ICS65.020.20

CCSB05

4415

汕尾市地方標準

DB4415/T24—2023

甘薯病毒分子檢測技術規(guī)程

Technicalregulationsformoleculardetectionofsweetpotatovirus

2023-09-14發(fā)布2023-10-08實施

汕尾市市場監(jiān)督管理局發(fā)布

DB4415/T24－2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分:標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)

定編寫。

本文件由汕尾市市場監(jiān)督管理局提出并歸口。

本文件起草單位:汕尾市農(nóng)業(yè)科學院。

本文件主要起草人:柯杰、熊振乾、周國昌、王聰浩、方壯東、彭遠璇、范琴、葉建東、葉祥俊、

林少欽。

I

DB4415/T24－2023

甘薯病毒分子檢測技術規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了甘薯病毒分子檢測技術規(guī)程的術語和定義、檢測對象、抽樣方法、檢測、結果判定以

及記錄和歸檔。

本文件適用于汕尾市區(qū)域內(nèi)甘薯脫毒組培苗、原原種、原種以及生產(chǎn)用種的病毒分子檢測。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

NY/T402脫毒甘薯種薯（苗）病毒檢測技術規(guī)程

SN/T2122進出境植物及植物產(chǎn)品檢疫抽樣方法

SN/T2964植物病毒檢測規(guī)范

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

分子檢測moleculardetection

以功能基因、核糖體、ITS等區(qū)域為標靶，采用分子生物學的方法在基因水平上對物種進行鑒定。

3.2

引物primer

指一段短的核苷酸序列。其功能是作為核苷酸聚合作用的起點，在聚合反應時，引導合成一條與模

板DNA互補的序列。

3.3

聚合酶鏈式反應PCR;polymerasechainreaction

在DNA聚合酶的作用下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性，退火，延伸等步驟，

體外復制出與母鏈DNA互補的子鏈DNA的過程，是一項能快速特異性的在體外擴增目的DNA片段的技術。

3.4

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應RT-PCR;reversetranscriptionpolymerasechainreaction

以RNA為模板，通過反轉(zhuǎn)錄形成互補的DNA序列，再以此DNA為模板進行PCR擴增，是一項能快速特異

性的檢測目的RNA的技術。

1

DB4415/T24－2023

4檢測對象

4.1DNA病毒

a）甘薯類花椰菜花葉病毒（SPCV）

b)甘薯曲葉病（SPLCV）

4.2RNA病毒

a)甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）

b)甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）

c)甘薯G病毒（SPVG）

d)甘薯潛隱病毒（SPLV）

e)甘薯褪綠斑病毒（SPCFV）

f)甘薯脈花葉病毒（SPVMV）

g)黃瓜花葉病毒（CMV）

5抽樣方法

抽樣方法應符合SN/T2122和SN/T2964中的規(guī)定，遵循隨機的原則，根據(jù)樣品的特性和樣品中可

能存在的病毒表現(xiàn)出的癥狀特點，確定取樣方法、取樣數(shù)量、取樣工具、保存方法等。

對實驗室檢測發(fā)現(xiàn)疑似病毒，但還不能做出準確判斷，需要更多樣品進行確認時，需重新制定更為

合適的取樣計劃，進行再次取樣。

6檢測

6.1聚合酶鏈式反應（PCR）檢測

用于檢測甘薯DNA病毒。

6.1.1試劑及緩沖液的配置

試劑及緩沖液用水應符合GB/T6682的規(guī)定，配置按NY/T402附錄C.1執(zhí)行。

6.1.2樣品DNA的提取

樣品DNA的提取按NY/T402附錄C.2執(zhí)行。

6.1.3對照組

以ddH2O作為檢測的陰性對照。

6.1.4引物

a）甘薯類花椰菜花葉病毒（SPCV）:

F-AGGAAATCCCAGTATTATTCAAC，R-ATTTCTAATTTGGTTTACTAATCC，擴增產(chǎn)物922bp；

b）甘薯曲葉?。⊿PLCV）：

F-CCYTAGGGTTCGAGCTVTGTTCGG，R-TTTATTAATTDTTRTGCGAATC，擴增產(chǎn)物823bp。

6.1.5PCR擴增

采用DNA病毒特異引物進行PCR擴增；反應體系（25μL）：樣品總DNA（約100ng/μL）2μL，

2×TaqMasterMix12.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，ddH2O補齊至25μL；擴增條件：

2

DB4415/T24－2023

94℃2min；94℃30s，退火45s，68℃1min，30次循環(huán)；68℃10min；4℃保存；擴增產(chǎn)物用

于后續(xù)凝膠電泳檢測。

6.1.6PCR產(chǎn)物的電泳檢測

取10μLPCR擴增產(chǎn)物與1μL10×loadingBuffer混合后，1%瓊脂糖凝膠恒壓（120V～150V）

下電泳20min～30min，EB染色后，凝膠成像儀拍照觀察。

6.2反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測

用于檢測甘薯RNA病毒。

6.2.1試劑及緩沖液的配置

試劑及緩沖液用水應符合GB/T6682的規(guī)定，配置按NY/T402附錄D.1執(zhí)行。

6.2.2樣品RNA的提取

樣品RNA的提取按NY/T402附錄D.2執(zhí)行。

6.2.3對照組

以ddH2O作為檢測的陰性對照。

6.2.4引物

a）甘薯褪綠矮化病毒（SPCSV）：

F-CGGTCARATTGGAAGGT，R-TTCGCTATCAAAGAAGTRTC，擴增產(chǎn)物304bp；

b）甘薯羽狀斑駁病毒（SPFMV）：

F-GCATGGTATGARGGAGTYAA，R-TCTTCTTCTTGCGTGGAG，擴增產(chǎn)物589bp；

c）甘薯G病毒（SPVG）：

F-GTATGAAGACTCTCTGACAAATTTTG，R-TCGGGACTGAARGAYACGAATTTAA，擴增產(chǎn)物1191bp；

d）甘薯潛隱病毒（SPLV）：

F-GCCGAYGAAACCATCMTCGAT，R-GTCTCYGGTATAAGACAAAAAG，擴增產(chǎn)物1076bp；

e）甘薯褪綠斑病毒（SPCFV）：

F-CTATGCTGCTCACTCAAGC，R-TTGATTGGCCACAAGCGAAG，擴增產(chǎn)物600bp；

f）甘薯脈花葉病毒（SPVMV）：

F-GCGAATTCTCAAGCACTGAAGAAAC，R-CTCTCGAGTTACTGCACACCTCTCATT，擴增產(chǎn)物1015bp；

g）黃瓜花葉病毒（CMV）:

F-ATGGACAAATCTRAATCAACCAG，R-TCARACTGGGAGCACYCCWGAYGT，擴增產(chǎn)物657bp；

6.2.5反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄過程按NY/T402附錄D.3.2執(zhí)行。

6.2.6PCR擴增

采用RNA病毒特異引物進行PCR擴增；反應體系（25μL）：合成的cDNA2μL，2×TaqMasterMix

12.5μL，上、下游引物（10μmol/L）各1μL，ddH2O補齊至25μL；擴增條件：94℃2min；94℃30

s，退火45s，68℃1min，30次循環(huán)；68℃10min；4℃保存；擴增產(chǎn)物用于后續(xù)凝膠電泳檢測。

6.2.7PCR產(chǎn)物的電泳檢測

取10μLPCR擴增產(chǎn)物與1μL10×loadingBuffer混合后，1%瓊脂糖凝膠恒壓（120V～150V）

下電泳20min～30min，EB染色后，凝膠成像儀拍照觀察。

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