ICS65.020.01

CCSB16

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T3037—2023

向日葵主要種傳病原真菌室內(nèi)檢測(cè)

技術(shù)規(guī)程

Technicalcodeofpracticeforindoordetectionofmainspecies-

bornepathogenicfungiinsunflowerseeds

2023-05-11發(fā)布2023-06-11實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T3037—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧廳提出。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC20）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心。

本文件主要起草人：張之為、薩其仍貴、張鍵、張文兵、韓升才、楊佳樂、張立華、烏恩、高紅宇、

仇凱、王穎、呂明舉、趙素梅、張智芳、段鈞雷、杜超、劉佳、阿樂達(dá)日喜、薛青青。

I

DB15/T3037—2023

向日葵主要種傳病原真菌室內(nèi)檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了向日葵種子攜帶真菌的室內(nèi)檢測(cè)和鑒定技術(shù)。

本文件適用于室內(nèi)進(jìn)行向日葵種子帶黃萎病、枯萎病和黑斑病病原菌的檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語(yǔ)和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。

4向日葵種子樣本

用于檢測(cè)的向日葵種子來(lái)自市場(chǎng)上銷售的不同向日葵品種。每個(gè)向日葵品種隨機(jī)取100粒種子。

5向日葵種子帶真菌率的檢測(cè)與鑒定

向日葵種子真菌帶菌率的檢測(cè)

每一個(gè)向日葵品種隨機(jī)選擇100粒飽滿的種子。將種子外殼剝?nèi)?，取出籽仁，將籽仁放入蒸溜水?/p>

浸泡24h，用鑷子剝下種皮。種皮用70%乙醇浸泡1min，然后用無(wú)菌水漂洗兩次，每次1min。將種皮

放置在滅菌的濾紙上晾干后，放在新鮮制備的MNP-10選擇性培養(yǎng)基（見附錄A）進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為

24℃±2℃，每皿放置10個(gè)種皮。待種皮周圍出現(xiàn)菌落后，計(jì)數(shù)菌落的數(shù)量，統(tǒng)計(jì)種子帶菌率。計(jì)算

方式見公式（1）。

X=（A/B）×100%………………（1）

式中：

X——種子帶菌率；

A——帶菌的種子數(shù)；

B——供試的種子總數(shù)。

種皮攜帶真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

將菌落轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基上后，利用稀釋梯度法進(jìn)行單孢純化。對(duì)純化后菌株的菌落形態(tài)進(jìn)行

觀察并在顯微鏡下進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定。

向日葵黃萎病病、向日葵枯萎病及向日葵黑斑病病原菌特征見附錄B、附錄C、附錄D。

種皮攜帶真菌的分子生物學(xué)鑒定

1

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將在PDA平板培養(yǎng)基上擴(kuò)繁的真菌的菌落用蓋玻片刮下，轉(zhuǎn)入2mL的離心管中，然后采用CTAB方法

提取菌株的DNA，利用提取的DNA作為模板進(jìn)行PCR鑒定，引物為ITS1和ITS4。

引物信息：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’

PCR程序如下：

94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10

min。

取5.0μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，剩余的PCR產(chǎn)物用于測(cè)序分析。PCR產(chǎn)物測(cè)

序后獲得的序列在Genbank進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果中同源性達(dá)到99%以上的就可以確定種皮上攜帶真菌的

種名。

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A

A

附錄A

（資料性）

MNP-10培養(yǎng)基配方（500ml）

MNP-10培養(yǎng)基配方見表A.1。

表A.1為MNP-10培養(yǎng)基配方

配方組成滅菌方法

Part1PGA5.0g，NaOH4.0g121℃，15min

KNO31.0g，KH2PO41.0g，KCL0.5g，MgSO4.7H2O0.5g，

Part2121℃，15min

Tergitol0.5ml，瓊脂粉15.0g

Part3氯霉素25mg，鏈霉素25mg，金霉素25mg過濾滅菌

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B

B

附錄B

（資料性）

向日葵黃萎病病原菌形態(tài)

大麗輪枝孢菌是引起向日葵黃萎病的主要真菌。大麗輪枝孢菌的菌體初期無(wú)色，老熟后變?yōu)楹稚?/p>

有隔膜。菌絲上生長(zhǎng)直立無(wú)色的輪狀分生孢子梗，一般為2～4輪生，每輪著生3～5個(gè)小枝，多者為7枝，

呈輻射狀。分生孢子梗長(zhǎng)110μm～130μm，無(wú)色纖細(xì),基部略膨大呈輪狀分枝，分枝大小13.7μm～21.4

μm×2.3μm～9.1μm。分生孢子一般著生在分生孢子梗的頂枝和分枝頂端，分生孢子長(zhǎng)卵圓形，單孢

子，無(wú)色或微黃，纖細(xì)基部略膨大，大小2.3μm～9.1μm×1.5μm～3.0μm。當(dāng)條件不適合時(shí)，菌絲體

細(xì)胞壁加厚成為串狀黑褐色的厚垣飽子(扁圓型)或膨脹成為瘤狀的黑色微菌核，大小30μm～50μm，近

球形或長(zhǎng)條形（見圖B.1）。