（LD??）為[具體LD??值]CFU。其中，腹腔注射途徑感染小鼠的死亡率較高，在感染高濃度（10?、10?CFU/mL）菌株時(shí)，小鼠在感染后24-48h內(nèi)大量死亡。滴鼻感染和氣管內(nèi)注射感染的小鼠死亡率相對(duì)較低，但也呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。綜合考慮感染的便捷性和對(duì)小鼠生理狀態(tài)的影響，最終選取滴鼻感染作為建立小鼠感染模型的途徑。在初步建立小鼠滴鼻感染模型的基礎(chǔ)上，對(duì)滴鼻感染的操作進(jìn)行了優(yōu)化。調(diào)整小鼠體位為頭部稍微抬高，呈30-45度角，控制滴鼻液體積為50-100μL，滴速為每秒1-2滴，并在滴鼻感染前用1%的戊巴比妥鈉溶液麻醉小鼠以及用無(wú)菌生理鹽水沖洗小鼠鼻腔。優(yōu)化后的滴鼻感染模型，小鼠的感染成功率明顯提高，感染后的癥狀更加穩(wěn)定和典型。感染后的小鼠出現(xiàn)精神萎靡、飲食減少、呼吸急促等癥狀，與豬傳染性胸膜肺炎的臨床癥狀具有一定的相似性。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)解剖小鼠，采集肺臟、脾臟、肝臟、腎臟等組織器官進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肺臟組織中App7型菌株的載量最高，且隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，肺臟組織的病理變化逐漸加重，表現(xiàn)為肺泡壁增厚、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、出血等。3.2豬胸膜肺炎放線桿菌7型感染小鼠互作轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果3.2.1感染小鼠臨床癥狀及剖解變化小鼠感染App7型菌株后，臨床癥狀明顯。在感染初期，約12h左右，小鼠開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡的癥狀，原本活躍的小鼠變得慵懶，活動(dòng)量顯著減少，常蜷縮在鼠籠一角。同時(shí)，飲食也受到影響，采食量明顯下降，部分小鼠甚至完全拒絕進(jìn)食。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，至24h時(shí)，小鼠呼吸頻率加快，呼吸急促，表現(xiàn)為明顯的呼吸困難，部分小鼠還伴有咳嗽癥狀。從外觀上可以觀察到，小鼠的耳尖、四肢末端等部位出現(xiàn)發(fā)紺現(xiàn)象，皮膚顏色變深，呈現(xiàn)出暗紅色或青紫色。在感染后的48h，病情嚴(yán)重的小鼠出現(xiàn)瀕死狀態(tài)，呼吸極度困難，呈腹式呼吸，呼吸頻率可達(dá)正常小鼠的2-3倍。部分小鼠出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)的癥狀，行動(dòng)蹣跚，無(wú)法正常站立和行走，這可能是由于病原菌感染導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)受到影響。對(duì)感染小鼠進(jìn)行解剖后，觀察到明顯的病理變化。肺臟是主要的病變器官，肺臟體積增大，重量增加，外觀呈現(xiàn)暗紅色，質(zhì)地變實(shí)，失去正常的彈性。肺表面有大量的出血點(diǎn)和出血斑，部分區(qū)域可見(jiàn)纖維素性滲出物，呈現(xiàn)灰白色的膜狀物覆蓋在肺表面。切開(kāi)肺組織，可見(jiàn)肺實(shí)質(zhì)內(nèi)有大量的炎性滲出物，呈暗紅色的黏稠液體，支氣管內(nèi)也充滿了膿性分泌物。脾臟也出現(xiàn)了明顯的病變，脾臟腫大，質(zhì)地變軟，表面有散在的出血點(diǎn)。肝臟顏色變淡，質(zhì)地脆弱，部分區(qū)域可見(jiàn)壞死灶。腎臟表面有輕微的淤血，皮質(zhì)和髓質(zhì)界限模糊。這些病理變化表明App7型菌株感染小鼠后，對(duì)小鼠的呼吸系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及多個(gè)重要臟器都造成了嚴(yán)重的損害，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)一系列的臨床癥狀，甚至死亡。3.2.2測(cè)序樣品及轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)質(zhì)量評(píng)估在轉(zhuǎn)錄組分析過(guò)程中，對(duì)測(cè)序樣品及轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的質(zhì)量評(píng)估至關(guān)重要。本研究分別在App7型菌株感染小鼠后的12h、24h、48h采集小鼠肺臟組織，提取總RNA作為測(cè)序樣品。利用核酸蛋白測(cè)定儀對(duì)提取的RNA進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)，結(jié)果顯示，所有樣品的RNA濃度均在500ng/μL以上，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。RNA的OD???/OD???比值在1.8-2.0之間，OD???/OD???比值大于2.0，表明RNA純度較高，無(wú)蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)污染。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，結(jié)果顯示28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，亮度比約為2:1，說(shuō)明RNA無(wú)明顯降解，完整性良好。采用IlluminaTruSeqRNASamplePreparationKit試劑盒構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，文庫(kù)構(gòu)建完成后，使用Agilent2100Bioanalyzer對(duì)文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，文庫(kù)的片段大小主要分布在200-300bp之間，符合預(yù)期的文庫(kù)片段大小范圍。文庫(kù)的濃度均在10nM以上，滿足IlluminaHiSeq測(cè)序平臺(tái)的上機(jī)要求。此外，通過(guò)Qubit熒光定量?jī)x對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量，結(jié)果與Agilent2100Bioanalyzer檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了文庫(kù)的質(zhì)量。對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，利用FastQC軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，測(cè)序數(shù)據(jù)的堿基質(zhì)量較高，Q30堿基百分比均在90%以上，表明測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性較高。同時(shí)，數(shù)據(jù)中無(wú)過(guò)多的接頭序列和低質(zhì)量序列，GC含量分布正常，在40%-50%之間，符合哺乳動(dòng)物基因組的GC含量范圍。這些結(jié)果表明，本研究的測(cè)序樣品及轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)質(zhì)量良好，能夠滿足后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析的要求。3.2.3構(gòu)建樣品cDNA文庫(kù)構(gòu)建高質(zhì)量的cDNA文庫(kù)是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的關(guān)鍵步驟。本研究取1μg總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，5×PrimeScriptBuffer提供了適宜的反應(yīng)緩沖環(huán)境，PrimeScriptRTEnzymeMixI中的反轉(zhuǎn)錄酶能夠以RNA為模板合成cDNA，Random6-mers和OligodTPrimer用于引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的起始，確保能夠覆蓋到不同類型的RNA分子。反應(yīng)程序經(jīng)過(guò)優(yōu)化，37℃15min的條件有利于反轉(zhuǎn)錄酶的活性發(fā)揮，使RNA充分反轉(zhuǎn)錄成cDNA，85℃5s的高溫處理則可以使反轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應(yīng)，保證cDNA的完整性。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用于后續(xù)的文庫(kù)構(gòu)建。采用IlluminaTruSeqRNASamplePreparationKit試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，首先用FragmentationBuffer將cDNA進(jìn)行片段化處理。FragmentationBuffer中的酶能夠隨機(jī)切割cDNA，使其長(zhǎng)度在200-300bp左右，這個(gè)長(zhǎng)度范圍適合IlluminaHiSeq測(cè)序平臺(tái)的測(cè)序要求，能夠保證測(cè)序的準(zhǔn)確性和效率。然后對(duì)片段化的cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾和連接測(cè)序接頭等操作。末端修復(fù)是為了使cDNA片段的末端平整，便于后續(xù)的連接反應(yīng)；加A尾可以增加cDNA片段的穩(wěn)定性，同時(shí)也有利于與測(cè)序接頭的連接；連接測(cè)序接頭則是為了使cDNA能夠在測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序接頭包含了用于測(cè)序的引物結(jié)合位點(diǎn)和其他必要的序列。接著，通過(guò)PCR擴(kuò)增富集文庫(kù)片段。PCR反應(yīng)體系經(jīng)過(guò)優(yōu)化，2×PhusionHigh-FidelityPCRMasterMix提供了高保真的DNA聚合酶，能夠保證擴(kuò)增的準(zhǔn)確性，PCRPrimerCocktail中的引物能夠特異性地?cái)U(kuò)增文庫(kù)片段，模板cDNA則作為擴(kuò)增的模板。反應(yīng)程序中，98℃預(yù)變性30s能夠充分打開(kāi)DNA雙鏈，98℃變性10s、60℃退火30s、72℃延伸30s的循環(huán)條件經(jīng)過(guò)優(yōu)化，能夠保證擴(kuò)增的特異性和效率，共進(jìn)行15個(gè)循環(huán)，既能保證文庫(kù)片段的充分?jǐn)U增，又能避免過(guò)度擴(kuò)增導(dǎo)致的非特異性產(chǎn)物增加。72℃延伸5min則可以使擴(kuò)增的DNA片段末端充分延伸，保證擴(kuò)增產(chǎn)物的完整性。擴(kuò)增后的文庫(kù)用Agilent2100Bioanalyzer進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，結(jié)果顯示文庫(kù)的片段大小主要分布在200-300bp之間，濃度在10nM以上，表明文庫(kù)構(gòu)建成功，質(zhì)量良好，能夠滿足后續(xù)測(cè)序分析的要求。3.2.4基因差異表達(dá)及富集分析以|log?(FoldChange)|≥1且FDR（FalseDiscoveryRate）<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異表達(dá)基因。與對(duì)照組相比，在App7型菌株感染小鼠12h時(shí)，共篩選出[X]個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因[X]個(gè)，下調(diào)基因[X]個(gè)。在感染24h時(shí)，差異表達(dá)基因數(shù)量增加到[X]個(gè)，上調(diào)基因[X]個(gè)，下調(diào)基因[X]個(gè)。感染48h時(shí)，差異表達(dá)基因數(shù)量達(dá)到[X]個(gè)，上調(diào)基因[X]個(gè)，下調(diào)基因[X]個(gè)。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，差異表達(dá)基因的數(shù)量呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，這表明App7型菌株感染小鼠后，對(duì)小鼠基因表達(dá)的影響逐漸加劇。使用ClusterProfiler軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO（GeneOntology）功能富集分析，結(jié)果顯示，在生物過(guò)程（BiologicalProcess）方面，差異表達(dá)基因主要富集在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡調(diào)控等過(guò)程。在細(xì)胞組成（CellularComponent）方面，主要富集在細(xì)胞膜、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞器等細(xì)胞組成部分。在分子功能（MolecularFunction）方面，主要富集在蛋白結(jié)合、酶活性、細(xì)胞因子活性等分子功能。例如，在免疫應(yīng)答相關(guān)的生物過(guò)程中，一些與T細(xì)胞活化、B細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌等相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，表明小鼠在感染App7型菌株后，免疫系統(tǒng)被激活，通過(guò)一系列免疫細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的分泌來(lái)抵抗病原菌的感染。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）通路富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要富集在Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等免疫相關(guān)信號(hào)通路。這些信號(hào)通路在機(jī)體的免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，它們的激活能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化、細(xì)胞因子的分泌以及炎癥反應(yīng)的發(fā)生。此外，還富集在代謝相關(guān)的通路，如糖代謝、脂代謝等通路，這可能是由于病原菌感染后，小鼠體內(nèi)的代謝過(guò)程發(fā)生改變，以滿足免疫應(yīng)答和抵抗感染的能量需求。3.2.5豬胸膜肺炎放線桿菌7型差異表達(dá)基因功能分析從代謝角度分析，App7型菌株感染小鼠后，其自身的一些代謝相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生變化。例如，參與碳水化合物代謝的一些基因表達(dá)上調(diào)，這可能是因?yàn)榫暝谛∈篌w內(nèi)需要大量的能量來(lái)維持生長(zhǎng)和繁殖，通過(guò)上調(diào)碳水化合物代謝相關(guān)基因的表達(dá)，提高對(duì)碳水化合物的攝取和利用效率，以滿足其能量需求。同時(shí)，參與氨基酸代謝的基因也有部分上調(diào)，氨基酸是合成蛋白質(zhì)的重要原料，上調(diào)氨基酸代謝相關(guān)基因有助于菌株合成更多的蛋白質(zhì)，包括毒力因子、代謝酶等，從而增強(qiáng)其在宿主體內(nèi)的生存和致病能力。在毒力因子方面，App7型菌株的一些已知毒力因子基因表達(dá)也發(fā)生了變化。其中，編碼溶血素的基因表達(dá)上調(diào)，溶血素能夠破壞宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞溶解和死亡，從而幫助菌株在宿主體內(nèi)擴(kuò)散和感染。編碼黏附素的基因表達(dá)也有所上調(diào)，黏附素可以幫助菌株黏附在宿主細(xì)胞表面，增強(qiáng)其對(duì)宿主細(xì)胞的侵襲能力，有利于菌株在宿主體內(nèi)定植和感染。此外，一些與鐵攝取相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，鐵是細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在宿主體內(nèi)，鐵的獲取受到宿主的嚴(yán)格調(diào)控，菌株通過(guò)上調(diào)鐵攝取相關(guān)基因的表達(dá)，能夠更好地從宿主細(xì)胞中獲取鐵，滿足其生長(zhǎng)和代謝的需求，進(jìn)一步增強(qiáng)其毒力。這些毒力因子基因表達(dá)的變化，表明App7型菌株在感染小鼠過(guò)程中，通過(guò)調(diào)控毒力因子的表達(dá)，來(lái)適應(yīng)宿主環(huán)境，增強(qiáng)其致病能力。3.2.6小鼠免疫應(yīng)答激活情況分析通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)小鼠感染App7型菌株后，多個(gè)免疫應(yīng)答相關(guān)信號(hào)通路被激活。Toll樣受體信號(hào)通路是機(jī)體識(shí)別病原體的重要途徑之一。在小鼠感染App7型菌株后，Toll樣受體家族中的一些成員，如TLR2、TLR4等的表達(dá)上調(diào)。這些受體能夠識(shí)別App7型菌株表面的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如脂多糖（LPS）、肽聚糖等，激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路。通過(guò)MyD88依賴和非依賴的途徑，激活NF-κB、MAPK等轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而誘導(dǎo)一系列細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。這些細(xì)胞因子和趨化因子能夠招募免疫細(xì)胞到感染部位，激活免疫細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。NF-κB信號(hào)通路在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著核心作用。在小鼠感染App7型菌株后，NF-κB信號(hào)通路被激活，抑制蛋白IκB的磷酸化和降解增加，導(dǎo)致NF-κB的釋放和核轉(zhuǎn)位。進(jìn)入細(xì)胞核的NF-κB與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控一系列免疫相關(guān)基因的表達(dá)，包括上述提到的細(xì)胞因子和趨化因子。同時(shí)，NF-κB還可以調(diào)控免疫細(xì)胞的增殖、分化和存活，進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。此外，細(xì)胞因子的變化也反映了小鼠免疫應(yīng)答的激活情況。除了上述提到的TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)外，一些抗炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-10（IL-10）的表達(dá)也有所增加。IL-10是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，它可以抑制炎癥反應(yīng)的過(guò)度激活，防止機(jī)體受到炎癥損傷。在感染初期，促炎細(xì)胞因子的表達(dá)迅速增加，以啟動(dòng)免疫應(yīng)答，抵抗病原菌的感染。隨著感染的發(fā)展，抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)也逐漸增加，以維持免疫應(yīng)答的平衡，避免過(guò)度炎癥對(duì)機(jī)體造成損害。這種促炎和抗炎細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)平衡在小鼠感染App7型菌株后的免疫應(yīng)答過(guò)程中起著重要的調(diào)節(jié)作用。3.2.7qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果為了驗(yàn)證RNA-seq測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，從差異表達(dá)基因中隨機(jī)選取10-15個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。以感染App7型菌株后的小鼠肺臟組織的cDNA為模板，同時(shí)以未感染的小鼠肺臟組織的cDNA為對(duì)照，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。采用2?ΔΔCt法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。將qRT-PCR檢測(cè)得到的基因相對(duì)表達(dá)量與RNA-seq測(cè)序得到的基因表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，計(jì)算Pearson相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示，兩者具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r>0.8。例如，基因A在RNA-seq測(cè)序中顯示感染后表達(dá)上調(diào)，log?(FoldChange)為2.5，在qRT-PCR驗(yàn)證中，其相對(duì)表達(dá)量也顯著上調(diào)，與RNA-seq測(cè)序結(jié)果一致?；駼在RNA-seq測(cè)序中表達(dá)下調(diào)，log?(FoldChange)為-1.8，qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果同樣顯示其表達(dá)下調(diào)。這表明RNA-seq測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析篩選出的差異表達(dá)基因具有較高的可信度。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果進(jìn)一步支持了轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)論，為深入研究App7型菌株與小鼠感染互作的分子機(jī)制提供了有力的證據(jù)。四、討論4.1豬胸膜肺炎放線桿菌7型在小鼠肺部的感染特性本研究成功建立了App7型小鼠滴鼻感染模型，通過(guò)對(duì)感染小鼠的臨床癥狀、病理變化以及細(xì)菌載量的監(jiān)測(cè)，深入分析了App7型在小鼠肺部的感染特性。結(jié)果顯示，App7型感染小鼠后，小鼠迅速出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，在感染12h左右就開(kāi)始表現(xiàn)出精神萎靡、飲食減少等癥狀，24h時(shí)呼吸急促等呼吸道癥狀加劇，這與豬感染App后的發(fā)病進(jìn)程具有相似性。有研究表明，豬感染App后，通常在1-2天內(nèi)出現(xiàn)急性癥狀，說(shuō)明小鼠感染模型能夠較好地模擬豬的感染情況，為研究App7型的致病機(jī)制提供了有效的工具。解剖感染小鼠發(fā)現(xiàn)，肺臟是App7型感染的主要靶器官，出現(xiàn)了明顯的病理變化，如肺臟出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等。這與豬傳染性胸膜肺炎的病理特征一致，進(jìn)一步證實(shí)了小鼠感染模型的可靠性。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)，肺臟組織中App7型菌株的載量呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌載量逐漸增加，在48h時(shí)達(dá)到較高水平。這表明App7型在小鼠肺部能夠持續(xù)生長(zhǎng)和繁殖，對(duì)肺組織造成持續(xù)的損傷。從感染途徑來(lái)看，滴鼻感染是一種較為理想的感染方式，能夠使App7型直接進(jìn)入小鼠呼吸道，模擬自然感染過(guò)程。通過(guò)優(yōu)化滴鼻感染的操作，如調(diào)整小鼠體位、控制滴鼻液體積和滴速等，提高了感染的成功率和穩(wěn)定性，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠。此外，滴鼻感染對(duì)小鼠的生理狀態(tài)影響相對(duì)較小，有利于觀察和分析感染后的病理變化和免疫應(yīng)答反應(yīng)。App7型在小鼠肺部的感染特性與其他血清型的App感染可能存在差異。不同血清型的App在毒力、感染機(jī)制等方面可能有所不同，這可能導(dǎo)致它們?cè)谛∈蠓尾康母腥咎匦砸灿兴町?。例如，有研究?bào)道App1型和App5型在小鼠感染模型中的致病力和病理變化與App7型存在一定的差異。進(jìn)一步比較不同血清型App在小鼠肺部的感染特性，對(duì)于深入了解App的致病機(jī)制和制定針對(duì)性的防控措施具有重要意義。4.2小鼠肺部在App7型感染后的轉(zhuǎn)錄組變化意義轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，小鼠肺部在App7型感染后發(fā)生了顯著的轉(zhuǎn)錄組變化，這些變化反映了細(xì)胞一系列復(fù)雜的生理病理變化，并對(duì)感染進(jìn)程產(chǎn)生了重要影響。從基因表達(dá)的整體變化來(lái)看，大量差異表達(dá)基因的出現(xiàn)表明App7型感染引發(fā)了小鼠肺部細(xì)胞廣泛的基因表達(dá)調(diào)控。在生物過(guò)程方面，免疫應(yīng)答相關(guān)基因的顯著富集，如T細(xì)胞活化、B細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌等相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，表明小鼠肺部細(xì)胞啟動(dòng)了免疫防御機(jī)制，試圖抵抗App7型的入侵。免疫細(xì)胞通過(guò)識(shí)別病原菌表面的抗原，激活一系列信號(hào)通路，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和增殖，釋放細(xì)胞因子和趨化因子，招募更多的免疫細(xì)胞到感染部位，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。這是機(jī)體應(yīng)對(duì)感染的一種重要的生理反應(yīng)，有助于清除病原菌，減輕感染癥狀。炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的富集也表明，App7型感染導(dǎo)致小鼠肺部發(fā)生了炎癥反應(yīng)。炎癥是機(jī)體對(duì)感染和損傷的一種防御性反應(yīng)，通過(guò)炎癥細(xì)胞的聚集和炎癥介質(zhì)的釋放，試圖清除病原體并修復(fù)受損組織。然而，過(guò)度的炎癥反應(yīng)也可能導(dǎo)致組織損傷和器官功能障礙。在本研究中，炎癥反應(yīng)相關(guān)基因的上調(diào)，如TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎細(xì)胞因子基因的表達(dá)增加，表明炎癥反應(yīng)在小鼠肺部感染App7型后被激活。這些促炎細(xì)胞因子可以激活炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和活化，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)。但同時(shí)，過(guò)度的炎癥反應(yīng)可能會(huì)導(dǎo)致肺部組織的損傷，如肺泡壁增厚、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、出血等，進(jìn)而影響肺部的正常功能。細(xì)胞凋亡調(diào)控相關(guān)基因的變化則反映了細(xì)胞在感染過(guò)程中的自我保護(hù)和平衡機(jī)制。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，在維持組織穩(wěn)態(tài)和清除受損或感染細(xì)胞方面發(fā)揮著重要作用。在App7型感染后，一些細(xì)胞凋亡調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生改變，可能是機(jī)體為了清除感染的細(xì)胞，防止病原菌在細(xì)胞內(nèi)的進(jìn)一步繁殖和擴(kuò)散。同時(shí)，細(xì)胞凋亡也可能是機(jī)體對(duì)炎癥反應(yīng)的一種調(diào)節(jié)機(jī)制，通過(guò)控制炎癥細(xì)胞的數(shù)量和活性，避免過(guò)度炎癥對(duì)組織造成損傷。然而，如果細(xì)胞凋亡過(guò)度，可能會(huì)導(dǎo)致肺部組織的大量破壞，影響肺部的正常功能。在細(xì)胞組成方面，與細(xì)胞膜、細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的基因表達(dá)變化，可能影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞的重要屏障，其組成和結(jié)構(gòu)的改變可能影響細(xì)胞對(duì)病原菌的識(shí)別和防御能力。細(xì)胞外基質(zhì)是細(xì)胞生存和功能發(fā)揮的重要微環(huán)境，其成分和結(jié)構(gòu)的變化可能影響細(xì)胞的黏附、遷移和信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程。在App7型感染后，這些細(xì)胞組成相關(guān)基因的表達(dá)變化，可能導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能改變，進(jìn)而影響肺部細(xì)胞的正常生理功能。在分子功能方面，蛋白結(jié)合、酶活性、細(xì)胞因子活性等分子功能相關(guān)基因的富集，表明這些分子功能在小鼠肺部感染App7型后的生理病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。蛋白結(jié)合相關(guān)基因的變化可能影響蛋白質(zhì)之間的相互作用，進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)和代謝途徑。酶活性相關(guān)基因的變化可能影響細(xì)胞內(nèi)的各種代謝反應(yīng)，如能量代謝、物質(zhì)合成與分解等。細(xì)胞因子活性相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)了免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)在感染過(guò)程中的重要性。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等免疫相關(guān)信號(hào)通路的激活，對(duì)小鼠肺部的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用。Toll樣受體信號(hào)通路作為機(jī)體識(shí)別病原體的重要途徑，能夠激活下游的NF-κB和MAPK等轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。NF-κB信號(hào)通路在免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中處于核心地位，通過(guò)調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)的發(fā)生。MAPK信號(hào)通路則參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等多種生理過(guò)程，在感染過(guò)程中，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)和免疫細(xì)胞的活性，影響免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。這些信號(hào)通路之間相互作用、相互調(diào)控，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)節(jié)小鼠肺部在App7型感染后的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。此外，代謝相關(guān)通路的變化，如糖代謝、脂代謝等通路的改變，表明小鼠肺部細(xì)胞在感染后調(diào)整了代謝模式，以滿足免疫應(yīng)答和抵抗感染的能量需求。糖代謝和脂代謝是細(xì)胞獲取能量的重要途徑，在感染過(guò)程中，細(xì)胞可能通過(guò)上調(diào)糖代謝和脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，增加能量的產(chǎn)生，以支持免疫細(xì)胞的活化和增殖，以及炎癥反應(yīng)的發(fā)生。同時(shí)，代謝產(chǎn)物的變化也可能影響細(xì)胞的功能和信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。4.3關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及致病途徑分析通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，篩選出多個(gè)與App7型感染密切相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子在致病途徑中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。轉(zhuǎn)錄因子A是其中一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，其在App7型感染小鼠后表達(dá)顯著上調(diào)。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子A能夠與多個(gè)毒力因子基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控這些基因的表達(dá)。例如，它可以激活編碼溶血素的基因表達(dá)，從而增強(qiáng)App7型的毒力。溶血素能夠破壞宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞溶解和死亡，促進(jìn)病原菌在宿主體內(nèi)的擴(kuò)散和感染。此外，轉(zhuǎn)錄因子A還可以調(diào)節(jié)參與鐵攝取相關(guān)基因的表達(dá)，鐵是細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在宿主體內(nèi)，鐵的獲取受到宿主的嚴(yán)格調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子A通過(guò)上調(diào)鐵攝取相關(guān)基因的表達(dá)，幫助App7型更好地從宿主細(xì)胞中獲取鐵，滿足其生長(zhǎng)和代謝的需求，進(jìn)一步增強(qiáng)其毒力。轉(zhuǎn)錄因子B在App7型感染過(guò)程中也起著重要作用。在感染后，轉(zhuǎn)錄因子B的表達(dá)發(fā)生明顯變化。它主要參與調(diào)控宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)，通過(guò)與免疫相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)。例如，轉(zhuǎn)錄因子B可以促進(jìn)T細(xì)胞活化相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)T細(xì)胞的活性，從而提高機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。同時(shí)，它還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)，如促進(jìn)TNF-α、IL-1β等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，有助于清除病原菌。然而，過(guò)度的炎癥反應(yīng)也可能對(duì)機(jī)體造成損傷，轉(zhuǎn)錄因子B在調(diào)控免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的過(guò)程中，需要維持一個(gè)平衡，以確保機(jī)體既能有效地抵抗病原菌的感染，又能避免過(guò)度炎癥對(duì)自身組織的損傷。在致病途徑方面，App7型感染小鼠后，激活了多條與致病相關(guān)的信號(hào)通路。其中，Toll樣受體信號(hào)通路在App7型的致病過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。App7型表面的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如脂多糖（LPS）、肽聚糖等，能夠被小鼠肺部細(xì)胞表面的Toll樣受體識(shí)別。以TLR4為例，當(dāng)TLR4識(shí)別到App7型的LPS后，通過(guò)MyD88依賴的途徑，激活下游的NF-κB和MAPK等轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，與一系列免疫相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控這些基因的表達(dá)，包括促炎細(xì)胞因子、趨化因子等。這些細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)增加，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的招募和活化，引發(fā)炎癥反應(yīng)。MAPK信號(hào)通路則參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等多種生理過(guò)程，在App7型感染過(guò)程中，它可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)和免疫細(xì)胞的活性，影響免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。Toll樣受體信號(hào)通路的激活，不僅啟動(dòng)了機(jī)體的免疫應(yīng)答，同時(shí)也在一定程度上促進(jìn)了App7型的致病過(guò)程，因?yàn)檫^(guò)度的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致肺部組織的損傷，為App7型的進(jìn)一步感染和擴(kuò)散創(chuàng)造條件。此外，NF-κB信號(hào)通路在App7型的致病過(guò)程中也發(fā)揮著核心作用。在正常情況下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結(jié)合，以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)App7型感染小鼠后，IκB被磷酸化并降解，釋放出NF-κB。NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，調(diào)控一系列免疫相關(guān)基因的表達(dá)。除了前面提到的促炎細(xì)胞因子和趨化因子外，NF-κB還可以調(diào)控免疫細(xì)胞的增殖、分化和存活。例如，它可以促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和分化，產(chǎn)生更多的抗體，增強(qiáng)體液免疫功能。然而，在App7型感染過(guò)程中，NF-κB信號(hào)通路的過(guò)度激活可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的損傷。因此，如何調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路的活性，使其既能有效地啟動(dòng)免疫應(yīng)答，又能避免過(guò)度炎癥對(duì)機(jī)體的損害，是防治豬傳染性胸膜肺炎的關(guān)鍵之一。App7型感染小鼠后，關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)調(diào)控毒力因子表達(dá)、免疫應(yīng)答反應(yīng)等，參與了多條致病途徑的調(diào)控。深入研究這些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及致病途徑，對(duì)于揭示App7型的致病機(jī)制，開(kāi)發(fā)有效的防控策略具有重要意義。4.4研究結(jié)果對(duì)豬胸膜肺炎防治的潛在價(jià)值本研究通過(guò)對(duì)App7型與小鼠感染互作的轉(zhuǎn)錄組分析，揭示了App7型的致病機(jī)制以及小鼠的免疫應(yīng)答反應(yīng)，這些研究結(jié)果對(duì)豬胸膜肺炎的防治具有重要的潛在價(jià)值。在疫苗開(kāi)發(fā)方面，研究結(jié)果為新型疫苗的設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)。通過(guò)分析App7型在感染過(guò)程中差異表達(dá)的毒力因子基因，如編碼溶血素、黏附素等的基因，可以篩選出關(guān)鍵的毒力因子作為疫苗的候選抗原。以溶血素為例，其在App7型感染小鼠過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，能夠破壞宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜，增強(qiáng)病原菌的毒力。將溶血素作為疫苗抗原，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，可中和溶血素的活性，阻止其對(duì)宿主細(xì)胞的破壞，從而達(dá)到預(yù)防感染的目的。此外，對(duì)App7型代謝相關(guān)基因的研究也有助于疫苗的開(kāi)發(fā)。了解病原菌在宿主體內(nèi)的代謝需求和代謝途徑，可設(shè)計(jì)出能夠干擾其代謝過(guò)程的疫苗，抑制病原菌的生長(zhǎng)和繁殖。例如，針對(duì)App7型上調(diào)的碳水化合物代謝相關(guān)基因，開(kāi)發(fā)能夠阻斷其碳水化合物攝取和利用的疫苗，可限制病原菌的能量供應(yīng)，降低其致病能力。在藥物研發(fā)方面，研究結(jié)果為篩選新型藥物靶點(diǎn)提供了線索。通過(guò)對(duì)App7型致病途徑中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路的分析，如轉(zhuǎn)錄因子A對(duì)毒力因子基因的調(diào)控以及Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等的激活，可以確定潛在的藥物作用靶點(diǎn)。以轉(zhuǎn)錄因子A為靶點(diǎn)，研發(fā)能夠抑制其活性的藥物，可阻斷毒力因子基因的表達(dá)，降低App7型的毒力。針對(duì)Toll樣受體信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路，開(kāi)發(fā)能夠調(diào)節(jié)這些信號(hào)通路活性的藥物，可控制炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度，減輕炎癥對(duì)機(jī)體的損傷。同時(shí)，對(duì)小鼠免疫應(yīng)答相關(guān)基因和信號(hào)通路的研究，也有助于開(kāi)發(fā)免疫調(diào)節(jié)劑。通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠的免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，可提高對(duì)App7型感染的抵抗力。例如，開(kāi)發(fā)能夠促進(jìn)T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子分泌的免疫調(diào)節(jié)劑，可增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能。在疾病防控方面，研究結(jié)果為制定科學(xué)合理的防控策略提供了指導(dǎo)。通過(guò)了解App7型在小鼠肺部的感染特性，如感染途徑、感染后的病理變化和細(xì)菌載量的動(dòng)態(tài)變化等，可以采取針對(duì)性的防控措施。在豬場(chǎng)養(yǎng)殖中，加強(qiáng)生物安全措施，如嚴(yán)格的人員和車輛進(jìn)出管理、定期消毒豬舍等，可減少App7型的傳播。根據(jù)App7型感染后的病理變化，如肺臟的炎癥反應(yīng)和組織損傷等，可提前采取治療措施，減輕疾病的危害。對(duì)小鼠免疫應(yīng)答反應(yīng)的研究，也有助于優(yōu)化