獨(dú)一味主要藥用成分含量隨海拔的變化摘要目的：對不同海拔梯度獨(dú)一味不同部位的主要藥用成分化合物進(jìn)行含量檢測，優(yōu)選出適合獨(dú)一味生長的海拔高度，為獨(dú)一味的人工種植提供數(shù)據(jù)理論支撐。方法：使用回流提取法、HPLC法，對不同海拔梯度的獨(dú)一味地上部位主要藥用成分進(jìn)行含量分析。結(jié)果：對3個海拔梯度獨(dú)一味的地上樣品圖譜進(jìn)行評價，確定了3467m海拔該藥材的主要藥用成分含量更高。為該藥材的人工種植與開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。結(jié)論：本研究更準(zhǔn)確、科學(xué)的評價了不同海拔因素對獨(dú)一味生長以及其主要藥用成分的影響，優(yōu)選出最適合獨(dú)一味生長的海拔高度，為該藥材的人工栽培種植提供科學(xué)依據(jù)。關(guān)鍵詞：獨(dú)一味、HPLC、環(huán)烯醚萜苷、山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯ThecontentofthemainmedicinalingredientsvarieswiththealtitudeAbstractObjective:Thecontentdetectionofthemainpharmaceuticalcomponentcompoundsofdifferentpartsofdifferentaltitudegradientsisselectedtoprovidedatatheoreticalsupportforthecultivationofuniquetaste.Method:UsingrefluxextractionmethodandHPLCmethod,thecontentanalysisofthemainmedicinalcomponentsofthesingle-tasteabove-groundareaofdifferentaltitudegradientswascarriedout.Result:Theabove-groundsamplemapof3altitudegradientswasevaluatedandthecontentofthemainmedicinalingredientsofthemedicinalmaterialwashigherat3467maltitude.Itprovidesscientificbasisfortheartificialcultivationanddevelopmentofthemedicinalmaterial.Conclusion：Thisstudymoreaccuratelyandscientificallyevaluatestheeffectsofdifferentaltitudefactorsonthegrowthofuniquetasteanditsmainmedicinalingredients,andpreferablyselectsthealtitudemostsuitableforthesingle-tastegrowth,whichprovidesascientificbasisforthecultivationofthemedicinalmaterial.Keywords:Lamiophlomisrotate(Benth.)Kudo;HPLC;iridoidglycosides;sesamoside;shanzhisidemethylester;8-O-acetylshanzhisidemethylester獨(dú)一味Lamiophlomisrotata(Benth．)Kudo為是唇形科獨(dú)一味屬唯一物種。為藏、蒙、納西族常用藥材，藥材表面枯黃或褐黃，質(zhì)地堅硬、干枯、氣腥臭，性甘，歸肝經(jīng)，功能為活血止血、祛風(fēng)止痛，始見于藏醫(yī)藥經(jīng)典文獻(xiàn)《四部醫(yī)典》等，近年來也有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)獨(dú)一味還是具有一定研究價值的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的一種天然藥物REF_Ref39916432\r\h[1]，其制劑種類多樣，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。但獨(dú)一味藥材基本來源于野生資源，由于其近年來需求激增，野外資源日益緊缺，被列為一級瀕危藏藥。為保護(hù)野生獨(dú)一味資源，自2010版中國藥典將其入藥部位由全草修訂為地上部分。現(xiàn)代藥理研究表明，獨(dú)一味的有效活性成分主要有3類成分：環(huán)烯醚萜苷類，具有良好的鎮(zhèn)痛、止血、促凝血作用；苯乙醇苷和黃酮類均具有較好的鎮(zhèn)痛作用REF_Ref39331869\r[2]REF_Ref40374730\r\h[3]。本文選取2015版中國藥典規(guī)定的環(huán)烯醚萜苷類活性成分中的山梔苷甲酯和8-O-乙酰山梔苷甲酯為研究對象。不同海拔梯度自然環(huán)境迥異，植被類型差異巨大，氣壓溫度因海拔梯度而有所影響，年均溫度、年均降雨量也有所不同，而野生獨(dú)一味藥材資源主要集中分布在甘肅，西藏等青藏高原帶，尤以甘南州瑪曲縣、青海東南部最多，獨(dú)一味的生長海拔范圍為3900m-5100m，甘南州集中分布在3600m-3870mREF_Ref40386779\r\h[4]。本文所采樣品均屬于甘南地區(qū)，甘南地區(qū)屬于青藏高原、黃土高原、隴山過渡帶，氣候特點(diǎn)為高海拔、高寒、缺氧、大氣稀薄、日照時間長、晝夜溫差大、年均降雨量400-800mm，平均氣溫1-13℃，草地面積占甘南州總面積的70.28%，藏藥種類多，資源豐富REF_Ref40374747\r\h[5]。是黃河、長江上游的生態(tài)屏障，具有重要的水源涵養(yǎng)能力REF_Ref40376399\r\h[6]。本文以野生獨(dú)一味為研究對象，通過野外取樣和鮮藥收購商處購買,采用HPLC法分析2015版藥典規(guī)定檢測的主要有效成分環(huán)烯醚萜苷類兩種具體成分山梔苷甲酯和8-O-乙酰山梔苷甲酯的含量。探討3個海拔高度因素對獨(dú)一味不同部位藥效成分含量的影響，此次實驗旨在為今后野生獨(dú)一味的人工引種栽培提供數(shù)據(jù)理論依據(jù)。材料表SEQ表格\*ARABIC1實驗儀器名稱廠家型號高效液相色譜儀Aglent有限公司1100Ⅱ型紫外-可見分光光度計北京萊伯泰科儀器有限公司UV8100A型萬分之一電子天平瑞士梅特勒-托利多公司AL204型超聲波清洗機(jī)寧波新芝生物科技股份有限公司SB25-12DTD型恒溫水浴鍋西安超杰儀器有限公司HH-6型真空干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司DZF-6090型低速大容量離心機(jī)湘儀離心機(jī)儀器有限公司DD-5M型表SEQ表格\*ARABIC2實驗標(biāo)準(zhǔn)品名稱廠家批號山梔苷甲酯成都曼思特生物科技有限公司型8-O-乙酰山梔苷甲酯成都曼思特生物科技有限公司型表SEQ表格\*ARABIC3樣品采集表編號Number地點(diǎn)Locale來源Source海拔（m）Elevation群落組成Communitycomposition123阿萬倉Awancang阿萬倉Awancang曼日瑪Manrima野外采摘Collectedinthefield野外采摘Collectedinthefield購買Buy374934673513金露梅Potentillafruticose、珠芽蓼Polygonumviviparum、毛莨Ranunculusjaponicus、甘松Nardostachysjatamansi秦艽Gentianamacrophylla、黃纓菊XanthopappussubacaulisC、鵝絨委陵菜Potentillaanserina、禾本科植物Gramineae獨(dú)一味藥材來自甘南州瑪曲縣阿萬倉以及曼日瑪鄉(xiāng)，共三個不同海拔梯度（其海拔高度為手持GPS導(dǎo)航儀測定），各相差一百米左右。由蘭州大學(xué)杜國禎教授鑒定為唇形科獨(dú)一味屬獨(dú)一味L.rotata。方法與結(jié)果統(tǒng)計方法采用SPSS20.0軟件（SPSSInc.,Chicago,IL）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用一般線性模型（GLM）的one-wayANOVA分析海拔梯度對獨(dú)一味的藥用成分的影響。不同因素間的平均值差異利用Tukey’s檢測法。色譜條件表格SEQ表格\*ARABIC4色譜條件項目名稱規(guī)格色譜柱檢測器TSK-GEL

ODS100V4.6mmx250mm，5μmVWD流動相梯度洗脫流速柱溫進(jìn)樣量山梔苷甲酯檢測波長8-O-乙酰山梔苷甲酯檢測波長乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)0～15min，12%;15～20min，12%A～20．5%A;20～30min，20.5%A1.0mL·min-125℃10μL235nm235nm按照上述條件，將樣品的乙腈提取物與對照混合液進(jìn)行測定，各成分分離度良好，見圖1。圖表圖表SEQ圖表\*ARABIC11:山梔苷甲酯2:8-0-乙酰山梔苷甲酯A混合對照品B樣品地上部對照品溶液的制備圖表圖表SEQ圖表\*ARABIC2對照品溶液制備對照品山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯分別精密稱取2.3mg、2.4mg置于10ml容量瓶中，加入70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。山梔苷甲酯230mg/ml、8-O-乙酰山梔苷甲酯240mg/ml的混合對照品溶液A精密吸取1ml置于10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度標(biāo)準(zhǔn)混合溶液B圖表SEQ圖表\*ARABIC3圖表SEQ圖表\*ARABIC3供試品溶液的制備獨(dú)一味干燥藥材粉碎過60目篩精密稱取0.6000g置于100ml磨口三角瓶中，加70%甲醇25ml，稱定裝置重量水浴鍋回流提取1h，冷卻后補(bǔ)重，搖勻靜置0.45μm微孔濾膜過濾，取其續(xù)濾液樣品溶液對照品線性關(guān)系考察精密吸取標(biāo)準(zhǔn)混合溶液0.1μL、0.5μL、1.0μL、5.0μL、10μL、20μL。按照色譜條件分別進(jìn)樣，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（μL），對應(yīng)色譜峰為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，計算得到兩種化合物的回歸方程和線性范圍(REF_Ref41035580\h表格5各成分的回歸方程)表格SEQ表格\*ARABIC5各成分的回歸方程成分回歸方程R2線性范圍（μL/ml）山梔苷甲酯Y=10.579x+5.08690.99982.4—1208-O-乙酰山梔苷甲酯Y=13.179x-0.295911.15—57.5精密度試驗精密吸取樣品（隨機(jī)任選一份）溶液1.0μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，計算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。得到山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯峰面積的RSD為0.48%、1.74%。結(jié)果表明儀器精密度良好。表格SEQ表格\*ARABIC6精密度試驗編號樣品名稱山梔昔甲酯（mg/g）8-0-乙酰山梔昔甲酯（mg/g）14L-10.5010.06624L-20.5020.06734L-30.5040.06844L-40.5080.06954L-50.5030.06764L-60.5030.067穩(wěn)定性試驗精密吸取樣品（之前所選樣品）溶液于0h、2h、4h、8h、16h、24h進(jìn)樣分析，每次10μL，記錄峰面積，結(jié)果山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯峰面積的RSD分別為0.87%、2.43%，表明供試品溶液中活性成分在24h內(nèi)穩(wěn)定。表格SEQ表格\*ARABIC7穩(wěn)定性試驗編號樣品名稱山梔昔甲酯（mg/g）8-0-乙酰山梔苷甲酯（mg/g）14L-OH0.4990.06824L-2H0.5080.06434L-4H0.5040.06444L-8H0.5020.06454L-16H0.5020.06764L-24H0.5110.067重復(fù)性試驗取同一樣品3份，按照2.2制備樣品溶液，按照2.1色譜條件測定峰面積，得山梔苷甲酯、8-O-乙酰山梔苷甲酯峰面積的RSD分別為0.76%、0.71%，表明方法重復(fù)性良好。表格SEQ表格\*ARABIC8重復(fù)性試驗編號樣品名稱山梔昔甲酯（mg/g）8-0-乙酰山梔昔甲酯（mg/g）16L-111.5353.85226L-211.4593.83136L-311.6333.885加標(biāo)回收率實驗取已知化合物含量的三份不同樣品，精密稱定0.60g，分別精密加入已知濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液5mL，按照2.2制備樣品溶液，精密吸取10μL注入色譜儀測定。得山梔昔甲酯、8-0-乙酰山梔苷甲酯回收率RSD分別為1.20%、1.27%。表格SEQ表格\*ARABIC9山梔昔甲酯、8-0-乙酰山梔苷甲酯加標(biāo)回收率編號樣品名稱山梔昔甲酯回收率%8-0-乙酰山梔苷甲酯回收率%12L+99.024%99.729%24L+101.032%101.242%36L+101.166%102.275%供試品含量表格SEQ表格\*ARABIC10不同海拔獨(dú)一味地上部分主要藥用成分含量2.160海拔（m）山梔苷甲酯8-O-乙酰山梔苷甲酯346710.398、10.380、10.4032.160、2.166、2.08035132.979、2.990、2.9801.322、1.300、1.31637490.497、0.498、0.5020.072、0.066、0.075討論本實驗利用HPLC通過對不同海拔地區(qū)的獨(dú)一味不同部位有效成分含量測定，通過對數(shù)據(jù)及其色譜圖的研究分析，得出獨(dú)一味在3467m海拔梯度的有效成分與其他海拔地區(qū)獨(dú)一味有效含量有顯著性差異，3467m海拔梯度獨(dú)一味主要藥用成分顯著高于其他兩個海拔梯度。另外發(fā)現(xiàn)隨著海拔梯度的上升，獨(dú)一味中主要藥用成分的含量成梯度顯著降低，意味著在獨(dú)一味的海拔生長范圍內(nèi)，海拔越低其主要藥用成分含量急劇上升，海拔降低約三百米，獨(dú)一味主要藥用成分含量上升一個數(shù)量級。其中山梔苷甲酯含量上升約20倍，8-O-乙酰山梔苷甲酯含量上升約30倍。以上試驗數(shù)據(jù)表明不同海拔梯度獨(dú)一味藥用成分含量有顯著性區(qū)別，從所采樣品來看，3467m獨(dú)一味植株整體明顯大于3513m、3749m。隨著海拔梯度上升，獨(dú)一味根部變短變細(xì)，葉片面積變小，由大菱狀圓形變?yōu)樾∩刃?，其輪傘花序?shù)量急劇減少。可能是因為隨著海拔升高、紫外線強(qiáng)度上升、氧氣含量下降、水分減少、平均氣溫下降，植物為了更好的適應(yīng)困難環(huán)境而在形態(tài)上發(fā)生變化。金蘭等研究表明在獨(dú)一味生長海拔范圍外人工移栽不能傳粉以及結(jié)實。而本研究數(shù)據(jù)表明雖然獨(dú)一味在在3400米到3800米均有分布，但是生長范圍內(nèi)，低海拔獨(dú)一味藥用成分含量更高，這為獨(dú)一味的人工栽培研究有一定的指導(dǎo)意義。

致謝文行至此處便將要結(jié)束，也意味著自己在甘肅中醫(yī)藥大學(xué)四年的學(xué)習(xí)生活即將落幕，始于2016年初秋，終于2020盛夏。時間仿若白駒過隙，只是忽然而已?；厥姿哪辏钊税俑薪患?，在甘中校園里，曾有過困惑，有過歡樂，有過迷茫與彷徨。但也有過堅定，有過認(rèn)可與關(guān)懷。四年里留下的是青春與些許收獲，縱然有萬般不舍，但內(nèi)心仍心懷感激。在本論文完成之際，首先我要感謝我的指導(dǎo)老師謝田朋老師，其次還有在實驗與論文方面幫助過我的老師與師兄師姐。在此次論文的編寫過程中，縱然時間緊迫，但謝老師對課題組的我們?nèi)匀唤o予了無微不至的指導(dǎo)，可謂是亦師亦友。經(jīng)師易遇，人師難遭。其次我想感謝大學(xué)期間我所遇到的所有老師以及所有同學(xué)，因為你們，讓我變得完整，讓我的大學(xué)生活不在留有遺憾。因為你們讓我明白每份經(jīng)歷都是我的寶貴財富。2020年是屬于英雄的一年，周遭的老師與前輩以血肉之軀向我輩樹立典范，在疫情面前無人退縮，一封封請愿書向我們昭示著他們?yōu)閲?、為人民甘愿赴湯蹈火，縱然犧牲一切也在所不惜的勇氣與決心。他們是我學(xué)習(xí)的榜樣。希望自己日后踏入社會之后可以像各位前輩一般能夠用自己的所學(xué)去為社會做力所能及的貢獻(xiàn)。凌冬已過，皓月長明，愿山河無恙，國泰民安。愿莘莘學(xué)子前程似錦，未來可期。參考文獻(xiàn)獨(dú)一味有效成分的提取及其抗腫瘤作用比較[J].吳婧,杜鵑,李勇.中國藥物與臨床.2019,19(16):2730-2731梅之南,尹雪霏,丁昕,熊慧,鄭亞男.獨(dú)一味化學(xué)成分的研究(Ⅰ)[J].中南民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2014,33(04):57-60.潘正,高運(yùn)玲,張濤,鄧杰.HPLC法測定獨(dú)一味根中環(huán)烯醚萜苷和苯乙醇苷[J].中草藥,2011,42(02):279-281.李燕,王昕.甘南藏區(qū)植物獨(dú)一味生長適宜性分析研究[J].農(nóng)業(yè)科技與信息,2017(07):35-36.李彪,盧新生,鞏紅冬,馬國輝.青藏高原甘南地區(qū)唇形科藏藥植物資源調(diào)查研究[J].牡丹江師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2016(04):43-46.楊淑霞,張強(qiáng),楊青,陸蔭,程慧波,王婷.2018年甘南藏族自治州草原生態(tài)系統(tǒng)狀況調(diào)查[J].環(huán)境研究與監(jiān)測,2019,32(03):1-6.李曉青.黃河源區(qū)瑪曲極端氣候變化及其生態(tài)環(huán)境影響研究[J].環(huán)境保護(hù),2017,45(05):45-50.金蘭,韓鴻萍,丁莉,杜雷,李錦萍,羅桂花.青海獨(dú)一味在低海拔移栽地傳粉及結(jié)實率的研究[J].種子,2012,31(09):41-43+47.張濤,張汝學(xué),賈正平.藏藥獨(dú)一味的制劑研究進(jìn)展[J].甘肅醫(yī)藥,2014,33(12):908-911]拉巴次仁,張丹,葉凡,鄺婷婷,賴先榮.中國民族