免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)操作方法一、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)概述

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)是研究免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)方法，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域。本指南將系統(tǒng)介紹免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本操作流程、關(guān)鍵技術(shù)和注意事項(xiàng)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與基礎(chǔ)操作

（一）實(shí)驗(yàn)環(huán)境與設(shè)備

1.實(shí)驗(yàn)環(huán)境：選擇潔凈、恒溫（20-25℃）、避光的環(huán)境，保持相對(duì)濕度在40%-60%。

2.常用設(shè)備：

-移液器（1ml、10ml、100ml等）

-高速離心機(jī)

-酶標(biāo)儀

-超凈工作臺(tái)

-恒溫孵育箱

3.試劑準(zhǔn)備：

-PBS緩沖液（pH7.4）

-乙醇、乙醚（用于固定）

-生理鹽水（0.9%）

（二）樣品處理

1.組織樣品：

(1)取材：新鮮組織用無(wú)菌刀片切割成1-2mm3小塊。

(2)固定：立即浸泡于4%多聚甲醛溶液中，4℃固定4-12小時(shí)。

(3)脫水：依次使用30%乙醇（1小時(shí)）、50%乙醇（1小時(shí)）、70%乙醇（2小時(shí)）梯度脫水。

2.細(xì)胞樣品：

(1)收集：離心收集細(xì)胞，棄上清。

(2)洗滌：用PBS緩沖液重懸并洗滌3次。

三、核心實(shí)驗(yàn)技術(shù)

（一）ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）

1.固定抗體：

(1)加樣：將包被抗體加入酶標(biāo)板孔中（100μl/孔），4℃過(guò)夜。

(2)洗滌：用PBST（含0.05%Tween-20）洗滌3次，每次5分鐘。

2.加樣檢測(cè)：

(1)加樣：加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（100μl/孔），37℃孵育1小時(shí)。

(2)顯色：加入TMB底物液（100μl/孔），避光反應(yīng)15-30分鐘。

(3)終止：加入2mol/LH?SO?（50μl/孔）終止反應(yīng)。

3.數(shù)據(jù)分析：用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)吸光度值，計(jì)算樣品濃度。

（二）流式細(xì)胞術(shù)分析

1.細(xì)胞染色：

(1)準(zhǔn)備：用FACSPermFix緩沖液固定細(xì)胞（1ml/10^6細(xì)胞）。

(2)染色：加入熒光標(biāo)記抗體（如CD3-FITC/CD8-PE，各10μl/10^6細(xì)胞），4℃避光孵育30分鐘。

2.上機(jī)檢測(cè)：

(1)設(shè)定門(mén)區(qū)：根據(jù)前向散射（FSC）和側(cè)向散射（SSC）參數(shù)設(shè)置細(xì)胞群體。

(2)收集數(shù)據(jù)：設(shè)1000個(gè)事件/細(xì)胞，收集至少10^5個(gè)細(xì)胞。

3.數(shù)據(jù)處理：用FlowJo軟件分析細(xì)胞陽(yáng)性率、絕對(duì)計(jì)數(shù)等指標(biāo)。

（三）WesternBlotting（蛋白質(zhì)印跡）

1.蛋白質(zhì)提取：

(1)裂解：加入RIPA裂解液（含PMSF），冰上孵育30分鐘。

(2)離心：12,000rpm離心10分鐘，取上清。

2.SDS電泳：

(1)配膠：制備12%分離膠和5%濃縮膠。

(2)加樣：每孔上樣50-100μg蛋白，100V預(yù)電泳30分鐘。

3.轉(zhuǎn)膜與檢測(cè)：

(1)轉(zhuǎn)膜：用PVDF膜，濕轉(zhuǎn)條件（100V，1小時(shí)）。

(2)封閉：5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)。

(3)一抗孵育：兔抗目標(biāo)蛋白抗體（1:1000），4℃過(guò)夜。

(4)二抗孵育：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體（1:5000），室溫1小時(shí)。

(5)顯影：ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，曝光1-5分鐘。

四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

（一）無(wú)菌操作

1.所有接觸樣品的器械需高壓滅菌（121℃，15分鐘）。

2.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需佩戴手套，避免污染。

（二）試劑管理

1.熒光試劑避光保存，使用前置于冰盒。

2.底物液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍融。

（三）結(jié)果驗(yàn)證

1.ELISA需設(shè)置陰性對(duì)照（未包被板孔）。

2.流式細(xì)胞術(shù)需用同型對(duì)照抗體（如IgG同型對(duì)照）。

3.WesternBlotting需用內(nèi)參蛋白（如β-actin）校準(zhǔn)條帶亮度。

五、實(shí)驗(yàn)安全

1.操作化學(xué)試劑需佩戴護(hù)目鏡和耐酸堿手套。

2.高壓滅菌后器械需冷卻再取用。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，廢棄物需按生物安全規(guī)定處理。

**四、核心實(shí)驗(yàn)技術(shù)（續(xù)）**

**(一)ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）-更多細(xì)節(jié)與變體**

1.**固定抗體：**

***(1)包被條件優(yōu)化：**

*抗體濃度選擇：根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)或預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳工作濃度，通常為0.1-10μg/mL?？蓢L試梯度濃度（如0.01,0.1,1,10μg/mL）進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇在檢測(cè)范圍內(nèi)信號(hào)最佳且背景最低的濃度。

*包被體積：通常為100μl/孔，確?？贵w充分覆蓋孔底。

*包被溫度與時(shí)間：除4℃過(guò)夜外，也可選擇37℃孵育2-4小時(shí)。37℃孵育可加速抗體結(jié)合，但需嚴(yán)格控制時(shí)間以防背景升高。

***(2)洗滌細(xì)節(jié)：**

*洗滌液：使用含0.05%Tween-20的PBS（PBST）作為洗滌液，Tween-20可幫助去除未結(jié)合的抗體和蛋白質(zhì)，降低背景。

*洗滌次數(shù)與時(shí)間：標(biāo)準(zhǔn)流程為洗滌3-4次。每次洗滌建議使用洗板機(jī)，確保洗液充分浸潤(rùn)并充分排放。每次洗滌時(shí)間通常為5分鐘，可根據(jù)具體情況調(diào)整（如抗體濃度高可延長(zhǎng)至10分鐘）。

*洗滌設(shè)備：強(qiáng)烈推薦使用洗板機(jī)，確保洗滌一致性。若手動(dòng)洗滌，需確保每次都吸干凈孔內(nèi)液體。

2.**加樣檢測(cè)：**

***(1)樣品稀釋?zhuān)?*根據(jù)樣品濃度和預(yù)期信號(hào)強(qiáng)度，對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋。可先進(jìn)行系列稀釋?zhuān)ㄈ?:2,1:4,1:8...），通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳檢測(cè)范圍（信號(hào)在檢測(cè)儀線(xiàn)性區(qū)域內(nèi)）。

***(2)一抗/二抗孵育：**

*抗體濃度：同樣需根據(jù)說(shuō)明書(shū)和預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳工作濃度，通常為0.1-10μg/mL（一抗）或1:1000-1:5000（二抗）。

*孵育溫度：一抗通常在4℃孵育（增強(qiáng)特異性結(jié)合，延長(zhǎng)孵育時(shí)間可達(dá)12-24小時(shí)），二抗通常在37℃孵育（加速反應(yīng)，1-2小時(shí)）。有些特殊應(yīng)用（如磷酸化蛋白檢測(cè)）可能需要在室溫或特定緩沖液條件下進(jìn)行。

*孵育時(shí)間：一抗4℃過(guò)夜是常用方法。二抗37℃孵育1小時(shí)是標(biāo)準(zhǔn)，但也可根據(jù)抗體活性調(diào)整（如增強(qiáng)型二抗可能只需30分鐘）。細(xì)胞因子等小分子抗原檢測(cè)，有時(shí)需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間（如2-4小時(shí)）。

*封閉：在加入一抗前，用封閉液（如5%脫脂奶粉或5%BSA的PBST）封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，孵育1-2小時(shí)或過(guò)夜。封閉液濃度和孵育時(shí)間需優(yōu)化。

***(3)顯色：**

*底物選擇：HRP標(biāo)記通常使用TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）或ABTS（2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)）作為底物。TMB呈黃綠色，ABTS呈藍(lán)色，均需加入H?SO?終止后變?yōu)辄S色或紫色，可在450nm（TMB）或414nm（ABTS）處檢測(cè)。

*顯色條件：TMB顯色通常在室溫避光條件下進(jìn)行15-30分鐘，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致背景升高。ABTS顯色可在室溫或37℃進(jìn)行，時(shí)間約10-30分鐘。顯色時(shí)間需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

*顯色效率：觀察溶液顏色變化，若顏色過(guò)深（信號(hào)飽和）或過(guò)淺（信號(hào)不足），需調(diào)整樣品濃度或顯色時(shí)間。

***(4)終止：**

*終止液：使用2mol/LH?SO?（約180μl/孔）或4NHCl（約100μl/孔）。強(qiáng)酸，需小心操作。

*終止目的：使HRP酶失活，停止氧化底物，使顏色反應(yīng)達(dá)到最大值并穩(wěn)定。

*終止時(shí)間：加入終止液后，吸光度值會(huì)在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定，通常等待10-15分鐘。

3.**數(shù)據(jù)分析：**

***(1)儀器設(shè)置：**在酶標(biāo)儀上設(shè)置讀數(shù)波長(zhǎng)（如TMB為450nm，設(shè)參考波長(zhǎng)，通常是450-490nm之間的非吸收峰，如492nm）。設(shè)置讀數(shù)時(shí)間（如1-5秒，確保讀數(shù)穩(wěn)定）。

***(2)陰陽(yáng)性對(duì)照：**必須包含空白對(duì)照（空白板孔加樣品稀釋液，不加任何抗體）、標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照（已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品）和陰性對(duì)照（不含目標(biāo)抗原的樣品，經(jīng)同樣處理）。這些對(duì)照用于評(píng)估本底、校準(zhǔn)曲線(xiàn)和判斷結(jié)果有效性。

***(3)數(shù)據(jù)處理：**

*計(jì)算公式：通常使用`樣品吸光度=(樣品孔吸光度-空白孔吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)品孔吸光度-空白孔吸光度)*標(biāo)準(zhǔn)品濃度`計(jì)算樣品濃度。

*繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算后的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（通常為線(xiàn)性回歸，R2>0.95）。

*計(jì)算結(jié)果：將樣品吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，得到樣品濃度。結(jié)果通常以pg/mL或ng/mL表示，需根據(jù)加樣體積和稀釋倍數(shù)進(jìn)行換算。

**(二)流式細(xì)胞術(shù)分析-更多細(xì)節(jié)與參數(shù)**

1.**細(xì)胞染色（續(xù)）：**

***(1)染色策略：**

*直標(biāo)法：所有抗體同時(shí)加入細(xì)胞懸液染色，然后固定、permeabilize（如需）。適用于檢測(cè)表面標(biāo)記和大部分細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記。

*雙標(biāo)法：先檢測(cè)表面標(biāo)記，再固定、通透后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記?？蓽p少細(xì)胞表面抗原的脫失。

*苂光標(biāo)記選擇：根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)選擇合適的熒光素。常用組合如PE（橙色）配FITC（綠色），PE-Cy7配CD4-FITC，避免光譜重疊。標(biāo)記濃度需優(yōu)化，通常每個(gè)細(xì)胞10^-12至10^-15摩爾的抗體。

***(2)固定與通透：**

*固定：使用固定液（如Paraformaldehyde或Methanol）固定細(xì)胞膜，防止細(xì)胞溶解和抗原流失。Paraformaldehyde為化學(xué)固定，Methanol為低溫物理固定。固定后需用PBS洗滌。

*通透：對(duì)于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白（如磷酸化蛋白、轉(zhuǎn)錄因子），需使用通透劑（如0.1%Saponin或0.1%NP-40）。通透后需用PBS洗滌。

***(3)阻斷非特異性結(jié)合：**在加入第一抗體前，使用封閉劑（如1-5%BSA或5%正常血清）封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，孵育15-30分鐘。

2.**上機(jī)檢測(cè)：**

***(1)設(shè)門(mén)區(qū)（GatingStrategy）：**這是保證數(shù)據(jù)質(zhì)量的關(guān)鍵步驟。

*瑞氏染色散點(diǎn)圖（FSCvsSSC）：初步區(qū)分細(xì)胞（FSC高，SSC高為活細(xì)胞；FSC低，SSC低為死細(xì)胞/碎片）。選擇活細(xì)胞群（如FSC/SSC相對(duì)高且集中的區(qū)域）。

*設(shè)門(mén)依據(jù)：根據(jù)細(xì)胞大小和復(fù)雜性的標(biāo)準(zhǔn)，排除明顯異常細(xì)胞（如巨大細(xì)胞、細(xì)胞碎片）。后續(xù)分析均基于此門(mén)內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行。

*亞群分析：如需分析特定亞群（如CD4+T細(xì)胞），先設(shè)總T細(xì)胞門(mén)（如CD3+），再在此門(mén)內(nèi)設(shè)CD4+門(mén)。

***(2)參數(shù)設(shè)置：**

*流速：根據(jù)細(xì)胞濃度調(diào)整，確保每個(gè)事件被充分檢測(cè)，避免擁擠效應(yīng)。通常設(shè)置為100-1000個(gè)事件/秒，根據(jù)細(xì)胞密度調(diào)整。

*激光功率：根據(jù)熒光強(qiáng)度選擇合適的激光功率，確保信號(hào)采集足夠，同時(shí)避免光漂白過(guò)快?？墒褂妙A(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

*電壓：設(shè)置檢測(cè)通道的電壓，確保熒光信號(hào)在探測(cè)器線(xiàn)性范圍內(nèi)。強(qiáng)度高的通道（如PE-Cy7）可能需要較低電壓，強(qiáng)度低的通道（如FITC）可能需要較高電壓。

*通道順序：盡量將高熒光通道（如Cy7）安排在低功率激光下檢測(cè)，避免對(duì)低熒光通道信號(hào)的影響。

***(3)數(shù)據(jù)收集：**收集足夠數(shù)量的細(xì)胞事件（通常>10^4，如分析亞群則需更多，如10^5-10^6）以保證統(tǒng)計(jì)學(xué)可靠性。

3.**數(shù)據(jù)處理：**

***(1)軟件選擇：**常用軟件如FlowJo,FCSExpress,Kaluza等。

***(2)數(shù)據(jù)整理：**將原始FCS文件導(dǎo)入軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)探查（如繪制散點(diǎn)圖、直方圖），確認(rèn)數(shù)據(jù)質(zhì)量和門(mén)區(qū)設(shè)置。

***(3)統(tǒng)計(jì)分析指標(biāo)：**

*陽(yáng)性率（PercentagePositive）：門(mén)內(nèi)目標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞占總門(mén)內(nèi)細(xì)胞的比例。

*絕對(duì)計(jì)數(shù)（AbsoluteCount）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)=陽(yáng)性率×總門(mén)內(nèi)細(xì)胞數(shù)。這對(duì)于臨床或?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)需要精確細(xì)胞數(shù)的場(chǎng)景非常重要。

*平均熒光強(qiáng)度（MeanFluorescenceIntensity,MFI）：反映細(xì)胞群體平均的熒光標(biāo)記水平。

*平均熒光強(qiáng)度（對(duì)數(shù)，MFI-log）：對(duì)MFI取對(duì)數(shù)，可更好地顯示數(shù)據(jù)分布，尤其當(dāng)標(biāo)記強(qiáng)度差異大時(shí)。

*中位數(shù)熒光強(qiáng)度（MedianFluorescenceIntensity,MFI）：反映細(xì)胞群體中位數(shù)的熒光標(biāo)記水平，對(duì)異常值不敏感。

***(4)結(jié)果可視化：**使用圖表（如直方圖、散點(diǎn)圖、餅圖）展示結(jié)果，并進(jìn)行必要的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)（如t檢驗(yàn)、ANOVA）比較不同組間差異。

**(三)WesternBlotting（蛋白質(zhì)印跡）-更多細(xì)節(jié)與優(yōu)化**

1.**蛋白質(zhì)提?。ɡm(xù)）：**

***(1)裂解緩沖液優(yōu)化：**

*蛋白酶抑制劑：RIPA裂解液需加入PMSF（蛋白酶抑制劑混合物），常用終濃度PMSF為1mmol/L。也可根據(jù)需要添加其他抑制劑（如Na?VO?、β-巰基乙醇、LeucineChloromethylKetone等）。

*脫氧核糖核酸酶（DNase）：若樣品富含基因組DNA（如組織），可加入DNaseI（如10units/μg總蛋白）去除DNA污染，防止其干擾電泳。

*脫脂奶粉/BSA：在后續(xù)封閉步驟中使用，封閉非特異性位點(diǎn)。

***(2)提取方法：**

*蛋白質(zhì)酶K（ProteinaseK）處理：對(duì)于某些難溶性蛋白或需要去除某些修飾（如磷酸化）的蛋白，可在提取后用ProteinaseK（如50μg/ml，37℃孵育30分鐘）處理，需預(yù)先加入DTT或β-巰基乙醇解除ProteinaseK的抑制。

*高效裂解：對(duì)于組織樣品，可使用組織研磨儀或超聲波處理（控制功率和時(shí)間，避免剪切DNA）提高裂解效率。

2.**SDS電泳（續(xù)）：**

***(1)膠濃度選擇：**

*分離膠：通常為10%-15%。10%適用于分子量較大的蛋白（>100kDa），12%-14%是常用范圍，可分離大多數(shù)蛋白（~15-200kDa）。膠濃度需根據(jù)目標(biāo)蛋白大小選擇。

*濃縮膠：通常為5%。確保樣品在進(jìn)入分離膠前被均勻混合和濃縮。

***(2)樣品準(zhǔn)備：**

*上樣緩沖液：含β-巰基乙醇（還原劑，打斷二硫鍵）和甘油（增加密度，使樣品沉入孔底）。常用濃度β-巰基乙醇為β-巰基乙醇/DTT0.1mol/L，甘油30%-50%。

*BSA/SDS載標(biāo)：可加入已知分子量的BSA載標(biāo)（如分子量范圍10-250kDa）和/或低濃度SDS（如0.05%）作為上樣參照，幫助判斷樣品加載量和遷移位置。

*樣品變性：100℃加熱3-5分鐘使蛋白完全變性。

***(3)電泳參數(shù)：**

*預(yù)電泳：在加樣前，在設(shè)定電壓（如10V/cm）下預(yù)電泳（如30分鐘），使樣品濃縮到加樣孔底部。

*分離膠電泳：設(shè)定電壓（如15-20V/cm），根據(jù)膠厚度和體積決定時(shí)間（通常1-2小時(shí)，直至溴酚藍(lán)遷移到膠底部1/3處）。

*濃縮膠電泳：電壓通常較低（如5-8V/cm），時(shí)間較短（如30分鐘）。

***(4)染色觀察：**電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)（CoomassieBrilliantBlueR-250或G-250）染色，觀察蛋白條帶是否清晰、連續(xù)，判斷電泳效果。

3.**轉(zhuǎn)膜與檢測(cè)（續(xù)）：**

***(1)轉(zhuǎn)膜條件優(yōu)化：**

*轉(zhuǎn)膜方法：PVDF膜比NC膜更致密，需預(yù)濕（PVDF膜在甲醇中浸泡20分鐘，NC膜在水中浸泡15分鐘），然后用TBST或Tris緩沖液平衡30分鐘。濕轉(zhuǎn)（使用濕轉(zhuǎn)槽）通常效果更好，膜結(jié)合更牢固。

*電壓與時(shí)間：標(biāo)準(zhǔn)濕轉(zhuǎn)條件為100V，1小時(shí)。干轉(zhuǎn)（使用半干轉(zhuǎn)電泳儀）通常電壓更高（如15-30V），時(shí)間更短（如30-60分鐘）。轉(zhuǎn)膜條件需根據(jù)膜類(lèi)型、膠濃度和蛋白大小優(yōu)化。可通過(guò)染色（如PonceauS）觀察轉(zhuǎn)膜效果（膜上應(yīng)清晰印出蛋白條帶）。

***(2)一抗孵育：**

*孵育容器：建議使用旋轉(zhuǎn)孵育器（如4℃過(guò)夜），確保抗體與膜充分接觸且均勻。

*孵育緩沖液：TBST或Tris緩沖液（含0.1%Tween-20）是常用洗滌液，在孵育時(shí)加入封閉液（如5%脫脂奶粉或5%BSA）。

*孵育濃度與時(shí)間：一抗?jié)舛刃鑳?yōu)化（通常1:1000-1:5000），孵育時(shí)間通常為1-2小時(shí)（室溫）或過(guò)夜（4℃）。首次實(shí)驗(yàn)建議嘗試不同濃度和時(shí)間，選擇信號(hào)最佳且背景最低的條件。

***(3)二抗孵育：**

*清洗：每次加抗體前必須徹底清洗（3-5次，每次5-10分鐘）。

*二抗選擇：根據(jù)一抗來(lái)源選擇物種相應(yīng)的二抗（如兔源一抗用羊抗兔二抗）。HRP標(biāo)記是最常用的，也有AlexaFluor標(biāo)記等熒光二抗。

*二抗?jié)舛龋和ǔ?:5000-1:20,000，需優(yōu)化。孵育時(shí)間通常為1小時(shí)（室溫）。

***(4)顯影與曝光：**

*ECL化學(xué)發(fā)光：加入ECL底物液，需避光操作。底物液通常分A液和B液，需按要求混合后立即使用，或按要求分裝后在-20℃保存。發(fā)光反應(yīng)時(shí)間通常為1-5分鐘，需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳時(shí)間，避免信號(hào)衰減或背景過(guò)高。

*曝光：使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（如ChemiDoc,GelDoc）拍攝圖像。曝光時(shí)間需根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度調(diào)整，確保圖像清晰且信號(hào)在相機(jī)動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)。建議使用不同曝光時(shí)間拍攝幾張，選擇最佳一張。

*底片記錄：傳統(tǒng)方法使用X光底片，需嚴(yán)格控制曝光時(shí)間和距離。

**五、實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與標(biāo)準(zhǔn)化**

1.**陽(yáng)性對(duì)照：**每個(gè)實(shí)驗(yàn)必須包含已知陽(yáng)性的對(duì)照樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，用于確認(rèn)檢測(cè)系統(tǒng)正常工作，能夠檢測(cè)到目標(biāo)蛋白。

2.**陰性對(duì)照：**

*空白對(duì)照：不加入任何抗體或檢測(cè)底物，用于評(píng)估背景信號(hào)。

*IgG對(duì)照（ELISA）：使用非特異性IgG作為包被或檢測(cè)抗體，用于評(píng)估非特異性結(jié)合。

*IgG對(duì)照（流式/WB）：使用與二抗同型但未結(jié)合靶標(biāo)的IgG（如兔IgG，若一抗是兔源），用于評(píng)估非特異性結(jié)合或背景熒光。

3.**重復(fù)實(shí)驗(yàn)：**關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)置生物學(xué)重復(fù)（不同細(xì)胞/組織來(lái)源）和/或技術(shù)重復(fù)（相同樣品平行操作），確保結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。

4.**標(biāo)準(zhǔn)化操作：**

*嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件：溫度、時(shí)間、pH、試劑濃度等。

*使用校準(zhǔn)過(guò)的儀器：定期校準(zhǔn)酶標(biāo)儀波長(zhǎng)、流式細(xì)胞儀激光功率和電壓、成像系統(tǒng)曝光時(shí)間等。

*操作人員培訓(xùn)：確保所有操作人員接受標(biāo)準(zhǔn)化操作規(guī)程（SOP）培訓(xùn)，減少人為誤差。

**六、數(shù)據(jù)記錄與報(bào)告**

1.**原始記錄：**詳細(xì)記錄實(shí)驗(yàn)日期、樣品信息、試劑批號(hào)、操作步驟、所有參數(shù)設(shè)置（如電泳電壓時(shí)間、孵育條件、酶標(biāo)儀讀數(shù)波長(zhǎng)等）、觀察到的現(xiàn)象（如顏色變化、細(xì)胞形態(tài)）、原始數(shù)據(jù)（如吸光度值、FCS文件）。

2.**結(jié)果報(bào)告：**清晰呈現(xiàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、方法、結(jié)果和結(jié)論。包括：

*圖表：標(biāo)準(zhǔn)化圖表（如標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)、散點(diǎn)圖、直方圖）展示數(shù)據(jù)。

*統(tǒng)計(jì)分析：報(bào)告統(tǒng)計(jì)顯著性（如p值）。

*誤差分析：討論實(shí)驗(yàn)誤差的來(lái)源和可能影響。

*附件：附上原始數(shù)據(jù)圖、對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。

一、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)概述

免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)是研究免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能及分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)方法，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域。本指南將系統(tǒng)介紹免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本操作流程、關(guān)鍵技術(shù)和注意事項(xiàng)，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與基礎(chǔ)操作

（一）實(shí)驗(yàn)環(huán)境與設(shè)備

1.實(shí)驗(yàn)環(huán)境：選擇潔凈、恒溫（20-25℃）、避光的環(huán)境，保持相對(duì)濕度在40%-60%。

2.常用設(shè)備：

-移液器（1ml、10ml、100ml等）

-高速離心機(jī)

-酶標(biāo)儀

-超凈工作臺(tái)

-恒溫孵育箱

3.試劑準(zhǔn)備：

-PBS緩沖液（pH7.4）

-乙醇、乙醚（用于固定）

-生理鹽水（0.9%）

（二）樣品處理

1.組織樣品：

(1)取材：新鮮組織用無(wú)菌刀片切割成1-2mm3小塊。

(2)固定：立即浸泡于4%多聚甲醛溶液中，4℃固定4-12小時(shí)。

(3)脫水：依次使用30%乙醇（1小時(shí)）、50%乙醇（1小時(shí)）、70%乙醇（2小時(shí)）梯度脫水。

2.細(xì)胞樣品：

(1)收集：離心收集細(xì)胞，棄上清。

(2)洗滌：用PBS緩沖液重懸并洗滌3次。

三、核心實(shí)驗(yàn)技術(shù)

（一）ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）

1.固定抗體：

(1)加樣：將包被抗體加入酶標(biāo)板孔中（100μl/孔），4℃過(guò)夜。

(2)洗滌：用PBST（含0.05%Tween-20）洗滌3次，每次5分鐘。

2.加樣檢測(cè)：

(1)加樣：加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（100μl/孔），37℃孵育1小時(shí)。

(2)顯色：加入TMB底物液（100μl/孔），避光反應(yīng)15-30分鐘。

(3)終止：加入2mol/LH?SO?（50μl/孔）終止反應(yīng)。

3.數(shù)據(jù)分析：用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)吸光度值，計(jì)算樣品濃度。

（二）流式細(xì)胞術(shù)分析

1.細(xì)胞染色：

(1)準(zhǔn)備：用FACSPermFix緩沖液固定細(xì)胞（1ml/10^6細(xì)胞）。

(2)染色：加入熒光標(biāo)記抗體（如CD3-FITC/CD8-PE，各10μl/10^6細(xì)胞），4℃避光孵育30分鐘。

2.上機(jī)檢測(cè)：

(1)設(shè)定門(mén)區(qū)：根據(jù)前向散射（FSC）和側(cè)向散射（SSC）參數(shù)設(shè)置細(xì)胞群體。

(2)收集數(shù)據(jù)：設(shè)1000個(gè)事件/細(xì)胞，收集至少10^5個(gè)細(xì)胞。

3.數(shù)據(jù)處理：用FlowJo軟件分析細(xì)胞陽(yáng)性率、絕對(duì)計(jì)數(shù)等指標(biāo)。

（三）WesternBlotting（蛋白質(zhì)印跡）

1.蛋白質(zhì)提?。?/p>

(1)裂解：加入RIPA裂解液（含PMSF），冰上孵育30分鐘。

(2)離心：12,000rpm離心10分鐘，取上清。

2.SDS電泳：

(1)配膠：制備12%分離膠和5%濃縮膠。

(2)加樣：每孔上樣50-100μg蛋白，100V預(yù)電泳30分鐘。

3.轉(zhuǎn)膜與檢測(cè)：

(1)轉(zhuǎn)膜：用PVDF膜，濕轉(zhuǎn)條件（100V，1小時(shí)）。

(2)封閉：5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)。

(3)一抗孵育：兔抗目標(biāo)蛋白抗體（1:1000），4℃過(guò)夜。

(4)二抗孵育：辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體（1:5000），室溫1小時(shí)。

(5)顯影：ECL化學(xué)發(fā)光液顯影，曝光1-5分鐘。

四、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

（一）無(wú)菌操作

1.所有接觸樣品的器械需高壓滅菌（121℃，15分鐘）。

2.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需佩戴手套，避免污染。

（二）試劑管理

1.熒光試劑避光保存，使用前置于冰盒。

2.底物液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍融。

（三）結(jié)果驗(yàn)證

1.ELISA需設(shè)置陰性對(duì)照（未包被板孔）。

2.流式細(xì)胞術(shù)需用同型對(duì)照抗體（如IgG同型對(duì)照）。

3.WesternBlotting需用內(nèi)參蛋白（如β-actin）校準(zhǔn)條帶亮度。

五、實(shí)驗(yàn)安全

1.操作化學(xué)試劑需佩戴護(hù)目鏡和耐酸堿手套。

2.高壓滅菌后器械需冷卻再取用。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，廢棄物需按生物安全規(guī)定處理。

**四、核心實(shí)驗(yàn)技術(shù)（續(xù)）**

**(一)ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）-更多細(xì)節(jié)與變體**

1.**固定抗體：**

***(1)包被條件優(yōu)化：**

*抗體濃度選擇：根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)或預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳工作濃度，通常為0.1-10μg/mL。可嘗試梯度濃度（如0.01,0.1,1,10μg/mL）進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇在檢測(cè)范圍內(nèi)信號(hào)最佳且背景最低的濃度。

*包被體積：通常為100μl/孔，確保抗體充分覆蓋孔底。

*包被溫度與時(shí)間：除4℃過(guò)夜外，也可選擇37℃孵育2-4小時(shí)。37℃孵育可加速抗體結(jié)合，但需嚴(yán)格控制時(shí)間以防背景升高。

***(2)洗滌細(xì)節(jié)：**

*洗滌液：使用含0.05%Tween-20的PBS（PBST）作為洗滌液，Tween-20可幫助去除未結(jié)合的抗體和蛋白質(zhì)，降低背景。

*洗滌次數(shù)與時(shí)間：標(biāo)準(zhǔn)流程為洗滌3-4次。每次洗滌建議使用洗板機(jī)，確保洗液充分浸潤(rùn)并充分排放。每次洗滌時(shí)間通常為5分鐘，可根據(jù)具體情況調(diào)整（如抗體濃度高可延長(zhǎng)至10分鐘）。

*洗滌設(shè)備：強(qiáng)烈推薦使用洗板機(jī)，確保洗滌一致性。若手動(dòng)洗滌，需確保每次都吸干凈孔內(nèi)液體。

2.**加樣檢測(cè)：**

***(1)樣品稀釋?zhuān)?*根據(jù)樣品濃度和預(yù)期信號(hào)強(qiáng)度，對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋?？上冗M(jìn)行系列稀釋?zhuān)ㄈ?:2,1:4,1:8...），通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳檢測(cè)范圍（信號(hào)在檢測(cè)儀線(xiàn)性區(qū)域內(nèi)）。

***(2)一抗/二抗孵育：**

*抗體濃度：同樣需根據(jù)說(shuō)明書(shū)和預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳工作濃度，通常為0.1-10μg/mL（一抗）或1:1000-1:5000（二抗）。

*孵育溫度：一抗通常在4℃孵育（增強(qiáng)特異性結(jié)合，延長(zhǎng)孵育時(shí)間可達(dá)12-24小時(shí)），二抗通常在37℃孵育（加速反應(yīng)，1-2小時(shí)）。有些特殊應(yīng)用（如磷酸化蛋白檢測(cè)）可能需要在室溫或特定緩沖液條件下進(jìn)行。

*孵育時(shí)間：一抗4℃過(guò)夜是常用方法。二抗37℃孵育1小時(shí)是標(biāo)準(zhǔn)，但也可根據(jù)抗體活性調(diào)整（如增強(qiáng)型二抗可能只需30分鐘）。細(xì)胞因子等小分子抗原檢測(cè)，有時(shí)需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間（如2-4小時(shí)）。

*封閉：在加入一抗前，用封閉液（如5%脫脂奶粉或5%BSA的PBST）封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，孵育1-2小時(shí)或過(guò)夜。封閉液濃度和孵育時(shí)間需優(yōu)化。

***(3)顯色：**

*底物選擇：HRP標(biāo)記通常使用TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）或ABTS（2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid)）作為底物。TMB呈黃綠色，ABTS呈藍(lán)色，均需加入H?SO?終止后變?yōu)辄S色或紫色，可在450nm（TMB）或414nm（ABTS）處檢測(cè)。

*顯色條件：TMB顯色通常在室溫避光條件下進(jìn)行15-30分鐘，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致背景升高。ABTS顯色可在室溫或37℃進(jìn)行，時(shí)間約10-30分鐘。顯色時(shí)間需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。

*顯色效率：觀察溶液顏色變化，若顏色過(guò)深（信號(hào)飽和）或過(guò)淺（信號(hào)不足），需調(diào)整樣品濃度或顯色時(shí)間。

***(4)終止：**

*終止液：使用2mol/LH?SO?（約180μl/孔）或4NHCl（約100μl/孔）。強(qiáng)酸，需小心操作。

*終止目的：使HRP酶失活，停止氧化底物，使顏色反應(yīng)達(dá)到最大值并穩(wěn)定。

*終止時(shí)間：加入終止液后，吸光度值會(huì)在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定，通常等待10-15分鐘。

3.**數(shù)據(jù)分析：**

***(1)儀器設(shè)置：**在酶標(biāo)儀上設(shè)置讀數(shù)波長(zhǎng)（如TMB為450nm，設(shè)參考波長(zhǎng)，通常是450-490nm之間的非吸收峰，如492nm）。設(shè)置讀數(shù)時(shí)間（如1-5秒，確保讀數(shù)穩(wěn)定）。

***(2)陰陽(yáng)性對(duì)照：**必須包含空白對(duì)照（空白板孔加樣品稀釋液，不加任何抗體）、標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照（已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品）和陰性對(duì)照（不含目標(biāo)抗原的樣品，經(jīng)同樣處理）。這些對(duì)照用于評(píng)估本底、校準(zhǔn)曲線(xiàn)和判斷結(jié)果有效性。

***(3)數(shù)據(jù)處理：**

*計(jì)算公式：通常使用`樣品吸光度=(樣品孔吸光度-空白孔吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)品孔吸光度-空白孔吸光度)*標(biāo)準(zhǔn)品濃度`計(jì)算樣品濃度。

*繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算后的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（通常為線(xiàn)性回歸，R2>0.95）。

*計(jì)算結(jié)果：將樣品吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程，得到樣品濃度。結(jié)果通常以pg/mL或ng/mL表示，需根據(jù)加樣體積和稀釋倍數(shù)進(jìn)行換算。

**(二)流式細(xì)胞術(shù)分析-更多細(xì)節(jié)與參數(shù)**

1.**細(xì)胞染色（續(xù)）：**

***(1)染色策略：**

*直標(biāo)法：所有抗體同時(shí)加入細(xì)胞懸液染色，然后固定、permeabilize（如需）。適用于檢測(cè)表面標(biāo)記和大部分細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記。

*雙標(biāo)法：先檢測(cè)表面標(biāo)記，再固定、通透后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記。可減少細(xì)胞表面抗原的脫失。

*苂光標(biāo)記選擇：根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)選擇合適的熒光素。常用組合如PE（橙色）配FITC（綠色），PE-Cy7配CD4-FITC，避免光譜重疊。標(biāo)記濃度需優(yōu)化，通常每個(gè)細(xì)胞10^-12至10^-15摩爾的抗體。

***(2)固定與通透：**

*固定：使用固定液（如Paraformaldehyde或Methanol）固定細(xì)胞膜，防止細(xì)胞溶解和抗原流失。Paraformaldehyde為化學(xué)固定，Methanol為低溫物理固定。固定后需用PBS洗滌。

*通透：對(duì)于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白（如磷酸化蛋白、轉(zhuǎn)錄因子），需使用通透劑（如0.1%Saponin或0.1%NP-40）。通透后需用PBS洗滌。

***(3)阻斷非特異性結(jié)合：**在加入第一抗體前，使用封閉劑（如1-5%BSA或5%正常血清）封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，孵育15-30分鐘。

2.**上機(jī)檢測(cè)：**

***(1)設(shè)門(mén)區(qū)（GatingStrategy）：**這是保證數(shù)據(jù)質(zhì)量的關(guān)鍵步驟。

*瑞氏染色散點(diǎn)圖（FSCvsSSC）：初步區(qū)分細(xì)胞（FSC高，SSC高為活細(xì)胞；FSC低，SSC低為死細(xì)胞/碎片）。選擇活細(xì)胞群（如FSC/SSC相對(duì)高且集中的區(qū)域）。

*設(shè)門(mén)依據(jù)：根據(jù)細(xì)胞大小和復(fù)雜性的標(biāo)準(zhǔn)，排除明顯異常細(xì)胞（如巨大細(xì)胞、細(xì)胞碎片）。后續(xù)分析均基于此門(mén)內(nèi)細(xì)胞進(jìn)行。

*亞群分析：如需分析特定亞群（如CD4+T細(xì)胞），先設(shè)總T細(xì)胞門(mén)（如CD3+），再在此門(mén)內(nèi)設(shè)CD4+門(mén)。

***(2)參數(shù)設(shè)置：**

*流速：根據(jù)細(xì)胞濃度調(diào)整，確保每個(gè)事件被充分檢測(cè)，避免擁擠效應(yīng)。通常設(shè)置為100-1000個(gè)事件/秒，根據(jù)細(xì)胞密度調(diào)整。

*激光功率：根據(jù)熒光強(qiáng)度選擇合適的激光功率，確保信號(hào)采集足夠，同時(shí)避免光漂白過(guò)快?？墒褂妙A(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

*電壓：設(shè)置檢測(cè)通道的電壓，確保熒光信號(hào)在探測(cè)器線(xiàn)性范圍內(nèi)。強(qiáng)度高的通道（如PE-Cy7）可能需要較低電壓，強(qiáng)度低的通道（如FITC）可能需要較高電壓。

*通道順序：盡量將高熒光通道（如Cy7）安排在低功率激光下檢測(cè)，避免對(duì)低熒光通道信號(hào)的影響。

***(3)數(shù)據(jù)收集：**收集足夠數(shù)量的細(xì)胞事件（通常>10^4，如分析亞群則需更多，如10^5-10^6）以保證統(tǒng)計(jì)學(xué)可靠性。

3.**數(shù)據(jù)處理：**

***(1)軟件選擇：**常用軟件如FlowJo,FCSExpress,Kaluza等。

***(2)數(shù)據(jù)整理：**將原始FCS文件導(dǎo)入軟件，進(jìn)行數(shù)據(jù)探查（如繪制散點(diǎn)圖、直方圖），確認(rèn)數(shù)據(jù)質(zhì)量和門(mén)區(qū)設(shè)置。

***(3)統(tǒng)計(jì)分析指標(biāo)：**

*陽(yáng)性率（PercentagePositive）：門(mén)內(nèi)目標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞占總門(mén)內(nèi)細(xì)胞的比例。

*絕對(duì)計(jì)數(shù)（AbsoluteCount）：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)=陽(yáng)性率×總門(mén)內(nèi)細(xì)胞數(shù)。這對(duì)于臨床或?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)需要精確細(xì)胞數(shù)的場(chǎng)景非常重要。

*平均熒光強(qiáng)度（MeanFluorescenceIntensity,MFI）：反映細(xì)胞群體平均的熒光標(biāo)記水平。

*平均熒光強(qiáng)度（對(duì)數(shù)，MFI-log）：對(duì)MFI取對(duì)數(shù)，可更好地顯示數(shù)據(jù)分布，尤其當(dāng)標(biāo)記強(qiáng)度差異大時(shí)。

*中位數(shù)熒光強(qiáng)度（MedianFluorescenceIntensity,MFI）：反映細(xì)胞群體中位數(shù)的熒光標(biāo)記水平，對(duì)異常值不敏感。

***(4)結(jié)果可視化：**使用圖表（如直方圖、散點(diǎn)圖、餅圖）展示結(jié)果，并進(jìn)行必要的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)（如t檢驗(yàn)、ANOVA）比較不同組間差異。

**(三)WesternBlotting（蛋白質(zhì)印跡）-更多細(xì)節(jié)與優(yōu)化**

1.**蛋白質(zhì)提?。ɡm(xù)）：**

***(1)裂解緩沖液優(yōu)化：**

*蛋白酶抑制劑：RIPA裂解液需加入PMSF（蛋白酶抑制劑混合物），常用終濃度PMSF為1mmol/L。也可根據(jù)需要添加其他抑制劑（如Na?VO?、β-巰基乙醇、LeucineChloromethylKetone等）。

*脫氧核糖核酸酶（DNase）：若樣品富含基因組DNA（如組織），可加入DNaseI（如10units/μg總蛋白）去除DNA污染，防止其干擾電泳。

*脫脂奶粉/BSA：在后續(xù)封閉步驟中使用，封閉非特異性位點(diǎn)。

***(2)提取方法：**

*蛋白質(zhì)酶K（ProteinaseK）處理：對(duì)于某些難溶性蛋白或需要去除某些修飾（如磷酸化）的蛋白，可在提取后用ProteinaseK（如50μg/ml，37℃孵育30分鐘）處理，需預(yù)先加入DTT或β-巰基乙醇解除ProteinaseK的抑制。

*高效裂解：對(duì)于組織樣品，可使用組織研磨儀或超聲波處理（控制功率和時(shí)間，避免剪切DNA）提高裂解效率。

2.**SDS電泳（續(xù)）：**

***(1)膠濃度選擇：**

*分離膠：通常為10%-15%。10%適用于分子量較大的蛋白（>100kDa），12%-14%是常用范圍，可分離大多數(shù)蛋白（~15-200kDa）。膠濃度需根據(jù)目標(biāo)蛋白大小選擇。

*濃縮膠：通常為5%。確保樣品在進(jìn)入分離膠前被均勻混合和濃縮。

***(2)樣品準(zhǔn)備：**

*上樣緩沖液：含β-巰基乙醇（還原劑，打斷二硫鍵）和甘油（增加密度，使樣品沉入孔底）。常用濃度β-巰基乙醇為β-巰基乙醇/DTT0.1mol/L，甘油30%-50%。

*BSA/SDS載標(biāo)：可加入已知分子量的BSA載標(biāo)（如分子量范圍10-250kDa）和/或低濃度SDS（如0.05%）作為上樣參照，幫助判斷樣品加載量和遷移位置。

*樣品變性：100℃加熱3-5分鐘使蛋白完全變性。

***(3)電泳參數(shù)：**

*預(yù)電泳：在加樣前，在設(shè)定電壓（如10V/cm）下預(yù)電泳（如30分鐘），使樣品濃縮到加樣孔底部。

*分離膠電泳：設(shè)定電壓（如15-20V/cm），根據(jù)膠厚度和體積決定時(shí)間（通常1-2小時(shí)，直至溴酚藍(lán)遷移到膠底部1/3處）。

*濃縮膠電泳：電壓通常較低（如5-8V/cm），時(shí)間較短（如30分鐘）。

***(4)染色觀察：**電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)（CoomassieBrilliantBlueR-250或G-250）染色，觀察蛋白條帶是否清晰、連續(xù)，判斷電泳效果。

3.**轉(zhuǎn)膜與檢測(cè)（續(xù)）：**

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