高中生物二輪復(fù)習(xí)微專題·PCR引物

PCR技術(shù)中“引物”歸類分析主講教師XXX01引物存在的必要性02引物的設(shè)計(jì)0304PCR循環(huán)時(shí)與引物相關(guān)的計(jì)算引物的選擇和互補(bǔ)鏈的判斷PCR技術(shù)中“引物”歸類分析05引物與PCR反應(yīng)時(shí)復(fù)性溫度和時(shí)間的關(guān)系1.1DNA的復(fù)制需要引物

DNA聚合酶只能催化脫氧核糖核苷酸加至已有核酸鏈的游離3'-羥基上，而不能使脫氧核糖核苷酸自身發(fā)生聚合，即它需要引物鏈的存在。引物是一小段DNA或RNA，它能與DNA母鏈的一段堿基互補(bǔ)配對(duì)。細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制以RNA作引物，從新合成的岡崎片段上發(fā)現(xiàn)含有一短暫存在的小的RNA片段附著在5'端這一事實(shí)，可說(shuō)明DNA復(fù)制時(shí)需要RNA引物，這些引物長(zhǎng)5~10bp，現(xiàn)已知RNA引物的合成是由一種特殊的RNA合成酶——引物酶所催化的。PCR反應(yīng)以DNA作引物。1.引物存在的必要性DNA的復(fù)制需要引物例1（2011年江蘇卷）請(qǐng)回答基因工程方面的有關(guān)問(wèn)題;PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因?yàn)開(kāi)_____________。1.引物存在的必要性答案：DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，而只能將單個(gè)脫氧核苷酸連續(xù)結(jié)合至雙鏈DNA片段的引物鏈上。引物的作用DNA聚合酶不能從頭開(kāi)始合成DNA，只能從3'端延伸DNA鏈。當(dāng)引物與DNA母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后，DNA聚合酶就能從引物的3'端開(kāi)始延伸DNA鏈。不同的引物可結(jié)合不同的目的基因并進(jìn)行擴(kuò)增。例2.請(qǐng)回答基因工程方面的有關(guān)問(wèn)題：（1）若用PCR技術(shù)擴(kuò)增psy基因和crtI基因，需要分別在不同的PCR擴(kuò)增儀中加入__種引物，其作用是_________________________。（2）在利用PCR技術(shù)擴(kuò)增R（抗旱）或

r

基因過(guò)程中，利用_______可尋找抗旱基因的位置并進(jìn)行擴(kuò)增。1.引物存在的必要性答案∶（1）2；引物與DNA模板鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，使DNA聚合酶從引物的3'端開(kāi)始連接脫氧核苷酸，從而延伸DNA子鏈；（2）引物。例3.為研究水稻D基因的功能，研究者將T-DNA插入到D基因中（圖3），致使該基因失活，失活后的基因記為d。為驗(yàn)證F2植株基因型（DD、Dd和dd），研究者根據(jù)D基因、T-DNA的序列，設(shè)計(jì)了3種引物，如圖4所示。隨機(jī)選取F2植株若干，提取各植株的總DNA，分別用引物“Ⅰ+Ⅲ”組合及“Ⅱ+Ⅲ”組合進(jìn)行PCR，檢測(cè)是否擴(kuò)增（完整的T-DNA過(guò)大，不能完成PCR）。如果引物“I+Ⅲ”組及“Ⅱ+Ⅲ”組進(jìn)行PCR均可完成擴(kuò)增，則相應(yīng)植株的基因型為_(kāi)___。如果_______________，則相應(yīng)植株的基因型為_(kāi)____________；如果_______________，則相應(yīng)植株的基因型為_(kāi)_____________。設(shè)計(jì)引物的原則引物是根據(jù)目的基因特有的一段已知的核苷酸序列設(shè)計(jì)合成的，能與目的基因的模板鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)特異性地結(jié)合。設(shè)計(jì)引物的主要原則：①引物長(zhǎng)度應(yīng)大于16個(gè)核苷酸，可防止隨機(jī)結(jié)合;②引物與靶序列間的Tm不應(yīng)過(guò)低;③引物不應(yīng)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即不能有4bp以上的回文序列;④2個(gè)引物間不應(yīng)有4bp以上的互補(bǔ)序列或同源序列，在3'端不應(yīng)有任何互補(bǔ)的堿基;⑤引物中堿基的分布盡可能均勻，G+C含量接近50%。2.引物的設(shè)計(jì)例4，請(qǐng)回答基因工程方面的有關(guān)問(wèn)題∶(1）通過(guò)PCR技術(shù)可在DNA分子中專一性擴(kuò)增出某目的基因，其原因是_______。(2）（2011年江蘇卷）請(qǐng)回答基因工程方面的有關(guān)問(wèn)題∶設(shè)計(jì)引物是PCR技術(shù)關(guān)鍵步驟之一。某同學(xué)設(shè)計(jì)的2組引物（圖5）都不合理，請(qǐng)分別說(shuō)明理由。①第1組：______________;②第2組：_____________________。（3）科研過(guò)程中，可用PCR技術(shù)檢測(cè)受體細(xì)胞是否成功轉(zhuǎn)入了目的基因。提取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞的全部DNA分子，用目的基因的引物擴(kuò)增。擴(kuò)增完畢后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物中除目的基因外，還有其他不同大小片段的非目的基因片段，可能的原因一般有____。①模板受到污染；②退火溫度過(guò)高；③引物太短；④延伸溫度偏低。引物的處理由于引物延伸從3'端開(kāi)始，3'端不能進(jìn)行任何修飾，引物5'端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，因此，可給予修飾而不影響擴(kuò)增特異性。引物5'端修飾包括加酶切位點(diǎn)、標(biāo)記生物素、熒光等。為了使經(jīng)PCR擴(kuò)增的目的基因能與運(yùn)載體正常結(jié)合，需要在2種引物的5'端添加不同的限制酶的識(shí)別序列。在2種引物的5'端上添加不同的限制酶識(shí)別序列，是為了保證目的基因定向插入運(yùn)載體并可避免目的基因自身環(huán)化。2.引物的設(shè)計(jì)例5（2018年江蘇卷）為生產(chǎn)具有特定性能的α-淀粉酶，研究人員從某種海洋細(xì)菌中克隆了α-淀粉酶基因（1656個(gè)堿基對(duì)），利用基因工程大量制備α-淀粉酶。為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的____端加上限制性酶切位點(diǎn)，且常在2條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，主要目的是________________。使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連。5'2.引物的設(shè)計(jì)引物的特點(diǎn)①引物能與DNA模板通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合;②2種引物之間不能互補(bǔ)配對(duì);③某一引物不能自身折疊出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì);④需要在2種引物的5'端添加不同的限制酶的識(shí)別序列;⑤引物不能太短。3.PCR循環(huán)時(shí)與引物相關(guān)的計(jì)算PCR的原理是DNA分子的半保留復(fù)制，所以要根據(jù)DNA分子的2條模板鏈設(shè)計(jì)2種引物。PCR循環(huán)時(shí)需要的引物數(shù)量的計(jì)算有2種方法。方法1∶第n次循環(huán)產(chǎn)生的DNA數(shù)為2"，根據(jù)DNA分子的半保留復(fù)制可知，需要的引物數(shù)為2n個(gè)，從第1次循環(huán)開(kāi)始，需要引物的個(gè)數(shù)依次為2個(gè)、22個(gè)、23個(gè)……2n個(gè)，故PCR過(guò)程經(jīng)過(guò)n次循環(huán)，需要的引物總個(gè)數(shù)是2+21+22+……+2n=2n+1-2。方法2∶PCR經(jīng)過(guò)n次循環(huán)產(chǎn)生的DNA數(shù)為2"，一共有2"'條鏈，其中有2條鏈?zhǔn)荄NA母鏈，不含引物，其他的每1條鏈均含1個(gè)引物，并且2種引物的數(shù)量相等，故PCR過(guò)程經(jīng)過(guò)n次循環(huán)，需要的引物總個(gè)數(shù)是2n+1-2，需要某一種引物的總個(gè)數(shù)是（2n+1-2）×1/2=2n-1。2n個(gè)DNA中，一個(gè)DNA由1條母鏈和第1種引物延伸的子鏈組成，另一個(gè)DNA由另一條母鏈和第2種引物延伸的子鏈組成，其他的DNA均由2種引物延伸的2條子鏈組成。例6，通過(guò)PCR方法獲得某目的基因，首先需要設(shè)計(jì)_______（填"一對(duì)"或"一個(gè)"）引物，PCR過(guò)程經(jīng)過(guò)4次循環(huán)，第4次循環(huán)時(shí)需要的引物的數(shù)量是____個(gè)，4次循環(huán)一共需要的引物的總數(shù)量是____個(gè)。例7（2011年江蘇卷）請(qǐng)回答基因工程方面的有關(guān)問(wèn)題∶利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似（圖6）。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。一對(duì)1630①?gòu)睦碚撋贤茰y(cè)，第4輪循環(huán)產(chǎn)物中含有引物A的DNA片段所占的比例為_(kāi)________。②在第____輪循環(huán)產(chǎn)物中開(kāi)始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長(zhǎng)的DNA片段。15/16三4.引物的選擇和互補(bǔ)鏈的判斷DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于2個(gè)引物之間的DNA序列，引物5'端的堿基與DNA母鏈3'端的堿基進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)，可作為DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，DNA子鏈的合成方向是從引物的5'端向3'端延伸。可利用這一特點(diǎn)判斷引物及引物的互補(bǔ)鏈。例8（2016年江蘇卷）為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，平板上長(zhǎng)出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖7中的

。引物甲和引物丙例9.下圖是為了擴(kuò)增某目的基因所用引物的分布示意圖（圖8），已知引物組合1和2、3和4可擴(kuò)增相關(guān)的目的基因，則引物1、3與______（填α鏈或β鏈）形成堿基互補(bǔ)配對(duì)關(guān)系。β鏈5.引物與PCR反應(yīng)時(shí)復(fù)性溫度和時(shí)間的關(guān)系PCR的每次循環(huán)可分為3步：變性（90~95℃）復(fù)性（55~60℃）延伸（70~75℃）變性的溫度與目的基因中G+C含量有關(guān)；變性時(shí)間的長(zhǎng)短與目的基因的長(zhǎng)短有關(guān)，目的基因越長(zhǎng)，變性的時(shí)間就越長(zhǎng)。復(fù)性是讓2種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與2條單鏈DNA結(jié)合，復(fù)性的溫度與引物中G+C含量有關(guān)，G-C堿基對(duì)間有3個(gè)氫鍵，A-T堿基對(duì)間只有2個(gè)氫鍵，引物中G+C含量較高，復(fù)性時(shí)溫度就較高;復(fù)性時(shí)間的長(zhǎng)短與引物的長(zhǎng)短有關(guān)，引物越長(zhǎng)，復(fù)性的時(shí)間就越長(zhǎng)。延伸的溫度不能太高，以防止新合成的子鏈DNA與母鏈DNA解聚為單鏈，延伸的溫度也不能太低，是為了保證Taq酶的活性;延伸所需要的時(shí)間長(zhǎng)短與目的基因的長(zhǎng)短有關(guān)，目的基因越長(zhǎng)，延伸所需要的時(shí)間就越長(zhǎng)。例10（2008年江蘇卷）將動(dòng)物致病菌的抗原基因?qū)腭R鈴薯制成植物疫苗，飼喂轉(zhuǎn)基因馬鈴薯可使動(dòng)物獲得免疫力。以下是與植物疫苗制備過(guò)程相關(guān)的圖和表。PCR過(guò)程中退火（復(fù)性）溫度必須根據(jù)引物的堿基數(shù)量和種類設(shè)定。表1為根據(jù)模板設(shè)計(jì)的2對(duì)引物序列，圖9為引物對(duì)與模板結(jié)合示意圖。請(qǐng)判斷哪一對(duì)引物可采用較高的退火溫度？例11，請(qǐng)回答PCR擴(kuò)增時(shí)與退火溫度、延伸溫度與延伸時(shí)間有關(guān)的問(wèn)題∶（1）（2018年江蘇卷）進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)的溫度和時(shí)間需根據(jù)具體情況進(jìn)行設(shè)定，下列選項(xiàng)中_________的設(shè)定與引物有關(guān)，_________的設(shè)定與擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度有關(guān)。（填序號(hào)）①變性溫度;②退火溫度;③延伸溫度;④變性時(shí)間;⑤退火時(shí)間;⑥延伸時(shí)間。（2）（2017年江蘇卷）PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過(guò)高會(huì)破壞____________的堿基配對(duì)。退火溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)，長(zhǎng)度相同但____________的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。②⑥引物與模板GC含量高例11，請(qǐng)回答PCR擴(kuò)增時(shí)與退火溫度、延伸溫度與延伸時(shí)間有關(guān)的問(wèn)題∶（3）（2017年江蘇卷）如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，可采取的改進(jìn)措施有______（填序號(hào)）。①升高退火溫度;②降低退火溫度;③重新設(shè)計(jì)引物。（4）（2021年湖北省元月聯(lián)考）通過(guò)PCR方法獲得eGFP目的片段，首先需要設(shè)計(jì)____（填"一