基于高通量測(cè)序剖析肝癌細(xì)胞中Dicer對(duì)非編碼RNA的調(diào)控機(jī)制與臨床意義一、引言1.1研究背景與意義肝癌，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率長(zhǎng)期居高不下。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球肝癌新發(fā)病例約90.6萬(wàn)例，死亡病例約83萬(wàn)例，在各類癌癥中，肝癌的發(fā)病率位居第六位，死亡率則高居第三位。在我國(guó)，由于乙肝病毒感染率較高、飲食和生活習(xí)慣等因素的影響，肝癌的發(fā)病形勢(shì)更為嚴(yán)峻，每年新增病例和死亡病例均占全球總數(shù)的一半左右，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)機(jī)。而且肝癌具有惡性程度高、易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，對(duì)現(xiàn)有治療手段的耐受性也較差，導(dǎo)致其總體預(yù)后不良，5年生存率僅為15%左右。因此，深入探究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的早期診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域亟待解決的重要問(wèn)題。非編碼RNA（non-codingRNA，ncRNA）是指不編碼蛋白質(zhì)的一類RNA分子，近年來(lái)，隨著研究的不斷深入，非編碼RNA在肝癌中的重要作用逐漸被揭示。非編碼RNA主要包括微小RNA（microRNA，miRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（longnon-codingRNA，lncRNA）和環(huán)狀RNA（circularRNA，circRNA）等。其中，miRNA長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促使其降解，從而調(diào)控基因表達(dá)。在肝癌中，miR-21表達(dá)上調(diào)，可通過(guò)抑制其靶基因PTEN的表達(dá)，激活PI3K-Akt信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。lncRNA長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸，可在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平等多個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá)。如lncRNAH19在肝癌組織中高表達(dá)，可通過(guò)吸附miR-141，解除miR-141對(duì)其靶基因ZEB1的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。circRNA則具有共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性高，可通過(guò)充當(dāng)miRNA海綿、與蛋白質(zhì)相互作用等方式參與基因表達(dá)調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA_0001649在肝癌中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)circRNA_0001649可吸附miR-671-5p，上調(diào)其靶基因RAB11A的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。這些研究表明，非編碼RNA廣泛參與了肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等各個(gè)生物學(xué)過(guò)程，在肝癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估等方面具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。Dicer酶作為一種核糖核酸內(nèi)切酶，在非編碼RNA的生物合成過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。Dicer能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合雙鏈RNA（dsRNA）或具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體RNA，如前體miRNA（pre-miRNA），然后將其切割成長(zhǎng)度約為21-23個(gè)核苷酸的小RNA雙鏈，這些小RNA雙鏈進(jìn)一步被整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，發(fā)揮對(duì)靶基因的調(diào)控作用。Dicer酶的功能異常會(huì)導(dǎo)致非編碼RNA的加工和成熟過(guò)程受阻，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常生理功能，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在肝癌中，Dicer的表達(dá)水平和活性變化與肝癌的惡性程度、預(yù)后等密切相關(guān)。研究表明，Dicer表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致肝癌細(xì)胞中多種miRNA的表達(dá)異常，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。然而，目前對(duì)于Dicer在肝癌中具體調(diào)控哪些非編碼RNA，以及這些非編碼RNA如何介導(dǎo)Dicer對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，仍缺乏系統(tǒng)而深入的研究。高通量測(cè)序技術(shù)作為一種強(qiáng)大的分子生物學(xué)研究工具，能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)大量RNA分子進(jìn)行測(cè)序和分析，全面揭示細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組信息。通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)，可以大規(guī)模地篩選和鑒定在肝癌細(xì)胞中受Dicer調(diào)節(jié)的非編碼RNA，為深入研究Dicer在肝癌中的作用機(jī)制提供豐富的數(shù)據(jù)資源和研究線索。本研究旨在利用高通量測(cè)序技術(shù)，篩選肝癌細(xì)胞中受Dicer調(diào)節(jié)的非編碼RNA，并對(duì)其進(jìn)行功能和機(jī)制研究，以期揭示Dicer在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，為肝癌的早期診斷、靶向治療和預(yù)后評(píng)估提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。這不僅有助于加深我們對(duì)肝癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，還可能為肝癌的臨床治療帶來(lái)新的突破，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來(lái)，肝癌細(xì)胞中非編碼RNA的研究取得了顯著進(jìn)展，為深入了解肝癌的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)提供了重要線索。國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者圍繞非編碼RNA在肝癌中的表達(dá)譜、功能及作用機(jī)制展開(kāi)了廣泛而深入的研究。在miRNA方面，大量研究表明，多種miRNA在肝癌組織和細(xì)胞中呈現(xiàn)異常表達(dá)，并且與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。例如，國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)對(duì)肝癌組織和正常肝組織的miRNA表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)miR-122在肝癌組織中顯著下調(diào)，其低表達(dá)與肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-122可通過(guò)靶向調(diào)控多個(gè)基因，如ADAM10、MMP9等，抑制肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移。國(guó)外研究也報(bào)道了miR-221/222在肝癌中高表達(dá)，通過(guò)抑制其靶基因PTEN、p27等，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和存活。此外，一些miRNA還被發(fā)現(xiàn)可作為肝癌診斷和預(yù)后評(píng)估的生物標(biāo)志物。如miR-199a-5p在肝癌患者血清中的表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照者，且其低表達(dá)與肝癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，有望成為肝癌早期診斷和預(yù)后判斷的潛在指標(biāo)。對(duì)于lncRNA，隨著研究的不斷深入，越來(lái)越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)參與肝癌的生物學(xué)過(guò)程。國(guó)內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)鑒定出了一系列在肝癌中差異表達(dá)的lncRNA，如lncRNAHULC在肝癌組織中高表達(dá)，通過(guò)與miR-372相互作用，解除miR-372對(duì)其靶基因PRKACB的抑制，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。國(guó)外學(xué)者也發(fā)現(xiàn)lncRNAMALAT1在肝癌中上調(diào)，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程。此外，lncRNA還可通過(guò)調(diào)控染色質(zhì)狀態(tài)、基因轉(zhuǎn)錄和mRNA穩(wěn)定性等多種方式影響肝癌的發(fā)生發(fā)展。例如，lncRNACCAT1可通過(guò)招募EZH2，促進(jìn)其靶基因CDKN1A啟動(dòng)子區(qū)域的H3K27me3修飾，抑制CDKN1A的表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。circRNA作為一類新興的非編碼RNA，在肝癌研究領(lǐng)域也逐漸受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA在肝癌細(xì)胞中具有獨(dú)特的表達(dá)譜，且部分circRNA在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。國(guó)內(nèi)研究表明，circRNA_0001649在肝癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)circRNA_0001649可通過(guò)吸附miR-671-5p，上調(diào)其靶基因RAB11A的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。國(guó)外研究也報(bào)道了circRNAciRS-7在肝癌中高表達(dá)，可作為miR-7的海綿，解除miR-7對(duì)其靶基因EGFR、IGF1R等的抑制，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。此外，circRNA還具有穩(wěn)定性高、組織特異性表達(dá)等特點(diǎn)，有望成為肝癌診斷和治療的新靶點(diǎn)。Dicer作為非編碼RNA生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其在肝癌中的調(diào)節(jié)作用也受到了廣泛關(guān)注。國(guó)內(nèi)外研究均表明，Dicer的表達(dá)水平和活性變化與肝癌的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)。在肝癌細(xì)胞中，Dicer表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致多種miRNA的加工和成熟受阻，進(jìn)而影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如，研究發(fā)現(xiàn)Dicer低表達(dá)可使肝癌細(xì)胞中miR-16等miRNA的表達(dá)降低，導(dǎo)致其靶基因Bcl-2等表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力。此外，Dicer還可通過(guò)與其他蛋白質(zhì)相互作用，參與肝癌細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。如Dicer可與TRBP結(jié)合，形成復(fù)合物參與miRNA的加工過(guò)程，而該復(fù)合物的異常也與肝癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)為非編碼RNA的研究提供了強(qiáng)大的技術(shù)支持，極大地推動(dòng)了肝癌細(xì)胞中非編碼RNA的研究進(jìn)展。通過(guò)高通量測(cè)序，能夠全面、快速地檢測(cè)肝癌細(xì)胞中各種非編碼RNA的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)大量新的非編碼RNA，并深入分析其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。國(guó)內(nèi)外眾多研究團(tuán)隊(duì)利用高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)肝癌組織和細(xì)胞中的miRNA、lncRNA和circRNA進(jìn)行了系統(tǒng)的測(cè)序和分析，獲得了豐富的研究成果。例如，國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)高通量測(cè)序篩選出了一系列在肝癌中差異表達(dá)的非編碼RNA，并進(jìn)一步驗(yàn)證了它們?cè)诟伟┘?xì)胞增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)過(guò)程中的作用。國(guó)外研究也利用高通量測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建了肝癌細(xì)胞的非編碼RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為深入理解肝癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。綜上所述，目前國(guó)內(nèi)外在肝癌細(xì)胞非編碼RNA的研究方面已取得了豐碩的成果，揭示了多種非編碼RNA在肝癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用及機(jī)制。然而，對(duì)于Dicer在肝癌中具體調(diào)控哪些非編碼RNA，以及這些非編碼RNA如何介導(dǎo)Dicer對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，仍存在許多未知領(lǐng)域有待進(jìn)一步探索。利用高通量測(cè)序技術(shù)篩選肝癌細(xì)胞中受Dicer調(diào)節(jié)的非編碼RNA，將有助于深入揭示Dicer在肝癌中的作用機(jī)制，為肝癌的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和策略。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)，全面篩選肝癌細(xì)胞中受Dicer調(diào)節(jié)的非編碼RNA，并深入解析其生物學(xué)功能及作用機(jī)制，具體目標(biāo)如下：精準(zhǔn)篩選出肝癌細(xì)胞中受Dicer調(diào)節(jié)的miRNA、lncRNA和circRNA，構(gòu)建詳細(xì)的非編碼RNA表達(dá)譜，明確Dicer對(duì)不同類型非編碼RNA的調(diào)控模式。對(duì)篩選出的關(guān)鍵非編碼RNA進(jìn)行功能驗(yàn)證，闡明其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為的影響，為揭示肝癌發(fā)病機(jī)制提供關(guān)鍵線索。深入探究關(guān)鍵非編碼RNA介導(dǎo)Dicer調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制，明確其上下游作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路，為肝癌的靶向治療提供理論依據(jù)。1.3.2研究?jī)?nèi)容高通量測(cè)序篩選受Dicer調(diào)節(jié)的非編碼RNA：構(gòu)建Dicer敲低及正常表達(dá)的肝癌細(xì)胞模型，通過(guò)qRT-PCR和Westernblot技術(shù)檢測(cè)Dicer的敲低效率及相關(guān)非編碼RNA的表達(dá)水平，確保模型的有效性。提取兩組細(xì)胞的總RNA，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)非編碼RNA進(jìn)行測(cè)序，運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選出在兩組細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA、lncRNA和circRNA。通過(guò)qRT-PCR對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，選取部分差異表達(dá)顯著的非編碼RNA，在更多肝癌細(xì)胞系及臨床肝癌組織樣本中進(jìn)行表達(dá)水平檢測(cè)，進(jìn)一步確認(rèn)其受Dicer調(diào)節(jié)的穩(wěn)定性和可靠性。關(guān)鍵非編碼RNA的功能驗(yàn)證：根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，篩選出與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵非編碼RNA，如在Dicer敲低后表達(dá)顯著改變且已有研究暗示其在肝癌中可能發(fā)揮重要作用的miR-X、lncRNA-Y和circRNA-Z等。設(shè)計(jì)并合成針對(duì)關(guān)鍵非編碼RNA的過(guò)表達(dá)載體和干擾RNA，分別轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或低表達(dá)關(guān)鍵非編碼RNA的細(xì)胞模型。運(yùn)用CCK-8、EdU、Transwell、流式細(xì)胞術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)過(guò)表達(dá)或低表達(dá)關(guān)鍵非編碼RNA對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為的影響。例如，通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化，EdU實(shí)驗(yàn)直觀觀察細(xì)胞DNA合成情況，Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞的遷移和侵襲能力，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率。構(gòu)建肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或低表達(dá)關(guān)鍵非編碼RNA的肝癌細(xì)胞接種到裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況，定期測(cè)量腫瘤體積和重量，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，分析關(guān)鍵非編碼RNA對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行病理學(xué)檢查，包括HE染色觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，免疫組化檢測(cè)增殖、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證關(guān)鍵非編碼RNA在體內(nèi)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用。關(guān)鍵非編碼RNA介導(dǎo)Dicer調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的機(jī)制研究：運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)關(guān)鍵非編碼RNA的潛在作用靶點(diǎn)，如miR-X的靶基因預(yù)測(cè)可利用TargetScan、miRanda等軟件，lncRNA-Y和circRNA-Z的作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)可參考相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)報(bào)道。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)、RNApull-down實(shí)驗(yàn)等技術(shù)，驗(yàn)證關(guān)鍵非編碼RNA與預(yù)測(cè)靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系。例如，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)可將預(yù)測(cè)的靶基因3'UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報(bào)告載體中，與miR-X共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性變化，判斷兩者是否存在靶向結(jié)合關(guān)系；RIP實(shí)驗(yàn)利用針對(duì)關(guān)鍵非編碼RNA結(jié)合蛋白的抗體進(jìn)行免疫沉淀，富集與之結(jié)合的RNA，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的富集情況，驗(yàn)證相互作用；RNApull-down實(shí)驗(yàn)將生物素標(biāo)記的關(guān)鍵非編碼RNA與細(xì)胞裂解液孵育，通過(guò)親和純化富集與之結(jié)合的蛋白質(zhì)，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定潛在的作用靶點(diǎn)。研究關(guān)鍵非編碼RNA通過(guò)作用靶點(diǎn)調(diào)控的相關(guān)信號(hào)通路，運(yùn)用Westernblot、qRT-PCR等技術(shù)檢測(cè)信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白和基因的表達(dá)水平變化。例如，若預(yù)測(cè)miR-X的靶基因參與PI3K-Akt信號(hào)通路，可在過(guò)表達(dá)或低表達(dá)miR-X的肝癌細(xì)胞中，檢測(cè)PI3K、Akt、p-Akt等蛋白的表達(dá)水平，以及該信號(hào)通路下游相關(guān)基因的mRNA表達(dá)變化，明確關(guān)鍵非編碼RNA對(duì)信號(hào)通路的調(diào)控作用。探討Dicer與關(guān)鍵非編碼RNA及其作用靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系，通過(guò)敲低或過(guò)表達(dá)Dicer，檢測(cè)關(guān)鍵非編碼RNA及其作用靶點(diǎn)的表達(dá)變化，以及相關(guān)信號(hào)通路的激活情況，揭示Dicer在肝癌細(xì)胞中通過(guò)調(diào)控關(guān)鍵非編碼RNA及其作用靶點(diǎn)影響細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法高通量測(cè)序技術(shù)：采用IlluminaHiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，全面檢測(cè)Dicer敲低及正常表達(dá)的肝癌細(xì)胞中miRNA、lncRNA和circRNA的表達(dá)譜，獲取海量的非編碼RNA序列信息，為篩選受Dicer調(diào)節(jié)的非編碼RNA提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。生物信息學(xué)分析：運(yùn)用多種生物信息學(xué)軟件和工具，如Bowtie、TopHat、Cufflinks等，對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。通過(guò)與參考基因組比對(duì)、差異表達(dá)分析、功能注釋等，篩選出差異表達(dá)的非編碼RNA，并預(yù)測(cè)其潛在的作用靶點(diǎn)和功能。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)非編碼RNA的靶基因進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）信號(hào)通路富集分析，了解其參與的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系HepG2、Huh7等，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將DicersiRNA或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞中，構(gòu)建Dicer敲低的細(xì)胞模型；同時(shí)，將過(guò)表達(dá)Dicer的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞，構(gòu)建Dicer過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型。利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，EdU染色法觀察細(xì)胞DNA合成情況，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布，研究Dicer及受其調(diào)節(jié)的非編碼RNA對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。通過(guò)免疫熒光染色、蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞定位，深入探討其作用機(jī)制。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，將穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或低表達(dá)關(guān)鍵非編碼RNA的肝癌細(xì)胞懸液皮下注射至裸鼠右側(cè)腋窩皮下，建立肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型。定期測(cè)量腫瘤體積和重量，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進(jìn)行病理學(xué)檢查，包括HE染色觀察腫瘤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，免疫組化檢測(cè)增殖、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證關(guān)鍵非編碼RNA在體內(nèi)對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用。通過(guò)尾靜脈注射等方式，給予裸鼠相應(yīng)的干預(yù)措施，如注射針對(duì)關(guān)鍵非編碼RNA的抑制劑或激動(dòng)劑，觀察其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)Dicer、非編碼RNA及其靶基因的mRNA表達(dá)水平，驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miRNA與靶基因3'UTR之間的靶向結(jié)合關(guān)系；利用RNA免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)、RNApull-down實(shí)驗(yàn)等技術(shù)，研究非編碼RNA與蛋白質(zhì)或其他RNA分子之間的相互作用。通過(guò)基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，對(duì)關(guān)鍵非編碼RNA或其作用靶點(diǎn)進(jìn)行敲除或敲入，進(jìn)一步驗(yàn)證其功能和作用機(jī)制。1.4.2技術(shù)路線構(gòu)建細(xì)胞模型：培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞系，將DicersiRNA或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞中，通過(guò)qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)Dicer的敲低效率；同時(shí)，將過(guò)表達(dá)Dicer的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞，檢測(cè)Dicer的過(guò)表達(dá)效果，確保細(xì)胞模型構(gòu)建成功。高通量測(cè)序及數(shù)據(jù)分析：提取Dicer敲低及正常表達(dá)的肝癌細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和文庫(kù)構(gòu)建，利用高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，去除低質(zhì)量reads和接頭序列，然后與參考基因組比對(duì)，統(tǒng)計(jì)各非編碼RNA的表達(dá)量。通過(guò)差異表達(dá)分析，篩選出在兩組細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA、lncRNA和circRNA，并進(jìn)行聚類分析和功能注釋。關(guān)鍵非編碼RNA篩選與驗(yàn)證：根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果和生物信息學(xué)分析，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，篩選出與肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的關(guān)鍵非編碼RNA。運(yùn)用qRT-PCR在更多肝癌細(xì)胞系及臨床肝癌組織樣本中驗(yàn)證其表達(dá)水平，進(jìn)一步確認(rèn)其受Dicer調(diào)節(jié)的穩(wěn)定性和可靠性。功能驗(yàn)證：設(shè)計(jì)并合成針對(duì)關(guān)鍵非編碼RNA的過(guò)表達(dá)載體和干擾RNA，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)或低表達(dá)關(guān)鍵非編碼RNA的細(xì)胞模型。通過(guò)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，以及裸鼠移植瘤模型等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)關(guān)鍵非編碼RNA對(duì)肝癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。機(jī)制研究：運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)關(guān)鍵非編碼RNA的潛在作用靶點(diǎn)，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、RIP實(shí)驗(yàn)、RNApull-down實(shí)驗(yàn)等技術(shù)驗(yàn)證其相互作用關(guān)系。研究關(guān)鍵非編碼RNA通過(guò)作用靶點(diǎn)調(diào)控的相關(guān)信號(hào)通路，通過(guò)Westernblot、qRT-PCR等技術(shù)檢測(cè)信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白和基因的表達(dá)水平變化。探討Dicer與關(guān)鍵非編碼RNA及其作用靶點(diǎn)之間的相互關(guān)系，揭示Dicer在肝癌細(xì)胞中通過(guò)調(diào)控關(guān)鍵非編碼RNA及其作用靶點(diǎn)影響細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制。二、相關(guān)理論與技術(shù)基礎(chǔ)2.1肝癌細(xì)胞概述肝癌細(xì)胞作為肝癌的主要組成部分，具有獨(dú)特的生物學(xué)特征，這些特征不僅決定了肝癌的發(fā)病機(jī)制和臨床特點(diǎn)，也為肝癌的診斷、治療和研究提供了重要的靶點(diǎn)和方向。肝癌細(xì)胞具有顯著的增殖能力。正常肝細(xì)胞的增殖受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持肝臟的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，肝癌細(xì)胞的增殖調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常，導(dǎo)致其能夠持續(xù)不斷地進(jìn)行分裂和增殖。研究表明，肝癌細(xì)胞中多種原癌基因如MYC、RAS等被激活，它們通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而加速細(xì)胞增殖。同時(shí)，肝癌細(xì)胞中抑癌基因如p53、PTEN等功能缺失，無(wú)法有效抑制細(xì)胞增殖，使得肝癌細(xì)胞獲得了不受控制的增殖優(yōu)勢(shì)。這種過(guò)度增殖使得腫瘤組織能夠快速生長(zhǎng)，侵犯周圍組織和器官，導(dǎo)致肝癌病情的迅速進(jìn)展。肝癌細(xì)胞還具有很強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。侵襲是指肝癌細(xì)胞突破周圍組織的基底膜，向周圍組織浸潤(rùn)；轉(zhuǎn)移則是肝癌細(xì)胞通過(guò)血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，到達(dá)遠(yuǎn)處器官并形成新的腫瘤病灶。肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程涉及多個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)事件。肝癌細(xì)胞會(huì)發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），失去上皮細(xì)胞的特征，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如細(xì)胞極性消失、E-鈣黏蛋白表達(dá)降低、波形蛋白表達(dá)增加等，從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。肝癌細(xì)胞還會(huì)分泌多種蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），降解細(xì)胞外基質(zhì)，為其侵襲和轉(zhuǎn)移開(kāi)辟道路。肝癌細(xì)胞能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞的間隙進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。肝癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后不良的主要原因之一，約70%的肝癌患者在確診時(shí)已發(fā)生不同程度的轉(zhuǎn)移。肝癌細(xì)胞在代謝方面也與正常肝細(xì)胞存在顯著差異。正常肝細(xì)胞主要通過(guò)有氧氧化獲取能量，而肝癌細(xì)胞則更傾向于進(jìn)行有氧糖酵解，即使在有氧條件下，也會(huì)大量攝取葡萄糖并將其轉(zhuǎn)化為乳酸，這種現(xiàn)象被稱為“Warburg效應(yīng)”。肝癌細(xì)胞的有氧糖酵解增強(qiáng)，是由于多種代謝相關(guān)基因和信號(hào)通路的異常調(diào)節(jié)所致。如PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路的激活，可上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1的表達(dá)，增加葡萄糖的攝?。煌瑫r(shí)，該信號(hào)通路還可促進(jìn)磷酸果糖激酶1（PFK1）等糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá)，加速糖酵解過(guò)程。此外，肝癌細(xì)胞中一些線粒體相關(guān)蛋白的表達(dá)和功能異常，也導(dǎo)致線粒體呼吸功能受損，進(jìn)一步促使細(xì)胞依賴有氧糖酵解來(lái)滿足能量需求。這種代謝重編程不僅為肝癌細(xì)胞的快速增殖提供了能量和生物合成原料，還會(huì)影響腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。根據(jù)細(xì)胞來(lái)源和形態(tài)學(xué)特征，肝癌細(xì)胞主要分為肝細(xì)胞癌（HCC）、肝內(nèi)膽管癌（ICC）和混合性肝癌（cHCC-ICC）三種類型。肝細(xì)胞癌最為常見(jiàn)，約占肝癌病例的75%-85%，其起源于肝細(xì)胞，癌細(xì)胞通常呈多邊形，細(xì)胞質(zhì)豐富，核大而深染，常見(jiàn)核仁。肝細(xì)胞癌的發(fā)生與多種因素密切相關(guān)，如乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病等。在我國(guó)，HBV感染是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的主要原因，約80%的肝細(xì)胞癌患者伴有HBV感染。肝內(nèi)膽管癌起源于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，約占肝癌病例的10%-20%，癌細(xì)胞呈立方形或柱狀，排列成腺管狀，管腔內(nèi)可見(jiàn)黏液。肝內(nèi)膽管癌的發(fā)病與肝內(nèi)膽管結(jié)石、原發(fā)性硬化性膽管炎、膽管先天性畸形等因素有關(guān)?；旌闲愿伟﹦t同時(shí)具有肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管癌的特征，約占肝癌病例的1%-5%，其癌細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，治療難度較大。不同類型的肝癌細(xì)胞在生物學(xué)行為、治療反應(yīng)和預(yù)后等方面存在差異，因此準(zhǔn)確的分類對(duì)于肝癌的診斷和治療具有重要意義。肝癌的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，涉及遺傳、環(huán)境、病毒感染等多種因素的相互作用。遺傳因素在肝癌的發(fā)生中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，一些基因突變和染色體異常與肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)。如TP53基因是一種重要的抑癌基因，其突變?cè)诟伟┲休^為常見(jiàn)，突變后的TP53基因失去了對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控功能，導(dǎo)致細(xì)胞癌變。CTNNB1基因編碼β-連環(huán)蛋白，其突變可使β-連環(huán)蛋白在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。此外，染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常，如染色體缺失、擴(kuò)增、易位等，也會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)失調(diào)，引發(fā)肝癌的發(fā)生。環(huán)境因素也是肝癌發(fā)病的重要誘因。長(zhǎng)期大量飲酒是導(dǎo)致肝癌的重要危險(xiǎn)因素之一，酒精在肝臟代謝過(guò)程中產(chǎn)生的乙醛具有細(xì)胞毒性，可損傷肝細(xì)胞的DNA，引發(fā)基因突變，同時(shí)還會(huì)誘導(dǎo)肝臟炎癥和纖維化，逐漸發(fā)展為肝硬化，進(jìn)而增加肝癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。黃曲霉毒素B1是一種由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的強(qiáng)致癌物質(zhì)，主要污染糧食和堅(jiān)果類食物。攝入被黃曲霉毒素B1污染的食物后，其在肝臟內(nèi)經(jīng)過(guò)代謝活化，可與DNA結(jié)合形成加合物，導(dǎo)致基因突變，特別是TP53基因的第249位密碼子易發(fā)生突變，從而誘發(fā)肝癌。此外，水污染、土壤污染、空氣污染等環(huán)境污染物中含有的有害物質(zhì)，如重金屬、多環(huán)芳烴等，也可能通過(guò)長(zhǎng)期接觸或攝入，對(duì)肝臟造成損傷，增加肝癌的發(fā)病幾率。病毒感染在肝癌的發(fā)生發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用，尤其是HBV和HCV感染。HBV是一種DNA病毒，其基因組可整合到宿主肝細(xì)胞的基因組中，導(dǎo)致宿主基因表達(dá)異常，如激活原癌基因、抑制抑癌基因等，從而促進(jìn)肝細(xì)胞的癌變。HBV感染還會(huì)引發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟慢性炎癥和損傷，在反復(fù)的肝細(xì)胞損傷和修復(fù)過(guò)程中，細(xì)胞更容易發(fā)生基因突變，增加肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。HCV是一種RNA病毒，其感染主要通過(guò)直接損傷肝細(xì)胞和誘導(dǎo)肝臟炎癥，導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡和壞死，進(jìn)而促使肝臟纖維化和肝硬化的發(fā)生，最終引發(fā)肝癌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球約50%-80%的肝細(xì)胞癌與HBV感染有關(guān)，20%-30%與HCV感染有關(guān)。在臨床治療方面，肝癌的治療方法主要包括手術(shù)治療、介入治療、靶向治療、免疫治療等。手術(shù)治療是肝癌的主要根治性治療手段，適用于早期肝癌患者。常見(jiàn)的手術(shù)方式包括肝切除術(shù)和肝移植術(shù)。肝切除術(shù)是通過(guò)切除部分肝臟來(lái)去除腫瘤組織，對(duì)于腫瘤局限、肝功能良好的患者，肝切除術(shù)可取得較好的治療效果，5年生存率可達(dá)30%-50%。肝移植術(shù)則是將病變的肝臟替換為健康的肝臟，不僅可以徹底清除腫瘤，還能改善肝功能，適用于肝功能嚴(yán)重受損且符合肝移植指征的肝癌患者，其5年生存率可達(dá)70%左右。然而，由于肝癌起病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，往往錯(cuò)過(guò)了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。介入治療是中晚期肝癌的重要治療方法之一，主要包括經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞（TACE）和射頻消融（RFA）等。TACE是通過(guò)導(dǎo)管將化療藥物和栓塞劑注入腫瘤供血?jiǎng)用}，使腫瘤組織缺血壞死，同時(shí)化療藥物可直接作用于腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮殺傷作用。TACE可有效控制腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)患者的生存期，對(duì)于無(wú)法手術(shù)切除的中晚期肝癌患者，TACE的中位生存期可達(dá)16-20個(gè)月。RFA則是利用射頻電流產(chǎn)生的熱量使腫瘤組織凝固性壞死，適用于腫瘤直徑小于5cm、數(shù)量不超過(guò)3個(gè)的肝癌患者。RFA具有創(chuàng)傷小、恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于符合適應(yīng)證的患者，其療效與手術(shù)切除相當(dāng)，5年生存率可達(dá)40%-50%。靶向治療和免疫治療是近年來(lái)肝癌治療領(lǐng)域的重要進(jìn)展。靶向治療藥物如索拉非尼、樂(lè)伐替尼等，通過(guò)特異性地作用于肝癌細(xì)胞表面的受體或信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移。索拉非尼是一種多激酶抑制劑，可同時(shí)抑制RAF/MEK/ERK信號(hào)通路和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）、血小板衍生生長(zhǎng)因子受體（PDGFR）等，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。樂(lè)伐替尼則主要抑制VEGFR1-3、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFR1-4）等，在肝癌的一線治療中顯示出與索拉非尼相當(dāng)?shù)寞熜АＣ庖咧委熕幬锶缗敛├閱慰埂⒓{武利尤單抗等，通過(guò)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力。這些藥物主要作用于免疫檢查點(diǎn)蛋白，如程序性死亡受體1（PD-1）及其配體（PD-L1）等，阻斷免疫抑制信號(hào)，恢復(fù)T細(xì)胞的活性，從而達(dá)到抗腫瘤的目的。然而，靶向治療和免疫治療也面臨著耐藥性、不良反應(yīng)等問(wèn)題，部分患者對(duì)治療藥物不敏感或在治療過(guò)程中逐漸產(chǎn)生耐藥，限制了其臨床應(yīng)用效果。肝癌細(xì)胞具有獨(dú)特的生物學(xué)特征，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多種因素的相互作用。盡管目前肝癌的臨床治療取得了一定進(jìn)展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如早期診斷困難、治療效果有限、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高等。深入研究肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性和發(fā)病機(jī)制，探索新的治療靶點(diǎn)和治療方法，對(duì)于提高肝癌的臨床治療水平具有重要意義。2.2非編碼RNA簡(jiǎn)介2.2.1非編碼RNA的分類非編碼RNA是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，在細(xì)胞中發(fā)揮著廣泛而重要的調(diào)控作用。根據(jù)其長(zhǎng)度和功能，非編碼RNA可分為多種類型，每種類型都具有獨(dú)特的特點(diǎn)和生物學(xué)功能。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA。lncRNA具有多樣化的結(jié)構(gòu)和功能，可在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平以及表觀遺傳水平等多個(gè)層面調(diào)控基因表達(dá)。從結(jié)構(gòu)上看，lncRNA通常具有多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，可形成復(fù)雜的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，如莖環(huán)結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)等，這些結(jié)構(gòu)有助于其與DNA、RNA和蛋白質(zhì)相互作用。在功能方面，lncRNA可通過(guò)與染色質(zhì)修飾復(fù)合物結(jié)合，影響染色質(zhì)的狀態(tài)和基因的可及性，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。例如，XistlncRNA在X染色體失活過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它可招募多梳抑制復(fù)合物2（PRC2），使X染色體上的基因發(fā)生組蛋白H3賴氨酸27三甲基化（H3K27me3）修飾，導(dǎo)致基因沉默。lncRNA還可以作為分子支架，促進(jìn)蛋白質(zhì)之間的相互作用，形成功能性復(fù)合物，參與基因表達(dá)調(diào)控。微RNA（miRNA）是長(zhǎng)度約為21-23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子。miRNA具有高度的保守性，在不同物種間序列相似度較高。其成熟過(guò)程涉及多個(gè)步驟，首先由基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初級(jí)miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA在細(xì)胞核內(nèi)被Drosha酶切割成前體miRNA（pre-miRNA），pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)后，再由Dicer酶進(jìn)一步加工成成熟的miRNA。miRNA主要通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促使其降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。例如，miR-122在肝臟中高表達(dá)，可通過(guò)與靶mRNA的3'UTR結(jié)合，抑制其翻譯，調(diào)控肝臟中的脂質(zhì)代謝和細(xì)胞增殖等過(guò)程。一個(gè)miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，同時(shí)一個(gè)靶基因也可能受到多個(gè)miRNA的調(diào)控，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。小干擾RNA（siRNA）也是一類長(zhǎng)度約為21-23個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子。siRNA通常來(lái)源于外源的雙鏈RNA，如病毒感染或人工導(dǎo)入的雙鏈RNA。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在雙鏈RNA時(shí)，Dicer酶會(huì)將其切割成siRNA雙鏈，然后siRNA雙鏈被整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，其中一條鏈被降解，另一條鏈則引導(dǎo)RISC識(shí)別并結(jié)合與之互補(bǔ)的靶mRNA，進(jìn)而降解靶mRNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的干擾。與miRNA不同，siRNA具有高度的序列特異性，能夠精確地靶向特定的mRNA序列，因此在基因功能研究和基因治療中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。例如，在抗病毒研究中，可設(shè)計(jì)針對(duì)病毒基因的siRNA，通過(guò)干擾病毒基因的表達(dá)來(lái)抑制病毒的復(fù)制。環(huán)狀RNA（circRNA）是一類具有共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA。circRNA由前體mRNA通過(guò)反向剪接形成，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易被核酸外切酶降解。circRNA具有多種功能，其中較為突出的是作為miRNA海綿，通過(guò)與miRNA結(jié)合，抑制miRNA的活性，間接調(diào)控miRNA靶基因的表達(dá)。例如，circRNAciRS-7含有大量的miR-7結(jié)合位點(diǎn)，可吸附miR-7，解除miR-7對(duì)其靶基因EGFR、IGF1R等的抑制作用，從而影響細(xì)胞的增殖和侵襲等生物學(xué)行為。circRNA還可以與蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能和定位，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。此外，一些circRNA還可能具有翻譯功能，能夠編碼短肽，發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)作用。除了上述幾種常見(jiàn)的非編碼RNA外，還有其他類型的非編碼RNA，如小核RNA（snRNA）、小核仁RNA（snoRNA）、piwi相互作用RNA（piRNA）等。snRNA主要參與mRNA的剪接過(guò)程，與蛋白質(zhì)結(jié)合形成小核核糖核蛋白顆粒（snRNPs），在剪接體的組裝和mRNA前體的剪接中發(fā)揮關(guān)鍵作用。snoRNA主要位于核仁中，參與rRNA的加工和修飾，如甲基化、假尿苷化等，影響rRNA的成熟和核糖體的組裝。piRNA主要存在于生殖細(xì)胞中，與Piwi蛋白結(jié)合形成piRNA-Piwi復(fù)合物，參與轉(zhuǎn)座子的沉默和基因組的穩(wěn)定性維持，對(duì)生殖細(xì)胞的發(fā)育和功能具有重要意義。非編碼RNA的分類豐富多樣，不同類型的非編碼RNA在結(jié)構(gòu)、功能和作用機(jī)制上各具特點(diǎn)，它們相互協(xié)作，共同參與細(xì)胞內(nèi)的各種生物學(xué)過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能和調(diào)控基因表達(dá)起著不可或缺的作用。深入研究非編碼RNA的分類和功能，有助于我們更好地理解生命活動(dòng)的本質(zhì)，為疾病的診斷、治療和預(yù)防提供新的思路和靶點(diǎn)。2.2.2非編碼RNA在肝癌中的作用非編碼RNA在肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等各個(gè)環(huán)節(jié)中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，不同類型的非編碼RNA通過(guò)各自獨(dú)特的作用機(jī)制，對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。miRNA在肝癌中呈現(xiàn)出復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。大量研究表明，多種miRNA在肝癌組織和細(xì)胞中表達(dá)異常，這些異常表達(dá)的miRNA可通過(guò)靶向調(diào)控關(guān)鍵基因，影響肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等過(guò)程。例如，miR-21在肝癌組織中高表達(dá)，它可通過(guò)靶向抑制其靶基因PTEN的表達(dá)，激活PI3K-Akt信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。PTEN是一種重要的抑癌基因，能夠負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。miR-21通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)，解除了對(duì)PI3K-Akt信號(hào)通路的抑制，使得該信號(hào)通路過(guò)度激活，從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。相反，一些miRNA在肝癌中發(fā)揮抑癌作用。如miR-122在肝癌組織中顯著下調(diào)，其低表達(dá)與肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。miR-122可通過(guò)靶向調(diào)控多個(gè)基因，如ADAM10、MMP9等，抑制肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移。ADAM10和MMP9是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解和細(xì)胞遷移的關(guān)鍵蛋白，miR-122通過(guò)抑制它們的表達(dá)，阻礙了肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲過(guò)程。lncRNA在肝癌中的作用也十分顯著，其可通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。在轉(zhuǎn)錄水平，lncRNA可與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合，從而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。例如，lncRNAHULC在肝癌組織中高表達(dá)，它可通過(guò)與轉(zhuǎn)錄因子YY1結(jié)合，促進(jìn)YY1與靶基因啟動(dòng)子的結(jié)合，增強(qiáng)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。在轉(zhuǎn)錄后水平，lncRNA可通過(guò)與mRNA相互作用，影響mRNA的穩(wěn)定性和翻譯過(guò)程。如lncRNAMALAT1在肝癌中上調(diào)，可通過(guò)與mRNA結(jié)合，影響mRNA的剪接和轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程。此外，lncRNA還可作為miRNA海綿，吸附miRNA，解除miRNA對(duì)其靶基因的抑制作用，間接調(diào)控基因表達(dá)。例如，lncRNAH19在肝癌組織中高表達(dá)，可通過(guò)吸附miR-141，解除miR-141對(duì)其靶基因ZEB1的抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。ZEB1是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。circRNA在肝癌中的研究也逐漸深入，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能使其成為肝癌研究的熱點(diǎn)之一。circRNA主要通過(guò)作為miRNA海綿、與蛋白質(zhì)相互作用等方式參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。如circRNA_0001649在肝癌中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)circRNA_0001649可吸附miR-671-5p，上調(diào)其靶基因RAB11A的表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。RAB11A是一種參與細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)牡鞍?，?duì)細(xì)胞的增殖和遷移具有重要調(diào)節(jié)作用。circRNA還可以與蛋白質(zhì)相互作用，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能和定位。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可與某些蛋白質(zhì)結(jié)合，形成復(fù)合物，影響蛋白質(zhì)的活性和細(xì)胞內(nèi)定位，從而參與肝癌細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生物學(xué)過(guò)程。例如，circRNA可與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合，改變其在細(xì)胞內(nèi)的分布，進(jìn)而影響相關(guān)基因的表達(dá)和細(xì)胞功能。在肝癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中，非編碼RNA也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。miRNA可通過(guò)調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達(dá)，影響肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。如miR-200家族成員在肝癌中表達(dá)下調(diào)，可導(dǎo)致上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因E-鈣黏蛋白表達(dá)降低，波形蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。lncRNA也參與了肝癌的轉(zhuǎn)移調(diào)控，如lncRNATUC339在肝癌組織中高表達(dá)，可通過(guò)調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。circRNA同樣與肝癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，circRNACDR1as在肝癌中高表達(dá)，可通過(guò)吸附miR-7，上調(diào)其靶基因IGF1R的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲。非編碼RNA在肝癌的診斷和預(yù)后評(píng)估方面也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。一些非編碼RNA在肝癌患者的血清、血漿或組織中呈現(xiàn)出特異性的表達(dá)模式，可作為肝癌診斷的生物標(biāo)志物。例如，血清miR-122、miR-221等在肝癌患者中的表達(dá)水平與健康對(duì)照者存在顯著差異，有望用于肝癌的早期診斷。lncRNA和circRNA也有類似的潛力，如lncRNAHOTAIR在肝癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平與肝癌的臨床分期和預(yù)后密切相關(guān)，可作為肝癌預(yù)后評(píng)估的指標(biāo)。circRNAcircHIPK3在肝癌患者血清中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與肝癌的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)，具有作為肝癌預(yù)后標(biāo)志物的潛力。非編碼RNA在肝癌中發(fā)揮著多方面的重要作用，它們通過(guò)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)過(guò)程，在肝癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估等方面具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。深入研究非編碼RNA在肝癌中的作用機(jī)制，將為肝癌的精準(zhǔn)診療提供新的靶點(diǎn)和策略。2.3Dicer蛋白及其對(duì)非編碼RNA的調(diào)節(jié)機(jī)制2.3.1Dicer蛋白的結(jié)構(gòu)與功能Dicer蛋白作為RNA干擾（RNAi）機(jī)制中的關(guān)鍵酶，在非編碼RNA的加工成熟過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。Dicer屬于核糖核酸內(nèi)切酶III家族，其結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，包含多個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，賦予了Dicer獨(dú)特的功能。Dicer蛋白的結(jié)構(gòu)主要包括RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域、PAZ結(jié)構(gòu)域、RNaseIII結(jié)構(gòu)域和雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域具有ATP依賴的RNA解旋活性，能夠解開(kāi)雙鏈RNA（dsRNA）的雙鏈結(jié)構(gòu)，使其成為單鏈狀態(tài)，為后續(xù)的切割反應(yīng)提供適宜的底物。在Dicer識(shí)別和結(jié)合具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體miRNA（pre-miRNA）時(shí)，RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域可通過(guò)消耗ATP，解開(kāi)pre-miRNA中的雙鏈部分，使Dicer能夠更好地與底物相互作用。PAZ結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合雙鏈RNA的3'端突出的2個(gè)核苷酸，這種結(jié)合作用對(duì)于Dicer準(zhǔn)確切割RNA起到了定位和導(dǎo)向的作用。研究表明，PAZ結(jié)構(gòu)域與雙鏈RNA的3'端結(jié)合后，可將RNA分子穩(wěn)定在Dicer的活性中心附近，確保RNaseIII結(jié)構(gòu)域能夠在正確的位置進(jìn)行切割，從而保證切割產(chǎn)物的長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。RNaseIII結(jié)構(gòu)域是Dicer發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性的核心區(qū)域，它能夠?qū)﹄p鏈RNA進(jìn)行特異性切割，將其切割成長(zhǎng)度約為21-23個(gè)核苷酸的小RNA雙鏈。RNaseIII結(jié)構(gòu)域含有兩個(gè)催化亞基，這兩個(gè)亞基協(xié)同作用，分別在雙鏈RNA的兩條鏈上進(jìn)行切割，從而產(chǎn)生具有特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的小RNA雙鏈。在切割pre-miRNA時(shí)，RNaseIII結(jié)構(gòu)域可在特定位置切斷磷酸二酯鍵，將pre-miRNA加工成成熟的miRNA雙鏈。雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域則主要負(fù)責(zé)與雙鏈RNA分子的結(jié)合，增強(qiáng)Dicer與底物的親和力，促進(jìn)切割反應(yīng)的進(jìn)行。該結(jié)構(gòu)域能夠與不同來(lái)源的雙鏈RNA，如pre-miRNA、病毒來(lái)源的dsRNA等緊密結(jié)合，確保Dicer能夠高效地識(shí)別和加工這些底物。Dicer蛋白在非編碼RNA的生成過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色。在miRNA的生物合成過(guò)程中，Dicer起著核心作用。首先，基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初級(jí)miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA在細(xì)胞核內(nèi)被Drosha酶切割成pre-miRNA。pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)后，Dicer識(shí)別并結(jié)合pre-miRNA，通過(guò)其多個(gè)結(jié)構(gòu)域的協(xié)同作用，將pre-miRNA切割成約22個(gè)核苷酸的miRNA雙鏈。然后，miRNA雙鏈中的一條鏈被整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，形成成熟的RISC，進(jìn)而通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促使其降解，實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。在siRNA的產(chǎn)生過(guò)程中，Dicer同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到病毒感染或外源雙鏈RNA的侵入時(shí)，Dicer會(huì)將這些雙鏈RNA切割成siRNA雙鏈。siRNA雙鏈被整合到RISC中，其中一條鏈引導(dǎo)RISC識(shí)別并結(jié)合與之互補(bǔ)的靶mRNA，在核酸酶的作用下，靶mRNA被降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒基因或外源基因表達(dá)的干擾。Dicer還參與了其他非編碼RNA的加工和調(diào)控過(guò)程，如在一些物種中，Dicer對(duì)piRNA的生成也有一定的影響。piRNA主要在生殖細(xì)胞中發(fā)揮作用，參與轉(zhuǎn)座子的沉默和基因組的穩(wěn)定性維持，Dicer可能通過(guò)與相關(guān)蛋白相互作用，間接參與piRNA的生物合成和功能調(diào)控。Dicer蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了其在非編碼RNA生成過(guò)程中的關(guān)鍵功能，通過(guò)多個(gè)結(jié)構(gòu)域的協(xié)同作用，Dicer能夠準(zhǔn)確地識(shí)別、切割和加工雙鏈RNA，生成具有特定功能的小RNA分子，參與細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控和多種生物學(xué)過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞的正常生理功能和生物體的發(fā)育、生長(zhǎng)等具有重要意義。2.3.2Dicer調(diào)節(jié)非編碼RNA的作用機(jī)制Dicer對(duì)非編碼RNA的調(diào)節(jié)作用主要通過(guò)參與miRNA、siRNA等非編碼RNA的加工成熟過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)，其作用機(jī)制涉及多個(gè)步驟和多種蛋白質(zhì)的協(xié)同參與，形成了一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在miRNA的加工成熟過(guò)程中，Dicer的作用機(jī)制尤為關(guān)鍵。首先，由基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的pri-miRNA具有較長(zhǎng)的核苷酸序列，其結(jié)構(gòu)包含多個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞核內(nèi)，pri-miRNA被Drosha酶和DGCR8蛋白組成的復(fù)合物識(shí)別并切割，形成長(zhǎng)度約為70-100個(gè)核苷酸的pre-miRNA。Drosha酶是一種III型核糖核酸內(nèi)切酶，它能夠在pri-miRNA的莖環(huán)結(jié)構(gòu)特定位置進(jìn)行切割，產(chǎn)生具有3'端突出的pre-miRNA。DGCR8蛋白則作為輔助因子，與Drosha酶結(jié)合，增強(qiáng)其對(duì)pri-miRNA的識(shí)別和切割能力，確保切割反應(yīng)的準(zhǔn)確性。pre-miRNA形成后，被Exportin-5蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。Exportin-5是一種依賴于Ran-GTP的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合pre-miRNA，將其從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miRNA被Dicer蛋白識(shí)別并結(jié)合。Dicer的PAZ結(jié)構(gòu)域識(shí)別pre-miRNA的3'端突出部分，將其定位在Dicer的活性中心，然后RNaseIII結(jié)構(gòu)域?qū)re-miRNA進(jìn)行切割。RNaseIII結(jié)構(gòu)域中的兩個(gè)催化亞基分別在pre-miRNA的兩條鏈上進(jìn)行切割，使pre-miRNA被加工成約22個(gè)核苷酸的miRNA雙鏈。miRNA雙鏈形成后，其中一條鏈被選擇并整合到RISC中，形成成熟的RISC。這個(gè)選擇過(guò)程涉及到多種蛋白質(zhì)的參與，如AGO蛋白家族。AGO蛋白是RISC的核心組成部分，它能夠與miRNA雙鏈結(jié)合，并協(xié)助選擇出具有引導(dǎo)活性的miRNA鏈。通常情況下，具有較低熱力學(xué)穩(wěn)定性5'端的miRNA鏈會(huì)被優(yōu)先選擇進(jìn)入RISC，而另一條鏈則被降解。成熟的RISC中的miRNA通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促使其降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。如果miRNA與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)，則RISC中的AGO蛋白會(huì)招募核酸酶，對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割降解；如果miRNA與靶mRNA不完全互補(bǔ)配對(duì)，則主要通過(guò)抑制mRNA的翻譯過(guò)程來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。在siRNA的加工成熟過(guò)程中，Dicer的作用機(jī)制與miRNA有所不同，但同樣依賴于其核酸內(nèi)切酶活性。當(dāng)細(xì)胞受到病毒感染或外源雙鏈RNA的侵入時(shí)，這些雙鏈RNA會(huì)被Dicer識(shí)別并結(jié)合。Dicer利用其RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域解開(kāi)雙鏈RNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，然后通過(guò)RNaseIII結(jié)構(gòu)域?qū)﹄p鏈RNA進(jìn)行切割，將其切割成長(zhǎng)度約為21-23個(gè)核苷酸的siRNA雙鏈。siRNA雙鏈形成后，同樣被整合到RISC中。在RISC中，siRNA雙鏈中的一條鏈被選擇作為引導(dǎo)鏈，引導(dǎo)RISC識(shí)別并結(jié)合與之互補(bǔ)的靶mRNA。由于siRNA與靶mRNA具有高度的序列互補(bǔ)性，RISC中的核酸酶會(huì)迅速切割靶mRNA，導(dǎo)致靶mRNA的降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒基因或外源基因表達(dá)的干擾。Dicer還可能通過(guò)與其他蛋白質(zhì)相互作用，間接調(diào)節(jié)非編碼RNA的功能。Dicer可以與TRBP蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物在miRNA和siRNA的加工和功能發(fā)揮中都具有重要作用。TRBP蛋白能夠增強(qiáng)Dicer與雙鏈RNA的結(jié)合能力，促進(jìn)miRNA和siRNA的生成。TRBP蛋白還可以與AGO蛋白相互作用，協(xié)助miRNA和siRNA整合到RISC中，提高RISC的活性。Dicer還可能與一些RNA結(jié)合蛋白相互作用，影響非編碼RNA的穩(wěn)定性、定位和功能。這些相互作用進(jìn)一步豐富了Dicer對(duì)非編碼RNA的調(diào)節(jié)機(jī)制，使其能夠在不同的生物學(xué)環(huán)境中精確地調(diào)控非編碼RNA的功能。Dicer通過(guò)參與miRNA、siRNA等非編碼RNA的加工成熟過(guò)程，以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)非編碼RNA的精細(xì)調(diào)節(jié)。這種調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的平衡、調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為以及應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的變化都具有重要意義。深入研究Dicer調(diào)節(jié)非編碼RNA的作用機(jī)制，有助于我們更好地理解細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為疾病的診斷、治療和預(yù)防提供新的靶點(diǎn)和策略。2.4高通量測(cè)序技術(shù)原理與應(yīng)用2.4.1高通量測(cè)序技術(shù)的基本原理高通量測(cè)序技術(shù)，又稱新一代測(cè)序技術(shù)，是對(duì)傳統(tǒng)Sanger測(cè)序技術(shù)的革命性變革，其具有通量高、速度快、成本低等顯著優(yōu)勢(shì)，能夠在短時(shí)間內(nèi)獲得海量的核酸序列信息，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)研究的發(fā)展。高通量測(cè)序技術(shù)涵蓋多種不同的技術(shù)平臺(tái)，這些平臺(tái)的基本原理主要包括邊合成邊測(cè)序和單分子測(cè)序等。邊合成邊測(cè)序是目前應(yīng)用較為廣泛的高通量測(cè)序原理之一，以Illumina測(cè)序平臺(tái)為例，其具體過(guò)程如下。首先進(jìn)行文庫(kù)制備，將待測(cè)的DNA樣本進(jìn)行片段化處理，使其成為長(zhǎng)度適宜的DNA片段，然后對(duì)這些片段的末端進(jìn)行修復(fù)，并連接上特定的測(cè)序接頭，形成DNA文庫(kù)。文庫(kù)中的DNA片段會(huì)與測(cè)序芯片上的引物進(jìn)行雜交，在DNA聚合酶、dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）和熒光標(biāo)記的核苷酸等物質(zhì)的參與下，進(jìn)行橋式PCR擴(kuò)增。在擴(kuò)增過(guò)程中，DNA片段會(huì)在芯片表面形成DNA簇，每個(gè)DNA簇都包含了大量相同的DNA片段拷貝。接下來(lái)進(jìn)入測(cè)序階段，在每個(gè)測(cè)序循環(huán)中，DNA聚合酶會(huì)將一個(gè)帶有熒光標(biāo)記的核苷酸添加到正在延伸的DNA鏈上，同時(shí)釋放出焦磷酸。不同的核苷酸帶有不同顏色的熒光標(biāo)記，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的顏色，就可以確定添加的是哪種核苷酸，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA序列的測(cè)定。隨著測(cè)序循環(huán)的不斷進(jìn)行，DNA鏈不斷延伸，熒光信號(hào)也不斷被檢測(cè)和記錄，最終獲得完整的DNA序列信息。單分子測(cè)序技術(shù)則是直接對(duì)單個(gè)DNA分子進(jìn)行測(cè)序，無(wú)需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，避免了擴(kuò)增過(guò)程中可能引入的誤差和偏差。以PacificBiosciences公司的SMRT（SingleMoleculeReal-Time）測(cè)序技術(shù)為例，其基本原理基于零模波導(dǎo)孔（ZWM）技術(shù)。在SMRT芯片上，布滿了大量的ZWM小孔，每個(gè)小孔的底部固定有一個(gè)DNA聚合酶分子。將DNA模板與DNA聚合酶結(jié)合后，放入ZWM小孔中，同時(shí)加入dNTP和熒光標(biāo)記的核苷酸。當(dāng)DNA聚合酶催化核苷酸添加到DNA鏈上時(shí)，熒光標(biāo)記的核苷酸會(huì)發(fā)出熒光信號(hào)。由于ZWM小孔的特殊結(jié)構(gòu)，只有在小孔底部附近發(fā)生的熒光信號(hào)才能被檢測(cè)到，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)DNA分子的實(shí)時(shí)測(cè)序。通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的持續(xù)監(jiān)測(cè)和分析，可以準(zhǔn)確地確定DNA序列。SMRT測(cè)序技術(shù)具有長(zhǎng)讀長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，能夠獲得長(zhǎng)達(dá)數(shù)萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)的讀長(zhǎng)，這對(duì)于解析復(fù)雜的基因組結(jié)構(gòu)、檢測(cè)基因融合等具有重要意義。除了上述兩種主要的測(cè)序原理外，還有基于納米孔的測(cè)序技術(shù)，如OxfordNanoporeTechnologies公司的納米孔測(cè)序技術(shù)。其原理是利用生物膜上的納米孔，當(dāng)DNA分子通過(guò)納米孔時(shí)，會(huì)引起納米孔內(nèi)離子電流的變化。不同的堿基對(duì)離子電流的影響不同，通過(guò)檢測(cè)離子電流的變化，就可以識(shí)別出通過(guò)納米孔的DNA序列。納米孔測(cè)序技術(shù)具有實(shí)時(shí)、快速、便攜等特點(diǎn)，可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和即時(shí)診斷等領(lǐng)域。高通量測(cè)序技術(shù)的基本原理雖然各不相同，但都圍繞著如何高效、準(zhǔn)確地獲取核酸序列信息展開(kāi)。這些技術(shù)的不斷發(fā)展和創(chuàng)新，為生命科學(xué)研究提供了強(qiáng)大的工具，使得我們能夠深入探究基因組、轉(zhuǎn)錄組等層面的奧秘，為疾病的診斷、治療和預(yù)防等提供了重要的技術(shù)支持。2.4.2高通量測(cè)序在非編碼RNA研究中的應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)憑借其強(qiáng)大的測(cè)序能力和全面的分析功能，在非編碼RNA研究領(lǐng)域發(fā)揮著舉足輕重的作用，為深入探究非編碼RNA的種類、表達(dá)模式、功能及作用機(jī)制等提供了有力的技術(shù)支持。在發(fā)現(xiàn)新的非編碼RNA方面，高通量測(cè)序技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)的研究方法往往局限于已知的非編碼RNA，難以發(fā)現(xiàn)新的非編碼RNA分子。而高通量測(cè)序技術(shù)能夠?qū)?xì)胞內(nèi)的RNA進(jìn)行全面的測(cè)序，通過(guò)與參考基因組比對(duì)和生物信息學(xué)分析，可以識(shí)別出那些尚未被注釋的非編碼RNA序列。通過(guò)對(duì)肝癌細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞系的高通量測(cè)序，研究人員發(fā)現(xiàn)了一系列新的miRNA、lncRNA和circRNA。這些新發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，為肝癌的研究提供了新的靶點(diǎn)和方向。在對(duì)人類胚胎干細(xì)胞的高通量測(cè)序中，也發(fā)現(xiàn)了許多新的lncRNA，這些lncRNA參與了胚胎干細(xì)胞的自我更新和分化等重要生物學(xué)過(guò)程。高通量測(cè)序技術(shù)還可用于分析非編碼RNA的表達(dá)譜。通過(guò)對(duì)不同組織、不同發(fā)育階段或不同疾病狀態(tài)下的細(xì)胞進(jìn)行高通量測(cè)序，可以全面了解非編碼RNA的表達(dá)變化情況。在肝癌研究中，對(duì)肝癌組織和癌旁正常組織進(jìn)行高通量測(cè)序，分析miRNA、lncRNA和circRNA的表達(dá)譜差異，發(fā)現(xiàn)了許多在肝癌組織中異常表達(dá)的非編碼RNA。一些miRNA在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，而另一些則表達(dá)下調(diào)，這些異常表達(dá)的miRNA可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。對(duì)不同分期的肝癌組織進(jìn)行高通量測(cè)序，還可以觀察到非編碼RNA表達(dá)譜隨腫瘤進(jìn)展的動(dòng)態(tài)變化，為肝癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估提供了潛在的生物標(biāo)志物。在研究非編碼RNA的功能和作用機(jī)制方面，高通量測(cè)序技術(shù)也發(fā)揮著重要作用。通過(guò)對(duì)過(guò)表達(dá)或敲低特定非編碼RNA的細(xì)胞進(jìn)行高通量測(cè)序，結(jié)合生物信息學(xué)分析，可以預(yù)測(cè)非編碼RNA的潛在作用靶點(diǎn)和參與的信號(hào)通路。對(duì)過(guò)表達(dá)miR-X的肝癌細(xì)胞進(jìn)行高通量測(cè)序，分析其mRNA表達(dá)譜的變化，發(fā)現(xiàn)多個(gè)與細(xì)胞增殖、遷移相關(guān)的基因表達(dá)發(fā)生改變，進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，確定了這些基因是miR-X的靶基因，從而揭示了miR-X在肝癌細(xì)胞中的作用機(jī)制。高通量測(cè)序技術(shù)還可以與其他技術(shù)相結(jié)合，如RNA免疫沉淀（RIP）測(cè)序、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）測(cè)序等，深入研究非編碼RNA與蛋白質(zhì)、DNA之間的相互作用，為闡明非編碼RNA的功能和作用機(jī)制提供更全面的信息。高通量測(cè)序技術(shù)在非編碼RNA研究中具有廣泛而重要的應(yīng)用，為發(fā)現(xiàn)新的非編碼RNA、分析其表達(dá)譜以及深入研究其功能和作用機(jī)制提供了強(qiáng)大的技術(shù)手段。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，相信在未來(lái)的非編碼RNA研究中，將會(huì)取得更多突破性的成果，為生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展做出更大的貢獻(xiàn)。三、高通量測(cè)序篩選實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施3.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備3.1.1肝癌細(xì)胞系的選擇與培養(yǎng)本研究選用人肝癌細(xì)胞系HepG2和Huh7作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。HepG2細(xì)胞系來(lái)源于人肝癌組織，具有典型的肝癌細(xì)胞特征，在肝癌研究中應(yīng)用廣泛。它對(duì)多種刺激因素敏感，能夠較好地模擬肝癌細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)行為，是研究肝癌發(fā)病機(jī)制和藥物作用靶點(diǎn)的常用細(xì)胞系。Huh7細(xì)胞系同樣是常用的肝癌細(xì)胞系，其在增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面具有獨(dú)特的特性，且對(duì)某些信號(hào)通路的調(diào)控較為敏感，有助于深入探究肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為和分子機(jī)制。細(xì)胞培養(yǎng)條件如下：將HepG2和Huh7細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胎牛血清為細(xì)胞提供了生長(zhǎng)所需的多種營(yíng)養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、生長(zhǎng)因子等，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。高糖DMEM培養(yǎng)基含有較高濃度的葡萄糖，滿足肝癌細(xì)胞快速增殖對(duì)能量的需求。37℃是人體正常體溫，5%CO?有助于維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供適宜的環(huán)境。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，需定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用胰蛋白酶-EDTA消化液消化細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來(lái)，然后加入適量的含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液進(jìn)行離心，去除上清液，再用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照適當(dāng)?shù)谋壤臃N到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞傳代過(guò)程中，要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免細(xì)胞污染。每次操作前，需用75%酒精擦拭超凈工作臺(tái)臺(tái)面和雙手，所有實(shí)驗(yàn)器材和試劑均需經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的滅菌處理。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，還需定期更換培養(yǎng)基，以去除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢物，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，一般每2-3天更換一次培養(yǎng)基。同時(shí)，要密切關(guān)注細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)速度等變化，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)異常，需及時(shí)分析原因并采取相應(yīng)的措施。3.1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括：DicersiRNA、陰性對(duì)照siRNA、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenPCRMasterMix、RNeasyMiniKit、AgilentRNA6000NanoKit、IlluminaTruSeqStrandedTotalRNALibraryPrepKit等。DicersiRNA用于敲低肝癌細(xì)胞中的Dicer表達(dá)，通過(guò)與DicermRNA互補(bǔ)配對(duì)，在核酸酶的作用下使DicermRNA降解，從而降低Dicer蛋白的表達(dá)水平。陰性對(duì)照siRNA則用于排除非特異性干擾，其序列與細(xì)胞內(nèi)的任何基因均無(wú)同源性。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑是一種陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，能夠?qū)icersiRNA和陰性對(duì)照siRNA高效地轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞中。它通過(guò)與siRNA形成復(fù)合物，利用脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合特性，將siRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。TRIzol試劑用于提取細(xì)胞中的總RNA，其主要成分包括苯酚和胍鹽，能夠迅速裂解細(xì)胞，使RNA釋放出來(lái)，并通過(guò)氯仿抽提等步驟將RNA與蛋白質(zhì)、DNA等雜質(zhì)分離。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒用于將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便后續(xù)進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。SYBRGreenPCRMasterMix是qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中常用的試劑，它含有TaqDNA聚合酶、dNTP、SYBRGreen熒光染料等成分，能夠在PCR擴(kuò)增過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)DNA的擴(kuò)增情況。RNeasyMiniKit用于進(jìn)一步純化RNA，提高RNA的質(zhì)量。AgilentRNA6000NanoKit用于檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度，通過(guò)毛細(xì)管電泳技術(shù)，能夠準(zhǔn)確地分析RNA的完整性和純度。IlluminaTruSeqStrandedTotalRNALibraryPrepKit用于構(gòu)建RNA文庫(kù)，以便進(jìn)行高通量測(cè)序。主要儀器設(shè)備有：CO?培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、PCR儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、核酸電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、Nanodrop分光光度計(jì)、Agilent2100生物分析儀、IlluminaHiSeq測(cè)序儀等。CO?培養(yǎng)箱為細(xì)胞提供了適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，通過(guò)控制溫度、濕度和CO?濃度，保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。超凈工作臺(tái)用于細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作，提供了一個(gè)無(wú)菌的工作環(huán)境，防止外界微生物的污染。離心機(jī)用于分離細(xì)胞、沉淀核酸和蛋白質(zhì)等，通過(guò)高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，使不同密度的物質(zhì)分離。PCR儀用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，能夠精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)DNA的大量擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀用于qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中熒光信號(hào)的變化，從而準(zhǔn)確地定量分析基因的表達(dá)水平。核酸電泳儀用于分離和鑒定核酸，根據(jù)核酸分子的大小和電荷性質(zhì)，在電場(chǎng)的作用下使其在凝膠中遷移，從而實(shí)現(xiàn)分離。凝膠成像系統(tǒng)用于觀察和記錄核酸電泳結(jié)果，通過(guò)對(duì)凝膠進(jìn)行拍照和分析，能夠直觀地了解核酸的純度和濃度。Nanodrop分光光度計(jì)用于測(cè)定核酸和蛋白質(zhì)的濃度和純度，通過(guò)檢測(cè)特定波長(zhǎng)下的吸光度，快速準(zhǔn)確地獲得樣品的相關(guān)信息。Agilent2100生物分析儀用于全面分析RNA的質(zhì)量，除了檢測(cè)濃度和純度外，還能評(píng)估RNA的完整性和降解程度。IlluminaHiSeq測(cè)序儀是高通量測(cè)序的核心設(shè)備，能夠?qū)NA文庫(kù)進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序，獲得海量的序列信息。這些儀器設(shè)備在實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮著各自的關(guān)鍵作用，為實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了重要保障。3.2實(shí)驗(yàn)步驟與流程3.2.1RNA提取與質(zhì)量檢測(cè)RNA提取是高通量測(cè)序?qū)嶒?yàn)的關(guān)鍵起始步驟，其質(zhì)量直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。本研究采用TRIzol試劑法提取肝癌細(xì)胞中的總RNA，該方法基于異硫氰酸胍和苯酚的作用，能夠有效裂解細(xì)胞，使RNA釋放并與蛋白質(zhì)、DNA等雜質(zhì)分離。具體操作如下：首先，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7用PBS緩沖液沖洗兩遍，以去除培養(yǎng)基中的血清和雜質(zhì)。按照每1×10?個(gè)細(xì)胞加入1mLTRIzol試劑的比例，將TRIzol試劑加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，充分吹打，使細(xì)胞裂解液均勻分布。室溫靜置5min，確保細(xì)胞充分裂解。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，使溶液充分混合，室溫靜置3min，然后在4℃、12000g條件下離心15min。離心后，溶液分為三層，上層為無(wú)色透明的水相，含有RNA；中間層為白色的蛋白質(zhì)層；下層為紅色的有機(jī)相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的無(wú)酶EP管中，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10min，使RNA沉淀。在4℃、12000g條件下離心10min，可見(jiàn)管底出現(xiàn)白色沉淀，即為RNA。小心吸去上清液，加入1mL用DEPC水配制的75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，4℃、7500g離心5min，去上清，盡量吸盡乙醇。將EP管敞口放置于超凈工作臺(tái)中干燥5min，待乙醇揮發(fā)完全后，加入適量的DEPC水溶解RNA沉淀。RNA質(zhì)量檢測(cè)對(duì)于保證高通量測(cè)序的成功至關(guān)重要。本研究采用Nanodrop分光光度計(jì)和Agilent2100生物分析儀對(duì)提取的RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。使用Nanodrop分光光度計(jì)測(cè)定RNA在260nm和280nm波長(zhǎng)下的吸光度，計(jì)算OD???/OD???比值，以評(píng)估RNA的純度。純RNA樣品的OD???/OD???比值應(yīng)在1.8-2.0之間，若低于該值，表明存在蛋白質(zhì)污染，可重新用酚/氯仿抽提。使用Agilent2100生物分析儀對(duì)RNA進(jìn)行毛細(xì)管電泳分析，檢測(cè)RNA的完整性和降解程度。通過(guò)分析28S和18SrRNA的條帶亮度和比值，判斷RNA的質(zhì)量。一般認(rèn)為，若28S和18SrRNA條帶明亮、邊緣清晰，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶的2倍，則RNA的質(zhì)量較好。只有RNA質(zhì)量合格，即純度高、完整性好，才能用于后續(xù)的高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序?qū)嶒?yàn)。3.2.2高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建是將提取的RNA轉(zhuǎn)化為可用于測(cè)序的文庫(kù)的關(guān)鍵步驟，其質(zhì)量和準(zhǔn)確性直接影響測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量和后續(xù)分析結(jié)果。本研究采用IlluminaTruSeqStrandedTotalRNALibraryPrepKit進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，該試劑盒能夠高效地將總RNA轉(zhuǎn)化為測(cè)序文庫(kù)，適用于Illumina測(cè)序平臺(tái)。文庫(kù)構(gòu)建的具體流程如下：首先對(duì)提取的總RNA進(jìn)行片段化處理，使用FragmentationBuffer將RNA隨機(jī)打斷成合適長(zhǎng)度的片段，一般為200-300bp。這一步驟通過(guò)控制反應(yīng)條件，如溫度、時(shí)間和緩沖液成分，實(shí)現(xiàn)RNA的均勻片段化，為后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄和文庫(kù)構(gòu)建提供適宜的模板。接著進(jìn)行第一鏈cDNA合成，以片段化的RNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物的作用下，合成第一鏈cDNA。反轉(zhuǎn)錄酶能夠以RNA為模板，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成cDNA，隨機(jī)引物則引導(dǎo)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的起始，確保在RNA片段的不同位置開(kāi)始合成cDNA。隨后進(jìn)行第二鏈cDNA合成，在DNA聚合酶、dNTP和RNaseH的作用下，以第一鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA。RNaseH能夠降解RNA-DNA雜合雙鏈中的RNA鏈，為第二鏈cDNA的合成提供單鏈模板，DNA聚合酶則催化dNTP的聚合反應(yīng)，合成互補(bǔ)的第二鏈cDNA。對(duì)合成的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)，使用T4DNA聚合酶、Klenow片段和T4多核苷酸激酶等酶，將雙鏈cDNA的末端修復(fù)為平端，并在5'端加上磷酸基團(tuán)。這一步驟使雙鏈cDNA的末端結(jié)構(gòu)整齊，便于后續(xù)的接頭連接。在雙鏈cDNA的3'端加上“A”尾，使用Klenow片段（3'-5'exo-）和dATP，在3'端添加一個(gè)突出的“A”堿基?！癆”尾的添加有助于后續(xù)接頭的連接，提高連接效率。將帶有“A”尾的雙鏈cDNA與