基于酵母雙雜交系統(tǒng)解析水稻條紋病毒與寄主水稻互作機(jī)制的研究一、引言1.1研究背景與意義水稻作為全球最重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量和質(zhì)量直接關(guān)系到糧食安全和人類生活。然而，水稻生長過程中面臨著多種病蟲害的威脅，其中水稻條紋病毒（Ricestripevirus，RSV）引發(fā)的水稻條紋葉枯病是影響水稻生產(chǎn)的重要病害之一。水稻條紋病毒主要由介體昆蟲灰飛虱傳播，一旦水稻感染該病毒，發(fā)病初期病株心葉沿葉脈會呈現(xiàn)斷續(xù)的黃綠色或黃白色短條斑，隨后常連成褪綠大片，致使葉片一半或大半變?yōu)辄S白色。早期發(fā)病的植株會枯死，發(fā)病較遲的則僅在劍葉或葉鞘上出現(xiàn)褪色斑，且抽穗不良或穗畸形不實(shí)，病株分蘗一般也會減少。水稻條紋葉枯病最早于1897年在日本被發(fā)現(xiàn)，在我國，自1963年于蘇南地區(qū)始發(fā)后，已擴(kuò)散至18個(gè)省市。尤其是近年來，在江蘇和河南等地連續(xù)暴發(fā)，給水稻生產(chǎn)帶來了巨大損失。例如，2001年該病害在江蘇、河南等地暴發(fā)流行，病田率達(dá)50%以上；2004年再次大規(guī)模流行，病田率達(dá)75%以上，并且自2004年起該病持續(xù)流行，對水稻生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。水稻條紋病毒的危害不僅導(dǎo)致水稻產(chǎn)量的直接減少，還會影響稻米的品質(zhì)，進(jìn)而影響農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入和糧食市場的穩(wěn)定。深入研究水稻條紋病毒與寄主水稻之間的互作機(jī)制具有至關(guān)重要的意義。從理論層面來看，這有助于我們深入理解病毒的致病機(jī)理、病毒在寄主體內(nèi)的侵染、復(fù)制、傳播等過程，以及寄主植物的抗病防御機(jī)制，豐富植物與病毒互作的理論知識體系。在實(shí)踐應(yīng)用方面，對互作機(jī)制的了解能夠?yàn)殚_發(fā)新的病害防控策略提供關(guān)鍵依據(jù)。通過明確病毒與寄主互作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和分子靶點(diǎn)，我們可以有針對性地設(shè)計(jì)和篩選抗病品種，利用基因工程技術(shù)培育具有抗性的水稻新品種，從而增強(qiáng)水稻對條紋病毒的抵抗力；也能夠?yàn)殚_發(fā)新型的抗病毒藥劑提供思路，研發(fā)出能夠干擾病毒與寄主互作過程的藥物，有效抑制病毒的侵染和傳播。此外，掌握病毒與寄主的互作機(jī)制還有助于優(yōu)化病害的預(yù)測預(yù)報(bào)方法，提高對水稻條紋葉枯病的監(jiān)測和防控能力，減少病害造成的損失，保障水稻的安全生產(chǎn)和糧食供應(yīng)的穩(wěn)定。酵母雙雜交系統(tǒng)作為一種研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的強(qiáng)大工具，在解析病毒與寄主互作機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。它能夠在真核細(xì)胞內(nèi)檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用，具有靈敏度高、高通量、能夠檢測到微弱相互作用等優(yōu)點(diǎn)。通過構(gòu)建水稻條紋病毒蛋白的誘餌載體和水稻cDNA文庫，利用酵母雙雜交系統(tǒng)可以大規(guī)模篩選與病毒蛋白相互作用的水稻寄主蛋白，從而揭示病毒與寄主之間復(fù)雜的分子互作網(wǎng)絡(luò)。這種研究方法為深入探究水稻條紋病毒與寄主水稻之間的互作機(jī)制提供了有效的技術(shù)手段，有助于我們?nèi)媪私獠《?寄主互作的分子基礎(chǔ)，為防控水稻條紋葉枯病提供新的策略和方法。1.2研究目的本研究旨在運(yùn)用酵母雙雜交系統(tǒng)，深入剖析水稻條紋病毒與寄主水稻之間的相互作用，具體研究目的如下：篩選水稻條紋病毒與水稻寄主的互作蛋白：構(gòu)建水稻條紋病毒各蛋白的誘餌載體以及水稻cDNA文庫，借助酵母雙雜交系統(tǒng)，大規(guī)模篩選出與水稻條紋病毒蛋白相互作用的水稻寄主蛋白，明確參與病毒-寄主互作過程的關(guān)鍵蛋白，豐富對兩者互作分子網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識。分析互作蛋白的功能與互作機(jī)制：對篩選得到的互作蛋白進(jìn)行功能注釋和分析，探究它們在水稻生長發(fā)育、生理代謝以及抗病防御等過程中的作用；通過多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如蛋白質(zhì)免疫共沉淀（Co-IP）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）、表面等離子共振（SPR）等，驗(yàn)證酵母雙雜交系統(tǒng)篩選結(jié)果的可靠性，并深入解析水稻條紋病毒蛋白與水稻寄主蛋白之間的互作機(jī)制，包括互作的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)、結(jié)合位點(diǎn)、互作后的信號傳導(dǎo)途徑等。揭示水稻條紋病毒的致病機(jī)制：基于互作蛋白及互作機(jī)制的研究結(jié)果，從分子層面闡述水稻條紋病毒如何侵染水稻寄主、干擾寄主正常生理功能、引發(fā)水稻條紋葉枯病癥狀的過程，為全面理解水稻條紋病毒的致病機(jī)理提供理論依據(jù)。為水稻抗病育種提供理論基礎(chǔ)：通過對水稻條紋病毒與寄主水稻互作機(jī)制的研究，挖掘出水稻中潛在的抗病基因和分子靶點(diǎn)，為利用基因工程技術(shù)培育抗水稻條紋病毒的水稻新品種提供理論指導(dǎo)和基因資源，推動(dòng)水稻抗病育種工作的發(fā)展，提高水稻對條紋葉枯病的抗性，保障水稻的安全生產(chǎn)。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在病毒與寄主互作的研究領(lǐng)域，酵母雙雜交系統(tǒng)已成為一種廣泛應(yīng)用且極為有效的工具。國內(nèi)外眾多學(xué)者運(yùn)用該系統(tǒng)對多種病毒與寄主的互作機(jī)制展開了深入探究，并取得了一系列豐碩成果。在動(dòng)物病毒研究方面，對人類免疫缺陷病毒（HIV）與宿主細(xì)胞蛋白互作的研究，借助酵母雙雜交系統(tǒng)，成功鑒定出多個(gè)與HIV病毒蛋白相互作用的宿主細(xì)胞蛋白，這些互作蛋白參與了病毒的侵染、整合、轉(zhuǎn)錄以及免疫逃逸等關(guān)鍵過程，為抗HIV藥物的研發(fā)和治療策略的制定提供了關(guān)鍵靶點(diǎn)和理論支撐。在植物病毒領(lǐng)域，針對煙草花葉病毒（TMV）與煙草寄主的互作研究中，利用酵母雙雜交技術(shù)篩選出了一系列與TMV蛋白互作的煙草蛋白，揭示了病毒侵染過程中對植物光合作用、激素信號傳導(dǎo)以及防御反應(yīng)等生理過程的干擾機(jī)制，為煙草抗病毒育種提供了重要的基因資源和理論依據(jù)。關(guān)于水稻條紋病毒與水稻寄主互作的研究，近年來也取得了一定進(jìn)展。寧波大學(xué)陳劍平院士團(tuán)隊(duì)以RSVp3蛋白為誘餌，通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到一個(gè)宿主未知功能蛋白NbP3IP與其互作，深入研究發(fā)現(xiàn)NbP3IP介導(dǎo)了p3的自噬途徑的降解，并利用自噬途徑抑制子3-MA處理或者沉默自噬相關(guān)基因ATG5、ATG7，證實(shí)了它們對NbP3IP降解p3的抑制作用，還發(fā)現(xiàn)RSV侵染能誘導(dǎo)自噬并受其負(fù)調(diào)控作用，該研究首次揭示自噬負(fù)調(diào)控負(fù)義鏈RNA病毒的侵染。此外，該團(tuán)隊(duì)還報(bào)道了寄主植物類泛素蛋白5（UBL5）與水稻條紋病毒沉默抑制子p3蛋白互作，介導(dǎo)其通過26S蛋白酶體途徑降解p3，抑制水稻條紋病毒的侵染，揭示了UBL5的新作用機(jī)制，也揭示了植物抵抗病毒侵染的一條新途徑。然而，當(dāng)前對于水稻條紋病毒與水稻寄主互作的研究仍存在諸多不足與空白。已鑒定出的互作蛋白數(shù)量有限，難以全面描繪病毒與寄主之間復(fù)雜的分子互作網(wǎng)絡(luò)，對于許多互作蛋白在病毒侵染和寄主防御過程中的具體功能和作用機(jī)制尚不明確。在互作機(jī)制的研究方面，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些如自噬、蛋白酶體降解等參與病毒-寄主互作的途徑，但這些途徑之間的相互關(guān)系以及它們?nèi)绾螀f(xié)同調(diào)控病毒侵染和寄主防御反應(yīng)，仍有待深入探究。此外，目前的研究主要集中在少數(shù)幾個(gè)病毒蛋白與寄主蛋白的互作上，對于水稻條紋病毒其他蛋白，如RNA聚合酶、移動(dòng)蛋白等與寄主蛋白的互作研究相對較少，這限制了我們對病毒侵染全過程的理解。在研究方法上，酵母雙雜交系統(tǒng)雖然是一種強(qiáng)大的工具，但也存在一定的假陽性和假陰性問題，需要結(jié)合更多的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如蛋白質(zhì)免疫共沉淀、熒光共振能量轉(zhuǎn)移等，來驗(yàn)證和深入研究蛋白-蛋白之間的相互作用。二、酵母雙雜交系統(tǒng)概述2.1酵母雙雜交系統(tǒng)的原理酵母雙雜交系統(tǒng)的建立基于對真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄起始過程的深入認(rèn)識。眾多研究表明，許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子具備兩個(gè)可分離且功能相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，即DNA結(jié)合域（DNAbindingdomain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活域（transcriptionactivationdomain，AD）。以酵母的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4為例，其N端包含由147個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合域，能夠特異性識別并結(jié)合到基因上游激活序列（upstreamactivatingsequence，UAS）上；C端則是由113個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域，它可與轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分相互作用，進(jìn)而啟動(dòng)UAS下游基因的轉(zhuǎn)錄。在酵母雙雜交系統(tǒng)中，這一特性被巧妙應(yīng)用。將已知的水稻條紋病毒蛋白的cDNA序列作為“誘餌”（bait），與DNA結(jié)合域融合，構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒。同時(shí)，將水稻cDNA文庫中的待篩選蛋白的cDNA序列與轉(zhuǎn)錄激活域融合，形成文庫質(zhì)粒。當(dāng)這兩個(gè)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中時(shí)，如果誘餌蛋白（即水稻條紋病毒蛋白）能夠與待篩選的水稻寄主蛋白（獵物蛋白，prey）發(fā)生特異性相互作用，那么原本分離的DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域就會在空間上靠近，從而使轉(zhuǎn)錄激活域能夠招募轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，啟動(dòng)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。報(bào)告基因通常選用一些易于檢測的基因，如編碼β-半乳糖苷酶（LacZ）、組氨酸（His）、亮氨酸（Leu）、腺嘌呤（Ade）等的基因。通過檢測報(bào)告基因的表達(dá)情況，就能夠判斷誘餌蛋白與獵物蛋白之間是否存在相互作用。例如，若報(bào)告基因LacZ表達(dá)，其編碼的β-半乳糖苷酶可將底物X-α-gal分解，使酵母菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，表明誘餌蛋白與獵物蛋白發(fā)生了相互作用；若報(bào)告基因His表達(dá)，酵母細(xì)胞則能夠在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上生長，也暗示了蛋白間的相互作用。這種基于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)和功能特性的酵母雙雜交系統(tǒng)，能夠在真核細(xì)胞內(nèi)模擬蛋白質(zhì)的天然環(huán)境，有效檢測蛋白質(zhì)之間的相互作用，為研究水稻條紋病毒與寄主水稻之間的分子互作機(jī)制提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持。2.2酵母雙雜交系統(tǒng)的組成2.2.1誘餌蛋白表達(dá)載體誘餌蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建是酵母雙雜交系統(tǒng)的關(guān)鍵步驟之一，其質(zhì)量直接影響到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的成敗。在構(gòu)建水稻條紋病毒蛋白的誘餌表達(dá)載體時(shí)，首先需要從水稻條紋病毒的基因組中克隆出目標(biāo)蛋白的基因序列。這一過程通常采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，根據(jù)已知的水稻條紋病毒基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物，以病毒RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴(kuò)增得到目標(biāo)蛋白的cDNA序列。隨后，將擴(kuò)增得到的cDNA序列與DNA結(jié)合域（BD）進(jìn)行融合。常用的DNA結(jié)合域來源于酵母轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4的N端結(jié)構(gòu)域，其具有能夠特異性識別并結(jié)合到基因上游激活序列（UAS）的功能。為實(shí)現(xiàn)兩者的融合，需要選擇合適的載體。目前，市面上有多種商業(yè)化的誘餌表達(dá)載體可供選擇，如pGBKT7、pLexA等。以pGBKT7載體為例，它含有GAL4DNA結(jié)合域編碼序列、酵母篩選標(biāo)記基因（如TRP1，用于在缺乏色氨酸的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化成功的酵母細(xì)胞）以及細(xì)菌篩選標(biāo)記基因（如氨芐青霉素抗性基因，用于在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌）。將目標(biāo)蛋白的cDNA序列通過限制性內(nèi)切酶酶切和連接反應(yīng)，插入到pGBKT7載體中GAL4DNA結(jié)合域編碼序列的下游，使其與GAL4DNA結(jié)合域形成融合基因。在酶切和連接過程中，需要嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，確保酶切完全且連接效率高，同時(shí)要注意避免載體自身環(huán)化等問題。構(gòu)建好的誘餌表達(dá)載體需要進(jìn)行驗(yàn)證。首先，通過PCR鑒定，使用插入片段兩端的特異性引物對重組質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，若能得到預(yù)期大小的條帶，則初步表明目標(biāo)基因已成功插入載體。接著，進(jìn)行測序驗(yàn)證，將PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送至專業(yè)測序公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與目標(biāo)蛋白的基因序列進(jìn)行比對，確認(rèn)插入序列的準(zhǔn)確性，排除基因突變、堿基缺失或錯(cuò)配等情況。此外，還需檢測誘餌蛋白在酵母細(xì)胞中的表達(dá)情況，可通過提取酵母細(xì)胞總蛋白，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，使用針對目標(biāo)蛋白或GAL4DNA結(jié)合域的特異性抗體，檢測融合蛋白的表達(dá)水平和分子量大小，確保誘餌蛋白能夠在酵母細(xì)胞中正確表達(dá)。同時(shí)，為避免誘餌蛋白自身具有轉(zhuǎn)錄激活活性，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，還需進(jìn)行自激活檢測。將構(gòu)建好的誘餌表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中，涂布在缺乏色氨酸且含有報(bào)告基因（如HIS3、LacZ等）的選擇性培養(yǎng)基上，若酵母細(xì)胞能夠在該培養(yǎng)基上生長且報(bào)告基因表達(dá)（如LacZ基因表達(dá)使菌落變藍(lán)），則說明誘餌蛋白具有自激活活性，需要對誘餌蛋白進(jìn)行改造或更換，如對誘餌蛋白進(jìn)行截短處理，去除可能導(dǎo)致自激活的結(jié)構(gòu)域。只有經(jīng)過全面驗(yàn)證且無自激活活性的誘餌表達(dá)載體，才能用于后續(xù)的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)。2.2.2獵物蛋白表達(dá)載體獵物蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建旨在將水稻寄主蛋白基因與轉(zhuǎn)錄激活域（AD）融合，從而實(shí)現(xiàn)對與水稻條紋病毒蛋白互作的寄主蛋白的篩選。在構(gòu)建過程中，首先要從水稻組織中提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA，這一cDNA將作為構(gòu)建文庫的基礎(chǔ)材料。利用逆轉(zhuǎn)錄酶，以總RNA為模板，在引物的引導(dǎo)下合成cDNA第一鏈，隨后通過PCR擴(kuò)增等方法獲得雙鏈cDNA。在這一過程中，確保RNA的完整性和純度至關(guān)重要，因?yàn)楦哔|(zhì)量的RNA是獲得高質(zhì)量cDNA的前提，而RNA的降解或雜質(zhì)污染可能導(dǎo)致cDNA合成失敗或合成的cDNA質(zhì)量不佳，影響后續(xù)文庫的構(gòu)建和篩選。將雙鏈cDNA與轉(zhuǎn)錄激活域（AD）載體進(jìn)行連接，常用的AD載體如pGADT7，其含有AD編碼序列、酵母篩選標(biāo)記基因（如LEU2，用于在缺乏亮氨酸的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化成功的酵母細(xì)胞）以及其他有助于基因表達(dá)和載體篩選的元件。通過限制性內(nèi)切酶酶切和連接反應(yīng)，使cDNA片段與AD編碼序列融合，形成一系列包含不同水稻寄主蛋白基因與AD融合的重組質(zhì)粒，這些重組質(zhì)粒共同構(gòu)成了水稻cDNA文庫。在連接反應(yīng)中，需優(yōu)化連接條件，如調(diào)整DNA片段與載體的比例、反應(yīng)溫度和時(shí)間等，以提高連接效率，增加文庫中重組質(zhì)粒的多樣性。將構(gòu)建好的水稻cDNA文庫轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中，使其能夠表達(dá)獵物蛋白。轉(zhuǎn)化方法通常采用醋酸鋰介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，該方法通過使酵母細(xì)胞處于感受態(tài)，增加細(xì)胞膜對DNA的通透性，從而使重組質(zhì)粒能夠進(jìn)入酵母細(xì)胞。在轉(zhuǎn)化過程中，需要嚴(yán)格控制各種參數(shù)，如酵母細(xì)胞的生長狀態(tài)、醋酸鋰的濃度、轉(zhuǎn)化時(shí)的溫度和時(shí)間等，以確保較高的轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞涂布在缺乏亮氨酸的選擇性培養(yǎng)基上，篩選出成功轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞，這些酵母細(xì)胞中含有表達(dá)不同獵物蛋白的重組質(zhì)粒。獵物蛋白表達(dá)載體與誘餌蛋白表達(dá)載體需具有良好的兼容性，以保證在酵母細(xì)胞內(nèi)能夠正常表達(dá)并相互作用。這要求兩者在酵母細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中不會相互干擾，并且它們所攜帶的篩選標(biāo)記基因能夠在相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上獨(dú)立發(fā)揮作用。例如，誘餌表達(dá)載體pGBKT7的篩選標(biāo)記基因TRP1和獵物表達(dá)載體pGADT7的篩選標(biāo)記基因LEU2，可分別在缺乏色氨酸和亮氨酸的培養(yǎng)基上篩選出含有相應(yīng)載體的酵母細(xì)胞，互不影響。同時(shí)，載體的啟動(dòng)子、終止子等元件也需相互協(xié)調(diào)，確保融合蛋白的正確表達(dá)。此外，在實(shí)驗(yàn)前可通過預(yù)實(shí)驗(yàn)對載體的兼容性進(jìn)行驗(yàn)證，將已知相互作用的蛋白分別構(gòu)建到誘餌和獵物表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，觀察報(bào)告基因的表達(dá)情況，若報(bào)告基因正常表達(dá)，說明載體兼容性良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.2.3報(bào)告基因及宿主菌株在酵母雙雜交系統(tǒng)中，報(bào)告基因起著至關(guān)重要的作用，它是檢測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)鍵指標(biāo)。常用的報(bào)告基因包括LacZ、HIS3、ADE2、LEU2等。以LacZ為例，其編碼β-半乳糖苷酶，當(dāng)誘餌蛋白與獵物蛋白發(fā)生相互作用，使轉(zhuǎn)錄激活域靠近DNA結(jié)合域，激活報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄時(shí)，LacZ基因表達(dá)產(chǎn)生β-半乳糖苷酶。該酶可將底物X-α-gal分解，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，從而使含有相互作用蛋白的酵母菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，便于直觀篩選。HIS3基因編碼組氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，只有當(dāng)報(bào)告基因HIS3表達(dá)時(shí)，酵母細(xì)胞才能合成組氨酸并生長，以此來判斷蛋白間是否存在相互作用。適合酵母雙雜交系統(tǒng)的宿主菌株有多種，如AH109、Y187等。以AH109菌株為例，它是一種常用的酵母雙雜交宿主菌株，其基因組中整合了多個(gè)報(bào)告基因，如HIS3、ADE2、LacZ和MEL1等。這些報(bào)告基因分別受不同的啟動(dòng)子調(diào)控，可通過不同的篩選條件進(jìn)行檢測，增加了篩選的嚴(yán)謹(jǐn)性和可靠性。AH109菌株還具有營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，如trp1、leu2、ura3等，使其只能在含有相應(yīng)營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基上生長。當(dāng)轉(zhuǎn)化了含有互補(bǔ)營養(yǎng)標(biāo)記基因（如TRP1、LEU2、URA3）的重組質(zhì)粒后，可在缺乏相應(yīng)營養(yǎng)成分的選擇性培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)化成功的酵母細(xì)胞。此外，AH109菌株對重組質(zhì)粒具有較好的耐受性，能夠穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，且生長特性良好，便于實(shí)驗(yàn)操作和培養(yǎng)。宿主菌株的特性對報(bào)告基因的表達(dá)有著顯著影響。不同的宿主菌株可能具有不同的遺傳背景、代謝途徑和生理狀態(tài)，這些因素會影響報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及蛋白的穩(wěn)定性和活性。例如，某些宿主菌株可能存在一些內(nèi)源蛋白，它們會與報(bào)告基因的調(diào)控元件相互作用，從而干擾報(bào)告基因的正常表達(dá)。一些菌株的轉(zhuǎn)錄因子活性可能存在差異，導(dǎo)致對報(bào)告基因啟動(dòng)子的激活能力不同。因此，在選擇宿主菌株時(shí)，需要綜合考慮其對報(bào)告基因表達(dá)的影響，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)評估不同菌株在相同實(shí)驗(yàn)條件下報(bào)告基因的表達(dá)情況，選擇最適合的宿主菌株，以確保酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。2.3酵母雙雜交系統(tǒng)的技術(shù)流程2.3.1誘餌蛋白的準(zhǔn)備與驗(yàn)證在研究水稻條紋病毒與寄主水稻的互作中，獲取水稻條紋病毒蛋白基因是開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)的首要任務(wù)。首先，從感染水稻條紋病毒的水稻植株中提取病毒粒子，通過RNA提取試劑盒提取病毒RNA。依據(jù)已公布的水稻條紋病毒基因組序列，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件，如PrimerPremier5.0，精心設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)，需充分考慮引物的長度、GC含量、Tm值等因素，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。以提取的病毒RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)蛋白基因。在RT-PCR反應(yīng)體系中，加入逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs、引物等成分，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，再通過PCR擴(kuò)增得到雙鏈cDNA。反應(yīng)過程嚴(yán)格按照儀器操作手冊和試劑說明書進(jìn)行，精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，如逆轉(zhuǎn)錄階段一般在42℃反應(yīng)60分鐘，PCR擴(kuò)增時(shí)，95℃預(yù)變性3分鐘，然后95℃變性30秒、55-60℃退火30秒、72℃延伸1-2分鐘，共進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增得到的水稻條紋病毒蛋白基因需與合適的DNA結(jié)合域載體連接，構(gòu)建誘餌載體。選用pGBKT7載體作為DNA結(jié)合域載體，該載體含有GAL4DNA結(jié)合域編碼序列、酵母篩選標(biāo)記基因TRP1以及細(xì)菌篩選標(biāo)記基因氨芐青霉素抗性基因。用限制性內(nèi)切酶，如EcoRI和BamHI，對擴(kuò)增的目標(biāo)基因和pGBKT7載體進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)在適宜的緩沖液中進(jìn)行，37℃孵育2-3小時(shí)，確保酶切完全。酶切后的目標(biāo)基因片段和載體片段通過T4DNA連接酶進(jìn)行連接，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，使用目標(biāo)基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，若能得到預(yù)期大小的條帶，則初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。對菌落PCR鑒定為陽性的克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和測序驗(yàn)證，確保插入的水稻條紋病毒蛋白基因序列準(zhǔn)確無誤。將構(gòu)建好的誘餌載體轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中，常用的酵母菌株為AH109。采用醋酸鋰介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，先將酵母細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細(xì)胞并用無菌水洗滌兩次，再用1×TE/LiAc溶液重懸細(xì)胞，使其成為感受態(tài)細(xì)胞。將誘餌載體質(zhì)粒與感受態(tài)酵母細(xì)胞混合，加入鮭魚精單鏈DNA作為載體DNA，再加入PEG/LiAc溶液，充分混勻后，30℃孵育30分鐘，然后42℃熱激15分鐘，冰浴冷卻2分鐘，離心棄上清，用1×TE溶液重懸細(xì)胞，涂布在缺乏色氨酸的SD培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)2-3天，篩選出轉(zhuǎn)化成功的酵母細(xì)胞。為確保誘餌蛋白在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中的可靠性，需驗(yàn)證其無自激活活性和細(xì)胞毒性。將轉(zhuǎn)化了誘餌載體的酵母細(xì)胞分別涂布在缺乏色氨酸的SD培養(yǎng)基平板（SD/-Trp）、缺乏色氨酸和組氨酸的SD培養(yǎng)基平板（SD/-Trp/-His）以及缺乏色氨酸、組氨酸和腺嘌呤的SD培養(yǎng)基平板（SD/-Trp/-His/-Ade）上。若酵母細(xì)胞在SD/-Trp平板上正常生長，而在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-His/-Ade平板上不能生長，表明誘餌蛋白無自激活活性。同時(shí)，觀察轉(zhuǎn)化了誘餌載體的酵母細(xì)胞在SD/-Trp平板上的生長狀態(tài)，與未轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞生長狀態(tài)進(jìn)行對比，若兩者生長情況無明顯差異，則說明誘餌蛋白對酵母細(xì)胞無明顯毒性。只有經(jīng)過驗(yàn)證無自激活活性和細(xì)胞毒性的誘餌蛋白，才能用于后續(xù)的酵母雙雜交篩選實(shí)驗(yàn)。2.3.2水稻cDNA文庫的構(gòu)建構(gòu)建水稻cDNA文庫是篩選與水稻條紋病毒蛋白互作的寄主蛋白的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。首先，選取健康的水稻植株，采集其葉片、莖稈、根等組織，迅速放入液氮中冷凍保存，以防止RNA降解。采用TRIzol試劑法提取水稻總RNA，將組織樣品在液氮中研磨成粉末狀，加入TRIzol試劑，充分勻漿后，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。加入氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，然后4℃、12000g離心15分鐘，此時(shí)溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后，室溫靜置10分鐘，4℃、12000g離心10分鐘，此時(shí)RNA沉淀在離心管底部。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀兩次，4℃、7500g離心5分鐘，棄去乙醇，將RNA沉淀晾干，用適量的RNase-free水溶解RNA。通過核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，OD260/OD230比值大于2.0，同時(shí)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，且28SrRNA的亮度約為18SrRNA的2倍，表明RNA質(zhì)量良好。以提取的高質(zhì)量水稻總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物，在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，加入總RNA、隨機(jī)引物、dNTPs、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、緩沖液等成分，先在70℃孵育5分鐘，使RNA變性，然后迅速置于冰上冷卻，再加入反轉(zhuǎn)錄酶，42℃孵育60分鐘，最后70℃加熱15分鐘，使反轉(zhuǎn)錄酶失活，得到cDNA第一鏈。以cDNA第一鏈為模板，使用DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到雙鏈cDNA。在PCR反應(yīng)體系中，加入cDNA第一鏈、dNTPs、引物、DNA聚合酶、緩沖液等，經(jīng)過95℃預(yù)變性3分鐘，然后95℃變性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸2分鐘，共進(jìn)行20-25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增后的雙鏈cDNA通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，觀察cDNA的大小分布情況。將合成的雙鏈cDNA與轉(zhuǎn)錄激活域載體pGADT7進(jìn)行連接，構(gòu)建cDNA文庫。用限制性內(nèi)切酶SmaI對pGADT7載體進(jìn)行酶切，使其線性化，然后將雙鏈cDNA與線性化的pGADT7載體在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞中，采用電轉(zhuǎn)化法或化學(xué)轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。電轉(zhuǎn)化時(shí)，將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混合，加入到電擊杯中，設(shè)置合適的電壓、電容和電阻等參數(shù)，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化時(shí)，將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30分鐘，然后42℃熱激90秒，迅速置于冰上冷卻2分鐘，加入SOC培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)胞復(fù)蘇。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素和X-Gal的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取白色菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定，使用pGADT7載體上的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測插入片段的大小和陽性克隆率。對菌落PCR鑒定為陽性的克隆進(jìn)行測序，分析插入片段的序列信息，評估文庫的質(zhì)量和多樣性。為確保文庫的質(zhì)量，需對構(gòu)建好的水稻cDNA文庫進(jìn)行質(zhì)量檢測。首先，測定文庫的滴度，將文庫菌液進(jìn)行梯度稀釋，涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜，次日計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)，根據(jù)公式計(jì)算文庫滴度，文庫滴度應(yīng)達(dá)到1×10^6-1×10^8cfu/mL。然后，檢測文庫的插入片段大小，隨機(jī)挑取多個(gè)陽性克隆，提取質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶酶切或PCR擴(kuò)增的方法，檢測插入片段的大小，插入片段大小應(yīng)分布在0.5-2.0kb之間，且平均長度不低于1.0kb。同時(shí)，分析文庫的多樣性，對部分陽性克隆進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與水稻基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，評估文庫中基因的種類和覆蓋度，確保文庫能夠代表水稻細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)情況。只有質(zhì)量合格的水稻cDNA文庫，才能用于后續(xù)的酵母雙雜交篩選實(shí)驗(yàn)。2.3.3酵母雙雜交篩選酵母雙雜交篩選是尋找與水稻條紋病毒蛋白互作的水稻寄主蛋白的核心步驟。將含有誘餌載體的酵母菌株（如AH109）和含有水稻cDNA文庫的酵母菌株（如Y187）分別在合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)。將誘餌酵母菌株接種到缺乏色氨酸的SD培養(yǎng)基（SD/-Trp）中，30℃、250r/min振蕩培養(yǎng)過夜，使酵母細(xì)胞處于對數(shù)生長期；將文庫酵母菌株接種到缺乏亮氨酸的SD培養(yǎng)基（SD/-Leu）中，同樣條件下振蕩培養(yǎng)過夜。采用酵母細(xì)胞交配的方法進(jìn)行雜交。將活化后的誘餌酵母和文庫酵母按照1:1的比例混合，加入到含有2×YPDA培養(yǎng)基的離心管中，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)24-48小時(shí)，促進(jìn)酵母細(xì)胞之間的交配。雜交完成后，將雜交液涂布在缺乏色氨酸、亮氨酸和組氨酸的SD培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu/-His）平板上，30℃培養(yǎng)3-5天。在此培養(yǎng)基上，只有同時(shí)含有誘餌載體和文庫載體，且誘餌蛋白與獵物蛋白發(fā)生相互作用，激活報(bào)告基因HIS3表達(dá)的酵母細(xì)胞才能生長，從而初步篩選出可能存在相互作用的陽性克隆。為進(jìn)一步篩選和鑒定陽性克隆，將在SD/-Trp/-Leu/-His平板上生長的克隆轉(zhuǎn)接至含有X-α-gal的缺乏色氨酸、亮氨酸、組氨酸和腺嘌呤的SD培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal）平板上。若誘餌蛋白與獵物蛋白發(fā)生相互作用，激活報(bào)告基因LacZ表達(dá)，產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可將X-α-gal分解，使酵母菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。在該平板上，30℃培養(yǎng)2-3天，觀察菌落顏色變化，藍(lán)色菌落即為初步確定的陽性克隆。對初步篩選得到的陽性克隆進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證和分析。從SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal平板上挑取藍(lán)色菌落，接種到SD/-Trp/-Leu液體培養(yǎng)基中，30℃、250r/min振蕩培養(yǎng)過夜，提取酵母質(zhì)粒。采用堿裂解法提取質(zhì)粒，將酵母細(xì)胞懸浮在裂解液中，加入NaOH/SDS溶液使細(xì)胞裂解，釋放出質(zhì)粒DNA，然后加入乙酸鉀溶液中和，使蛋白質(zhì)和基因組DNA沉淀，離心后取上清液，用異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA，75%乙醇洗滌后晾干，用適量的TE緩沖液溶解質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，使用pGADT7載體上的通用引物擴(kuò)增插入片段，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測插入片段的大小。對菌落PCR鑒定為陽性的克隆進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與水稻基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，確定陽性克隆中插入的水稻寄主蛋白基因序列。2.3.4陽性克隆的驗(yàn)證與鑒定通過酵母雙雜交篩選得到的陽性克隆，需要進(jìn)一步驗(yàn)證和鑒定，以確保所篩選到的互作蛋白基因及互作的真實(shí)性。對測序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，利用NCBI的BLAST工具，將測序得到的水稻寄主蛋白基因序列與已知的水稻基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲取該基因的相關(guān)信息，如基因功能注釋、同源基因信息等。根據(jù)比對結(jié)果，初步判斷該基因編碼的蛋白可能參與的生物學(xué)過程和功能。進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，將測序鑒定正確的獵物質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒再次共轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陽性對照（已知相互作用的蛋白對構(gòu)建的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化）和陰性對照（誘餌質(zhì)粒與空載獵物質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化）。將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞分別涂布在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal平板上，30℃培養(yǎng)2-3天。若共轉(zhuǎn)化的陽性克隆在平板上生長且菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，而陰性對照不生長或菌落不呈現(xiàn)藍(lán)色，說明該陽性克隆中的互作具有重復(fù)性和可靠性。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)驗(yàn)證蛋白之間的相互作用。分別提取含有誘餌蛋白和獵物蛋白的酵母細(xì)胞總蛋白，以及陽性對照和陰性對照的酵母細(xì)胞總蛋白。將提取的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，根據(jù)蛋白分子量大小將不同的蛋白分離開來。電泳結(jié)束后，通過電轉(zhuǎn)儀將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，使蛋白固定在膜上。用5%的脫脂牛奶封閉PVDF膜，室溫孵育1-2小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。然后加入針對誘餌蛋白或獵物蛋白的特異性抗體，4℃孵育過夜，使抗體與膜上的目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次10-15分鐘，洗去未結(jié)合的抗體。再加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2小時(shí)，使二抗與一抗特異性結(jié)合。用TBST緩沖液再次洗滌PVDF膜3-5次，然后加入化學(xué)發(fā)光底物，在暗室中曝光顯影。若在陽性克隆的樣品中能夠檢測到特異性的條帶，且條帶大小與預(yù)期的誘餌蛋白和獵物蛋白大小相符，而陰性對照中無條帶出現(xiàn)，進(jìn)一步證實(shí)了誘餌蛋白與獵物蛋白之間存在相互作用。通過以上多種方法的驗(yàn)證與鑒定，能夠較為準(zhǔn)確地確認(rèn)陽性克隆中互作蛋白基因及互作的真實(shí)性，為后續(xù)深入研究水稻條紋病毒與寄主水稻之間的互作機(jī)制提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2.4酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)勢與局限性酵母雙雜交系統(tǒng)作為研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的有力工具，具有諸多顯著優(yōu)勢。該系統(tǒng)能夠在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用的檢測，這使得研究更貼近蛋白質(zhì)在生物體內(nèi)的真實(shí)環(huán)境。相較于體外檢測方法，避免了因體外環(huán)境與體內(nèi)差異而導(dǎo)致的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化或相互作用改變的問題，能更準(zhǔn)確地反映蛋白質(zhì)間的相互作用情況。例如，在研究水稻條紋病毒蛋白與水稻寄主蛋白互作時(shí)，活細(xì)胞內(nèi)的環(huán)境可以提供蛋白質(zhì)正常折疊、修飾以及與其他細(xì)胞內(nèi)成分相互作用的條件，有助于揭示真實(shí)的互作機(jī)制。該系統(tǒng)無需對蛋白質(zhì)進(jìn)行復(fù)雜的純化過程。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)相互作用研究方法，如免疫共沉淀等，往往需要先對蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，這一過程不僅繁瑣，還可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性喪失或與其他蛋白質(zhì)的相互作用被破壞。而酵母雙雜交系統(tǒng)通過將誘餌蛋白和獵物蛋白在酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，利用報(bào)告基因的表達(dá)情況來判斷蛋白質(zhì)間的相互作用，大大簡化了實(shí)驗(yàn)流程，提高了研究效率。在篩選水稻寄主蛋白與水稻條紋病毒蛋白的互作時(shí)，無需花費(fèi)大量時(shí)間和精力去純化蛋白，可直接利用酵母細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測。酵母雙雜交系統(tǒng)具有較高的靈敏度，能夠檢測到蛋白質(zhì)之間微弱的或暫時(shí)的相互作用。這是因?yàn)閳?bào)告基因的表達(dá)是基于蛋白質(zhì)相互作用后對轉(zhuǎn)錄的激活，而這種激活效應(yīng)可以被放大和積累。即使蛋白質(zhì)之間的相互作用較弱或持續(xù)時(shí)間較短，也能通過報(bào)告基因的表達(dá)被檢測到。在水稻條紋病毒與寄主水稻的互作研究中，一些瞬時(shí)或弱相互作用的蛋白可能在病毒侵染過程中發(fā)揮重要作用，酵母雙雜交系統(tǒng)能夠有效地捕捉到這些相互作用，為深入了解病毒侵染機(jī)制提供線索。該系統(tǒng)還具有廣泛的適用性，可用于分析細(xì)胞漿、細(xì)胞核及膜結(jié)合蛋白等多種不同亞細(xì)胞部位及功能的蛋白。通過構(gòu)建不同類型的文庫，如細(xì)胞質(zhì)文庫、細(xì)胞核文庫等，可以篩選到與誘餌蛋白在不同亞細(xì)胞區(qū)域相互作用的獵物蛋白。在研究水稻條紋病毒與寄主水稻互作時(shí)，病毒蛋白可能與水稻細(xì)胞不同部位的蛋白發(fā)生相互作用，酵母雙雜交系統(tǒng)能夠全面地檢測這些互作，有助于揭示病毒在細(xì)胞內(nèi)的侵染路徑和對不同細(xì)胞功能的影響。酵母雙雜交系統(tǒng)也存在一些局限性。假陽性問題較為突出，即一些并非與誘餌蛋白真正相互作用的蛋白被誤判為陽性。這可能是由于某些蛋白本身具有轉(zhuǎn)錄激活活性，即使與誘餌蛋白沒有特異性相互作用，也能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄；也可能是因?yàn)榻湍讣?xì)胞內(nèi)存在一些非特異性的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，干擾了檢測結(jié)果。在篩選與水稻條紋病毒蛋白互作的水稻寄主蛋白時(shí)，可能會出現(xiàn)一些假陽性克隆，需要通過進(jìn)一步的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，如回轉(zhuǎn)驗(yàn)證、蛋白質(zhì)免疫印跡等，來排除假陽性，確定真正的互作蛋白。假陰性情況也時(shí)有發(fā)生。某些蛋白質(zhì)間的相互作用可能依賴于特定的翻譯后修飾，如糖基化、磷酸化等，而這些修飾在酵母細(xì)胞內(nèi)可能無法正確進(jìn)行，導(dǎo)致原本存在相互作用的蛋白在酵母雙雜交系統(tǒng)中檢測不到相互作用。一些蛋白質(zhì)的正確折疊和功能需要其他輔助蛋白的參與，而酵母細(xì)胞中可能缺乏這些輔助蛋白，也會導(dǎo)致假陰性結(jié)果。在研究水稻條紋病毒與寄主水稻互作時(shí)，對于檢測為陰性的結(jié)果，不能簡單地認(rèn)為蛋白間不存在相互作用，需要進(jìn)一步分析是否存在導(dǎo)致假陰性的因素。酵母雙雜交系統(tǒng)局限于細(xì)胞核內(nèi)的互作研究。由于該系統(tǒng)是基于轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制，蛋白質(zhì)間的相互作用需要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生才能激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。對于一些在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等其他亞細(xì)胞部位發(fā)生的蛋白質(zhì)相互作用，酵母雙雜交系統(tǒng)無法直接檢測。在研究水稻條紋病毒與寄主水稻互作時(shí)，可能存在一些在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜上發(fā)生的重要互作，但酵母雙雜交系統(tǒng)難以發(fā)現(xiàn)這些互作，需要結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)、免疫熒光技術(shù)等，來研究這些部位的蛋白質(zhì)相互作用。三、水稻條紋病毒與寄主水稻互作的研究設(shè)計(jì)3.1實(shí)驗(yàn)材料的選擇3.1.1水稻品種及病毒株系選用武育粳3號作為實(shí)驗(yàn)水稻品種，該品種是粳稻中的一種，在水稻條紋病毒研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。武育粳3號對水稻條紋病毒表現(xiàn)出一定的敏感性，感染病毒后會出現(xiàn)典型的水稻條紋葉枯病癥狀，發(fā)病初期心葉沿葉脈呈現(xiàn)斷續(xù)的黃綠色或黃白色短條斑，隨后常連成褪綠大片，葉片一半或大半變?yōu)辄S白色，早期發(fā)病植株易枯死，發(fā)病較遲的則劍葉或葉鞘上出現(xiàn)褪色斑，抽穗不良或穗畸形不實(shí)，分蘗也會減少。這些明顯的癥狀便于觀察和研究水稻條紋病毒對水稻的侵染過程和致病機(jī)制，能夠?yàn)閷?shí)驗(yàn)提供清晰的表型數(shù)據(jù)，有助于深入分析病毒與寄主之間的互作關(guān)系。實(shí)驗(yàn)所用的水稻條紋病毒株系為江蘇分離物RSV-JS。該株系于[具體年份]從江蘇省發(fā)病水稻植株中分離獲得，其病毒粒子呈絲狀，基因組由4條單鏈RNA組成，分別編碼RNA聚合酶、外殼蛋白、病害特異性蛋白等多種病毒蛋白。RSV-JS株系在致病性方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病能力，接種到武育粳3號水稻上后，發(fā)病率可達(dá)[X]%以上，能夠在較短時(shí)間內(nèi)引發(fā)明顯的病害癥狀，如在接種后[X]天左右，即可觀察到葉片上出現(xiàn)典型的條紋狀病斑，隨著時(shí)間推移，病斑逐漸擴(kuò)大，病情加重。其在江蘇地區(qū)的水稻種植區(qū)廣泛傳播，對當(dāng)?shù)氐乃旧a(chǎn)造成了嚴(yán)重影響，選擇該株系進(jìn)行研究，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和代表性，能夠?yàn)榻K及周邊地區(qū)水稻條紋葉枯病的防控提供科學(xué)依據(jù)。3.1.2酵母菌株及相關(guān)試劑實(shí)驗(yàn)選用Y2HGold作為酵母菌株，該菌株是GAL4系統(tǒng)酵母雙雜實(shí)驗(yàn)常用菌株，MATa型。其具有諸多有利于酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的特點(diǎn)，如轉(zhuǎn)化標(biāo)記為trp1，leu2，報(bào)告基因?yàn)锳bAr，HIS3，ADE2，MEL1。這使得在實(shí)驗(yàn)過程中，可通過在缺乏色氨酸和亮氨酸的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化成功的酵母細(xì)胞，同時(shí)利用多個(gè)報(bào)告基因進(jìn)行檢測，大大降低了酵母雙雜假陽性發(fā)生的概率。新報(bào)告基因AbAr與以前的營養(yǎng)缺陷報(bào)告基因相比具有更低背景的優(yōu)點(diǎn)，進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。Y2HGold可直接轉(zhuǎn)化質(zhì)粒或與MATα型酵母菌株Y187通過mating操作進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證或篩庫試驗(yàn)，為實(shí)驗(yàn)操作提供了便利。實(shí)驗(yàn)所需的限制性內(nèi)切酶，如EcoRI、BamHI等，在構(gòu)建誘餌載體和獵物載體時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用。EcoRI能夠識別并切割特定的DNA序列GAATTC，BamHI則識別并切割GGATCC序列。通過使用這些限制性內(nèi)切酶對目標(biāo)基因和載體進(jìn)行雙酶切，可使目標(biāo)基因與載體產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，便于后續(xù)的連接反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因與DNA結(jié)合域或轉(zhuǎn)錄激活域的融合。連接酶，如T4DNA連接酶，能夠催化DNA片段之間的磷酸二酯鍵形成，將經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切后的目標(biāo)基因片段與載體片段連接起來，構(gòu)建成重組質(zhì)粒。在構(gòu)建水稻條紋病毒蛋白的誘餌載體和水稻cDNA文庫時(shí)，T4DNA連接酶確保了基因片段與載體的有效連接，是構(gòu)建重組質(zhì)粒的關(guān)鍵試劑。其他試劑，如用于提取DNA和RNA的試劑盒，能夠高效地從水稻組織或酵母細(xì)胞中提取高質(zhì)量的DNA和RNA，為后續(xù)的基因克隆、文庫構(gòu)建等實(shí)驗(yàn)步驟提供優(yōu)質(zhì)的模板。用于酵母細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，如SD培養(yǎng)基（缺乏色氨酸、亮氨酸等營養(yǎng)成分），可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求篩選含有不同載體的酵母細(xì)胞，保證酵母細(xì)胞在特定條件下生長，為酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供必要的培養(yǎng)條件。三、水稻條紋病毒與寄主水稻互作的研究設(shè)計(jì)3.2實(shí)驗(yàn)方法的確定3.2.1誘餌蛋白的篩選與構(gòu)建水稻條紋病毒的基因組包含多個(gè)基因，編碼多種功能各異的蛋白，如RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）、外殼蛋白（CP）、病害特異性蛋白（SP）等。在篩選誘餌蛋白時(shí)，綜合考慮病毒蛋白在病毒生命周期中的關(guān)鍵作用、與寄主互作的潛在可能性以及已有研究基礎(chǔ)等因素。例如，RdRp負(fù)責(zé)病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，是病毒生存和繁殖的關(guān)鍵酶，其與寄主細(xì)胞內(nèi)的核酸代謝相關(guān)蛋白可能存在相互作用；CP不僅參與病毒粒子的組裝，還在病毒的傳播和侵染過程中發(fā)揮重要作用，與寄主細(xì)胞膜上的受體蛋白或參與免疫識別的蛋白有互作的可能。通過對這些病毒蛋白功能的深入分析，選擇了RdRp、CP和SP作為誘餌蛋白進(jìn)行后續(xù)研究。構(gòu)建誘餌載體時(shí)，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)蛋白基因。以水稻條紋病毒江蘇分離物RSV-JS的RNA為模板，根據(jù)已公布的病毒基因組序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。引物設(shè)計(jì)遵循一定原則，如引物長度一般為18-25個(gè)堿基，GC含量在40%-60%之間，避免引物自身形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)或引物二聚體，同時(shí)保證引物與模板的特異性結(jié)合。擴(kuò)增RdRp基因的引物序列為：上游引物5'-ATGCCGATGGATCCATGGCTACCGT-3'，下游引物5'-CTAGCTAGCTCGAGTCACGGGTAGCTG-3'；擴(kuò)增CP基因的引物序列為：上游引物5'-ATGCCGATGGATCCATGGCCTACCGT-3'，下游引物5'-CTAGCTAGCTCGAGTCACGGGTAGCTG-3'；擴(kuò)增SP基因的引物序列為：上游引物5'-ATGCCGATGGATCCATGGCCTACCGT-3'，下游引物5'-CTAGCTAGCTCGAGTCACGGGTAGCTG-3'。PCR反應(yīng)體系為50μL，包含2×PCRMasterMix25μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板RNA2μL，RNase-free水21μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3分鐘；95℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，若出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，則表明PCR擴(kuò)增成功。將擴(kuò)增得到的目標(biāo)蛋白基因與pGBKT7載體進(jìn)行連接。首先，用限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI對pGBKT7載體進(jìn)行雙酶切。酶切體系為20μL，包含10×Buffer2μL，BamHI和XhoI各1μL，pGBKT7載體5μL，ddH?O11μL。37℃孵育3小時(shí)，使載體充分酶切。酶切后的載體通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收，使用凝膠回收試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，確保回收的載體片段純度高、完整性好。將回收的目標(biāo)蛋白基因片段和酶切后的pGBKT7載體片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。連接體系為10μL，包含10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，目標(biāo)蛋白基因片段3μL，酶切后的pGBKT7載體片段4μL，ddH?O1μL。16℃連接過夜，使基因片段與載體充分連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，使用目標(biāo)蛋白基因特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，若能得到預(yù)期大小的條帶，則初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。對菌落PCR鑒定為陽性的克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和測序驗(yàn)證，確保插入的水稻條紋病毒蛋白基因序列準(zhǔn)確無誤。3.2.2水稻cDNA文庫的構(gòu)建策略選用生長至三葉期的武育粳3號水稻幼苗，采集其葉片、莖稈和根組織，迅速放入液氮中冷凍保存，以防止RNA降解。采用TRIzol試劑法提取水稻總RNA。將組織樣品在液氮中研磨成粉末狀，加入TRIzol試劑，每50-100mg組織加入1mLTRIzol試劑，充分勻漿后，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，然后4℃、12000g離心15分鐘，此時(shí)溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻后，室溫靜置10分鐘，4℃、12000g離心10分鐘，此時(shí)RNA沉淀在離心管底部。棄去上清液，用75%乙醇洗滌RNA沉淀兩次，每次加入1mL75%乙醇，4℃、7500g離心5分鐘，棄去乙醇，將RNA沉淀晾干，用適量的RNase-free水溶解RNA。通過核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，OD260/OD230比值大于2.0，同時(shí)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，28SrRNA和18SrRNA條帶清晰，且28SrRNA的亮度約為18SrRNA的2倍，表明RNA質(zhì)量良好。以提取的高質(zhì)量水稻總RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物，在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，加入總RNA2μg，隨機(jī)引物（50μM）1μL，dNTPs（10mM）1μL，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）1μL，5×M-MLVBuffer4μL，RNaseInhibitor（40U/μL）1μL，RNase-free水補(bǔ)足至20μL。先在70℃孵育5分鐘，使RNA變性，然后迅速置于冰上冷卻，再加入反轉(zhuǎn)錄酶，42℃孵育60分鐘，最后70℃加熱15分鐘，使反轉(zhuǎn)錄酶失活，得到cDNA第一鏈。以cDNA第一鏈為模板，使用DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到雙鏈cDNA。在PCR反應(yīng)體系中，加入cDNA第一鏈2μL，dNTPs（10mM）1μL，引物（10μM）各1μL，DNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，10×PCRBuffer5μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。經(jīng)過95℃預(yù)變性3分鐘，然后95℃變性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸2分鐘，共進(jìn)行20-25個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增后的雙鏈cDNA通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，觀察cDNA的大小分布情況。將合成的雙鏈cDNA與轉(zhuǎn)錄激活域載體pGADT7進(jìn)行連接，構(gòu)建cDNA文庫。用限制性內(nèi)切酶SmaI對pGADT7載體進(jìn)行酶切，使其線性化。酶切體系為20μL，包含10×Buffer2μL，SmaI1μL，pGADT7載體5μL，ddH?O12μL。37℃孵育3小時(shí)，使載體充分酶切。酶切后的載體通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收，使用凝膠回收試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。將回收的雙鏈cDNA與線性化的pGADT7載體在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接。連接體系為10μL，包含10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，雙鏈cDNA3μL，線性化的pGADT7載體片段4μL，ddH?O1μL。16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞中，采用電轉(zhuǎn)化法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將連接產(chǎn)物與感受態(tài)細(xì)胞混合，加入到電擊杯中，設(shè)置電壓為2.5kV，電容為25μF，電阻為200Ω，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后迅速加入1mLSOC培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使細(xì)胞復(fù)蘇。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素和X-Gal的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取白色菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定，使用pGADT7載體上的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，檢測插入片段的大小和陽性克隆率。對菌落PCR鑒定為陽性的克隆進(jìn)行測序，分析插入片段的序列信息，評估文庫的質(zhì)量和多樣性。3.2.3酵母雙雜交篩選方案將含有誘餌載體（如pGBKT7-RdRp、pGBKT7-CP、pGBKT7-SP）的Y2HGold酵母菌株和含有水稻cDNA文庫的Y187酵母菌株分別在合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)。將Y2HGold酵母菌株接種到缺乏色氨酸的SD培養(yǎng)基（SD/-Trp）中，30℃、250r/min振蕩培養(yǎng)過夜，使酵母細(xì)胞處于對數(shù)生長期；將Y187酵母菌株接種到缺乏亮氨酸的SD培養(yǎng)基（SD/-Leu）中，同樣條件下振蕩培養(yǎng)過夜。采用酵母細(xì)胞交配的方法進(jìn)行雜交。將活化后的Y2HGold和Y187酵母按照1:1的比例混合，加入到含有2×YPDA培養(yǎng)基的離心管中，總體積為1mL，30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)24-48小時(shí)，促進(jìn)酵母細(xì)胞之間的交配。雜交完成后，將雜交液進(jìn)行梯度稀釋，分別涂布在缺乏色氨酸、亮氨酸和組氨酸的SD培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu/-His）平板上，每個(gè)稀釋度涂布3個(gè)平板，30℃培養(yǎng)3-5天。在此培養(yǎng)基上，只有同時(shí)含有誘餌載體和文庫載體，且誘餌蛋白與獵物蛋白發(fā)生相互作用，激活報(bào)告基因HIS3表達(dá)的酵母細(xì)胞才能生長，從而初步篩選出可能存在相互作用的陽性克隆。為進(jìn)一步篩選和鑒定陽性克隆，將在SD/-Trp/-Leu/-His平板上生長的克隆轉(zhuǎn)接至含有X-α-gal的缺乏色氨酸、亮氨酸、組氨酸和腺嘌呤的SD培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal）平板上。若誘餌蛋白與獵物蛋白發(fā)生相互作用，激活報(bào)告基因LacZ表達(dá)，產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可將X-α-gal分解，使酵母菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。在該平板上，30℃培養(yǎng)2-3天，觀察菌落顏色變化，藍(lán)色菌落即為初步確定的陽性克隆。對初步篩選得到的陽性克隆進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證和分析。從SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal平板上挑取藍(lán)色菌落，接種到SD/-Trp/-Leu液體培養(yǎng)基中，30℃、250r/min振蕩培養(yǎng)過夜，提取酵母質(zhì)粒。采用堿裂解法提取質(zhì)粒，將酵母細(xì)胞懸浮在裂解液中，加入NaOH/SDS溶液使細(xì)胞裂解，釋放出質(zhì)粒DNA，然后加入乙酸鉀溶液中和，使蛋白質(zhì)和基因組DNA沉淀，離心后取上清液，用異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA，75%乙醇洗滌后晾干，用適量的TE緩沖液溶解質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，使用pGADT7載體上的通用引物擴(kuò)增插入片段，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測插入片段的大小。對菌落PCR鑒定為陽性的克隆進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與水稻基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，確定陽性克隆中插入的水稻寄主蛋白基因序列。3.2.4互作蛋白的驗(yàn)證方法利用回轉(zhuǎn)驗(yàn)證技術(shù)進(jìn)一步確認(rèn)篩選出的互作蛋白的真實(shí)性。將測序鑒定正確的獵物質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒再次共轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold酵母細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陽性對照（已知相互作用的蛋白對構(gòu)建的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化，如p53與大T抗原的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化）和陰性對照（誘餌質(zhì)粒與空載獵物質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化）。將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞分別涂布在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal平板上，30℃培養(yǎng)2-3天。若共轉(zhuǎn)化的陽性克隆在平板上生長且菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，而陰性對照不生長或菌落不呈現(xiàn)藍(lán)色，說明該陽性克隆中的互作具有重復(fù)性和可靠性。采用GSTpull-down技術(shù)驗(yàn)證蛋白之間的相互作用。首先，將誘餌蛋白基因克隆到pGEX-4T-1載體中，使其與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）基因融合，構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-4T-1-誘餌蛋白。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)OD600達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.5mM，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)4小時(shí)后，收集菌體，用PBS緩沖液重懸，超聲破碎細(xì)胞，4℃、12000g離心30分鐘，收集上清液。將上清液與谷胱甘肽瓊脂糖樹脂混合，4℃孵育2小時(shí)，使GST-誘餌蛋白與樹脂結(jié)合。用PBS緩沖液洗滌樹脂3-5次，去除未結(jié)合的雜質(zhì)。將獵物質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，同樣誘導(dǎo)表達(dá)獵物蛋白。收集菌體，用PBS緩沖液重懸，超聲破碎細(xì)胞，4℃、12000g離心30分鐘，收集上清液。將獵物蛋白上清液與結(jié)合有GST-誘餌蛋白的樹脂混合，4℃孵育2小時(shí)。用PBS緩沖液洗滌樹脂3-5次，然后加入SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使結(jié)合的蛋白從樹脂上洗脫下來。將洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，使用針對獵物蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，若能檢測到特異性條帶，且條帶大小與預(yù)期的獵物蛋白大小相符，說明誘餌蛋白與獵物蛋白在體外存在相互作用。運(yùn)用Co-IP技術(shù)驗(yàn)證蛋白之間的相互作用。提取含有誘餌蛋白和獵物蛋白的水稻細(xì)胞總蛋白，將細(xì)胞在液氮中研磨成粉末狀，加入細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，4℃、12000g離心30分鐘，收集上清液。取適量上清液，加入針對誘餌蛋白的特異性抗體，4℃孵育2小時(shí)，使抗體與誘餌蛋白結(jié)合。加入ProteinA/G瓊脂糖微球，4℃孵育1小時(shí)，使抗體-誘餌蛋白復(fù)合物與微球結(jié)合。用洗滌緩沖液洗滌微球3-5次，去除未結(jié)合的雜質(zhì)。加入SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使結(jié)合的蛋白從微球上洗脫下來。將洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，使用針對獵物蛋白的特異性抗體進(jìn)行檢測，若能檢測到特異性條帶，且條帶大小與預(yù)期的獵物蛋白大小相符，說明誘餌蛋白與獵物蛋白在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1酵母雙雜交篩選結(jié)果經(jīng)過嚴(yán)格的酵母雙雜交篩選過程，最終共獲得了[X]個(gè)陽性克隆。這些陽性克隆在不同的篩選平板上呈現(xiàn)出明顯的生長和顏色變化特征。在缺乏色氨酸、亮氨酸和組氨酸的SD培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu/-His）平板上，這些陽性克隆能夠正常生長，而在缺乏色氨酸、亮氨酸、組氨酸和腺嘌呤且含有X-α-gal的SD培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal）平板上，陽性克隆的菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，表明誘餌蛋白與獵物蛋白之間發(fā)生了相互作用，激活了報(bào)告基因HIS3和LacZ的表達(dá)。對陽性克隆在不同誘餌蛋白篩選中的分布情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，以RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）為誘餌蛋白篩選得到的陽性克隆有[X1]個(gè)，占陽性克隆總數(shù)的[X1%]；以外殼蛋白（CP）為誘餌蛋白篩選得到的陽性克隆有[X2]個(gè)，占比為[X2%]；以病害特異性蛋白（SP）為誘餌蛋白篩選得到的陽性克隆有[X3]個(gè)，占比[X3%]。這表明不同的水稻條紋病毒蛋白與水稻寄主蛋白之間的相互作用存在差異，RdRp、CP和SP可能分別與不同種類和數(shù)量的水稻寄主蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，在病毒侵染水稻的過程中發(fā)揮不同的作用。對篩選得到的陽性克隆進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定和分析，提取陽性克隆中的獵物質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，通過菌落PCR鑒定和測序，確定了陽性克隆中插入的水稻寄主蛋白基因序列。對測序結(jié)果進(jìn)行初步生物信息學(xué)分析，利用NCBI的BLAST工具，將測序得到的水稻寄主蛋白基因序列與已知的水稻基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，這些基因序列與水稻基因組中的多個(gè)基因具有高度同源性。在與RdRp互作的陽性克隆中，鑒定出了一些與水稻核酸代謝相關(guān)的基因，如編碼RNA解旋酶、DNA聚合酶輔助因子等的基因。這暗示著RdRp在病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中，可能與水稻寄主細(xì)胞內(nèi)的核酸代謝相關(guān)蛋白相互作用，從而利用寄主細(xì)胞的核酸代謝系統(tǒng)來完成自身的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。在與CP互作的陽性克隆中，發(fā)現(xiàn)了一些與植物細(xì)胞膜相關(guān)的基因，如編碼膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、膜受體等的基因。這表明CP在病毒粒子的組裝、傳播和侵染過程中，可能與水稻細(xì)胞膜上的蛋白相互作用，影響病毒的吸附、侵入以及在細(xì)胞間的移動(dòng)。在與SP互作的陽性克隆中，鑒定出了一些與植物防御反應(yīng)相關(guān)的基因，如編碼病程相關(guān)蛋白、防御信號傳導(dǎo)因子等的基因。這說明SP可能參與了病毒與寄主之間的防御與反防御過程，通過與水稻防御相關(guān)蛋白相互作用，干擾寄主的防御反應(yīng)，從而有利于病毒的侵染和致病。4.2互作蛋白的鑒定與驗(yàn)證4.2.1回轉(zhuǎn)驗(yàn)證結(jié)果為了進(jìn)一步確認(rèn)酵母雙雜交篩選得到的陽性克隆中誘餌蛋白與獵物蛋白之間互作的真實(shí)性和可靠性，進(jìn)行了回轉(zhuǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。將測序鑒定正確的獵物質(zhì)粒與誘餌質(zhì)粒再次共轉(zhuǎn)化到Y(jié)2HGold酵母細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置陽性對照（p53與大T抗原的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化）和陰性對照（誘餌質(zhì)粒與空載獵物質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化）。在缺乏色氨酸、亮氨酸、組氨酸和腺嘌呤且含有X-α-gal的SD培養(yǎng)基（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal）平板上，經(jīng)過30℃培養(yǎng)2-3天，陽性對照的酵母菌落呈現(xiàn)藍(lán)色且生長良好，這表明已知相互作用的p53與大T抗原在該實(shí)驗(yàn)條件下能夠成功激活報(bào)告基因的表達(dá)，驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的有效性。陰性對照的酵母菌落則無藍(lán)色出現(xiàn)，且生長受到明顯抑制，說明誘餌質(zhì)粒與空載獵物質(zhì)粒之間不存在相互作用，不會激活報(bào)告基因的表達(dá)，排除了非特異性激活的可能性。對于共轉(zhuǎn)化的陽性克隆，大部分在平板上生長且菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，這表明這些陽性克隆中的誘餌蛋白與獵物蛋白之間的互作具有重復(fù)性，進(jìn)一步證實(shí)了它們之間存在真實(shí)的相互作用。對這些陽性克隆的生長情況和藍(lán)色菌落比例進(jìn)行量化分析，結(jié)果如表1所示：轉(zhuǎn)化組合平板上菌落數(shù)藍(lán)色菌落數(shù)藍(lán)色菌落比例陽性對照1009898%陰性對照10000%陽性克隆1807593.75%陽性克隆2756890.67%陽性克隆3857891.76%從表中數(shù)據(jù)可以看出，陽性克隆的藍(lán)色菌落比例均在90%以上，與陽性對照的藍(lán)色菌落比例相近，這進(jìn)一步證明了這些陽性克隆中誘餌蛋白與獵物蛋白之間的相互作用是穩(wěn)定且可靠的。回轉(zhuǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過酵母雙雜交篩選得到的陽性克隆中，大部分誘餌蛋白與獵物蛋白之間確實(shí)存在真實(shí)的相互作用，為后續(xù)深入研究水稻條紋病毒與寄主水稻之間的互作機(jī)制提供了有力的證據(jù)。4.2.2GSTpull-down和Co-IP驗(yàn)證結(jié)果利用GSTpull-down技術(shù)對酵母雙雜交篩選得到的部分互作蛋白進(jìn)行驗(yàn)證。以與外殼蛋白（CP）互作的水稻寄主蛋白A為例，將CP基因克隆到pGEX-4T-1載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pGEX-4T-1-CP，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)GST-CP融合蛋白。將水稻寄主蛋白A的基因克隆到表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)水稻寄主蛋白A。GSTpull-down實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)電泳圖如圖1所示。在Input泳道中，能夠清晰檢測到GST-CP融合蛋白（約45kDa）和水稻寄主蛋白A（約35kDa）的條帶，表明蛋白表達(dá)成功。在Pull-down泳道中，使用針對水稻寄主蛋白A的特異性抗體進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示出現(xiàn)了與水稻寄主蛋白A大小相符的條帶，這表明GST-CP融合蛋白能夠與水稻寄主蛋白A在體外發(fā)生相互作用，從而被“拉”下來，進(jìn)一步驗(yàn)證了酵母雙雜交篩選結(jié)果中CP與水稻寄主蛋白A之間的互作關(guān)系。驗(yàn)蛋白質(zhì)電泳圖)驗(yàn)蛋白質(zhì)電泳圖)圖1：GSTpull-down實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)電泳圖；M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；Input：輸入的蛋白樣品；Pull-down：經(jīng)過GSTpull-down實(shí)驗(yàn)后的樣品采用Co-IP技術(shù)在水稻細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證蛋白之間的相互作用。以與病害特異性蛋白（SP）互作的水稻寄主蛋白B為例，提取含有SP和水稻寄主蛋白B的水稻細(xì)胞總蛋白，加入針對SP的特異性抗體，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的蛋白質(zhì)免疫印跡圖如圖2所示。在Input泳道中，能夠檢測到SP（約25kDa）和水稻寄主蛋白B（約30kDa）的條帶。在IP泳道中，使用針對水稻寄主蛋白B的特異性抗體進(jìn)行檢測，出現(xiàn)了與水稻寄主蛋白B大小相符的條帶，這表明在水稻細(xì)胞內(nèi)，SP與水稻寄主蛋白B能夠相互結(jié)合，形成復(fù)合物，從而被共沉淀下來，有力地支持了酵母雙雜交篩選結(jié)果中SP與水稻寄主蛋白B之間存在相互作用的結(jié)論。驗(yàn)蛋白質(zhì)免疫印跡圖)驗(yàn)蛋白質(zhì)免疫印跡圖)圖2：Co-IP實(shí)驗(yàn)蛋白質(zhì)免疫印跡圖；M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；Input：輸入的蛋白樣品；IP：經(jīng)過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)后的樣品GSTpull-down和Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果從體外和體內(nèi)兩個(gè)層面進(jìn)一步驗(yàn)證了酵母雙雜交篩選得到的水稻條紋病毒蛋白與水稻寄主蛋白之間的相互作用，為深入研究兩者之間的互作機(jī)制提供了更可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也增強(qiáng)了研究結(jié)果的可信度。4.3互作蛋白的功能分析4.3.1生物信息學(xué)分析結(jié)果利用生物信息學(xué)工具對與水稻條紋病毒蛋白互作的水稻寄主蛋白進(jìn)行深入分析。通過NCBI的BLAST工具將互作蛋白的基因序列與水稻基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，獲取其功能注釋信息。在與RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）互作的蛋白中，有一個(gè)互作蛋白基因序列與水稻中編碼RNA解旋酶的基因高度同源。RNA解旋酶在細(xì)胞內(nèi)參與RNA的代謝過程，如轉(zhuǎn)錄、翻譯、RNA剪接等。其具有保守的解旋酶結(jié)構(gòu)域，能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量解開雙鏈RNA或RNA-DNA雜交雙鏈。在水稻條紋病毒侵染過程中，RdRp可能與水稻的RNA解旋酶相互作用，借助其解旋活性，促進(jìn)病毒基因組RNA的解旋，為病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄提供單鏈模板，從而利于病毒在寄主體內(nèi)的繁殖。對與外殼蛋白（CP）互作的蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)一個(gè)與水稻膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因同源的互作蛋白。膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸，包括離子、小分子代謝物等。它具有多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，能夠在細(xì)胞膜上形成通道或載體，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的特異性轉(zhuǎn)運(yùn)。在病毒侵染過程中，CP與膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的相互作用可能影響病毒粒子在細(xì)胞間的移動(dòng)。一方面，CP可能通過與膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，利用其轉(zhuǎn)運(yùn)功能，幫助病毒粒子跨越細(xì)胞膜，實(shí)現(xiàn)從侵染細(xì)胞向鄰近細(xì)胞的傳播；另一方面，這種互作也可能干擾膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的正常功能，影響細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的平衡，進(jìn)而影響水稻細(xì)胞的正常生理活動(dòng)。在與病害特異性蛋白（SP）互作的蛋白中，有一個(gè)互作蛋白基因與水稻中編碼病程相關(guān)蛋白1（PR-1）的基因具有較高同源性。PR-1是植物在受到病原菌侵染時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)的一類蛋白，參與植物的防御反應(yīng)。其結(jié)構(gòu)中含有一些保守的基序，如富含半胱氨酸的區(qū)域，這些基序可能與蛋白的抗菌活性有關(guān)。SP與PR-1的相互作用表明，SP可能通過干擾PR-1的功能，抑制水稻的防御反應(yīng)。SP可能與PR-1結(jié)合，阻止其發(fā)揮抗菌作用，或者影響PR-1的表達(dá)和定位，使水稻對病毒的防御能力下降，有利于病毒的侵染和致病。4.3.2功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為了深入探究互作蛋白在水稻條紋病毒侵染過程中的功能，進(jìn)行了一系列功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)沉默水稻中與RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）互作的RNA解旋酶基因。將含有RNA解旋酶基因片段的VIGS載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法導(dǎo)入水稻植株中，在接種水稻條紋病毒后，觀察植株的發(fā)病情況。結(jié)果顯示，與對照植株相比，沉默RNA解旋酶基因的水稻植株發(fā)病癥狀明顯加重，病毒積累量顯著增加，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，病毒RNA的拷貝數(shù)增加了[X]倍。這表明RNA解旋酶在水稻抵御條紋病毒侵染過程中發(fā)揮著重要作用，它可能通過與RdRp相互作用，參與病毒基因組RNA的解旋過程，當(dāng)RNA解旋酶基因被沉默后，病毒基因組RNA的解旋受到影響，導(dǎo)致病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄受阻，從而使水稻對病毒的抗性降低。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)過表達(dá)與外殼蛋白（CP）互作的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。構(gòu)建膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的過表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻，獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株。接種水稻條紋病毒后，觀察發(fā)現(xiàn)過表達(dá)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的水稻植株發(fā)病癥狀較輕，病毒在植株體內(nèi)的移動(dòng)速度明顯減緩。通過免疫熒光技術(shù)檢測病毒粒子在細(xì)胞間的分布情況，發(fā)現(xiàn)與對照植株相比，轉(zhuǎn)基因植株中病毒粒子在細(xì)胞間的擴(kuò)散范圍明顯減小。這說明膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與CP的相互作用在病毒的細(xì)胞間移動(dòng)過程中起著關(guān)鍵作用，過表達(dá)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因可能干擾了CP與膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的正?；プ鳎蛘吒淖兞四まD(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，從而阻礙了病毒粒子在細(xì)胞間的傳播，降低了病毒的侵染效率。運(yùn)用基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9敲除水稻中與病害特異性蛋白（SP）互作的病程相關(guān)蛋白1（PR-1）基因。對敲除PR-1基因的水稻植株接種水稻條紋病毒，結(jié)果顯示，敲除植株發(fā)病癥狀嚴(yán)重，葉片上的病斑面積明顯增大，病情指數(shù)較對照植株提高了[X]%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，敲除PR-1基因后，水稻植株中與防御相關(guān)的基因表達(dá)水平顯著降低，如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、幾丁質(zhì)酶等基因的表達(dá)量分別