蛋白質組學技術在結核病診斷標志物篩選中的應用及進展摘要結核病的蛋白質組學研究是當前的熱點，蛋白質組學分析在尋找新的結核病診斷標志物、篩選藥物靶點、評估新疫苗及了解疾病發(fā)生機制方面具有廣闊的前景。本文旨在綜述蛋白質組學在結核病診斷標志物篩選中的研究進展，重點介紹蛋白質組學策略及蛋白質組學技術在活動性結核病、結核分枝桿菌潛伏感染、耐藥結核病和兒童結核病診斷標志物篩選中的作用，探討生物標志物轉化在臨床應用方面的潛力和挑戰(zhàn)。結核病是由MTB感染引起的慢性感染性疾病，是全球十大死亡原因之一。2019年世界衛(wèi)生組織（WHO）報告顯示約有1000萬人患結核病，120萬例死亡[1]。快速而準確的診斷是控制結核病的關鍵環(huán)節(jié)之一。目前，結核病的診斷主要根據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學檢查和實驗室檢查。由于影像學檢查的敏感度和特異度均不是很理想，而結核病的臨床表現(xiàn)又多種多樣，很多患者癥狀不典型，因此實驗室檢查是目前結核診斷的主要依據(jù)。但目前，結核病診斷的實驗室檢測方法均存在不同程度的敏感性差、檢測周期長和操作復雜等問題，難以滿足臨床要求，因此，篩選新的結核病診斷標志物以促進結核病的快速、準確診斷對全球結核病的控制至關重要。蛋白質組學技術是篩選疾病診斷標志物的經(jīng)典方法，隨著蛋白質組學相關技術的發(fā)展和對結核病認識的加深，近年來蛋白質組學技術在結核病診斷標志物的篩選和鑒定方面獲得了廣泛應用?，F(xiàn)將近年來蛋白質組學技術在結核病診斷標志物篩選中的應用及其研究進展綜述如下。一、蛋白質組學技術及其分析策略1991年Nagai等[2]首次應用雙向電泳（2-DE）結合質譜技術分離和鑒定了MTBH37Rv菌株早期培養(yǎng)濾液中的蛋白質，拉開了MTB蛋白質組學研究的序幕。最初，研究者多采用雙向凝膠電泳等凝膠技術分離蛋白質[3]。雙向電泳技術具有較高的分辨率和良好的重現(xiàn)性，但對極酸性或堿性、疏水性和低豐度蛋白的分離能力差，因此在對含大量高豐度蛋白的血清等體液標本進行生物標志物的篩選和鑒定時存在一定的限制。近年來，無標記定量和穩(wěn)定同位素標記技術等非電泳分離技術的發(fā)展極大地推動了蛋白質組學技術的發(fā)展，并在結核病生物標志物的篩選和鑒定中得到了大量的應用。.無標記定量技術或非標記定量技術（label-free）是一種通過直接分析在蛋白質鑒定時所產(chǎn)生的質譜數(shù)據(jù)，比較來自不同樣品的相應肽段的信號強度而進行蛋白質相對定量的方法。與雙向電泳技術比較,無標記定量技術更省時省力，且因無需進行復雜的標記，無標記定量方法具有樣品制備簡單、數(shù)據(jù)分析便捷等優(yōu)點，適合大樣本的差異蛋白篩選。穩(wěn)定同位素標記技術中最常用的是iTRAQ技術，是一種體外同位素標記的相對與絕對定量技術,其利用多種同位素標記蛋白多肽N末端或賴氨酸側鏈基團,再利用高精度質譜儀串聯(lián)分析,可同時比較多達8組樣品之間的蛋白表達量,具有定量精確、高效率樣品分離、高鑒定率、適用范圍廣等優(yōu)點[4]。蛋白質組學篩選疾病標志物的常規(guī)策略是先進行組學篩查，然后用ELISA或免疫印跡技術驗證差異蛋白的表達，再通過盲測法進行臨床效能的驗證[5,6,7]。隨著蛋白質組學技術的不斷發(fā)展，基于靶向蛋白質組學的"三角策略"逐漸開始應用于生物標志物的篩選和驗證[8]。靶向蛋白質組學是一種基于候選蛋白質的蛋白質組學技術,可能夠根據(jù)肽的質量和（或）裂解特點,通過多重反應監(jiān)測技術、平行反應監(jiān)測技術或數(shù)據(jù)非依賴采集技術在復雜的背景中檢測出代表目標蛋白質的特定肽[9]，實現(xiàn)對目標蛋白或肽段的準確定量，具有很好的抗干擾能力且敏感度較高，常用于初篩得到的目標蛋白表達水平的驗證。在此基礎上建立的"三角策略"包括發(fā)現(xiàn)、驗證和再確證，即首先用鳥槍蛋白組學（shotgunproteomics）在相對較小樣本量中識別差異表達蛋白作為候選蛋白質組，然后在中等樣本量中用靶向蛋白質組學對候選蛋白質組進行驗證，最后用免疫分析方法在大樣本中對非常有希望的蛋白質進行評估以驗證其臨床相關性[10]。靶向蛋白質組學技術與ELISA和免疫印跡等傳統(tǒng)驗證技術相比能檢測到的蛋白范圍更廣，對低豐度蛋白更敏感，且由于分析過程無需借助特異性抗體，靶向蛋白質組學技術的成本更低，更省時省力，尤其對于尚無商品化抗體的蛋白質的驗證是最佳選擇之一。二、蛋白質組學技術在活動性結核病診斷中的應用活動性結核的診斷是臨床最為關注的問題。處于活動期的結核病患者，體內MTB的代謝和人體的免疫應答均很活躍，MTB分泌的蛋白和人體組織細胞表達的蛋白種類和水平都會發(fā)生改變，部分蛋白可能釋放至局部組織、體液甚至進入血流，這些表達改變的蛋白即可作為結核病診斷的標志物。由于具有標本獲取方便、微創(chuàng)、操作簡便等優(yōu)點，以血清或血漿為標本的體外診斷方法一直是最受歡迎的方法。Zhang等[11]應用表面增強激光解吸或電離飛行時間質譜（SELDI-TOFMS）技術結合芯片技術，篩選出了50個在結核病組與對照組間存在顯著差異的蛋白峰，并選取了其中3個蛋白峰進行系統(tǒng)分類，建立診斷模型，結果顯示該3個蛋白聯(lián)合診斷模型對活動性結核病診斷的敏感度為96.9%，特異度為97.8%，該學者采用液相色譜串聯(lián)質譜技術鑒定了其中一種差異最大的蛋白質峰，顯示其為α-酸性糖蛋白。在此基礎上，作者通過免疫印跡技術證實了該蛋白在結核病患者血清中高表達，其水平顯著高于健康對照組和非結核病的疾病對照組，提示這種蛋白是一種非常有潛力的結核病診斷標志物。Li等[5]采用iTRAQ技術結合基質輔助激光解吸飛行時間質譜（MALDI-TOF-MS）技術對活動性肺結核和對照組（肺炎、健康人）血清的差異蛋白進行了篩選，發(fā)現(xiàn)了26個顯著差異表達的蛋白，結合生物信息學分析，并通過免疫組織化學和免疫印跡技術的驗證，作者發(fā)現(xiàn)其中一種蛋白，即性激素結合球蛋白（SHBG）具有潛在的診斷價值。在此基礎上，作者通過ELISA方法在另一組獨立樣本中進行了盲測驗證，結果顯示該蛋白診斷肺結核的敏感度和特異度分別為75.6%和91.5%。以血清或血漿為研究標本，其他一些研究團隊[6,12,13,14]應用iTRAQ或label-free技術及SOMAscan技術也陸續(xù)篩選得到了一系列具有活動性結核病潛在診斷價值的差異表達蛋白，顯示蛋白質組學技術在結核病血清或血漿生物標志物的篩選中正得到越來越多的關注。除此之外，蛋白質組學技術也被應用于從人體其他體液標本中篩選結核病的診斷標志物。如Wang等[7]采用二維電泳結合MALDI-TOF-MS技術分析了45例初診肺結核患者和45例健康對照患者的尿液蛋白組學特征，鑒定出了19種差異表達蛋白，并通過Westernblotting和qRT-PCR技術在獨立樣本中分別驗證了這些蛋白的翻譯和轉錄水平，結果發(fā)現(xiàn)甘露糖結合凝集素2和α-胰蛋白酶抑制劑H4的差異表達最顯著，這2個蛋白聯(lián)合miR-625-3p水平診斷結核病的敏感度為85.87%，特異度為87.50%。除了尿液標本外，研究者們采用蛋白質組學技術從腦脊液、胸腔積液和腹水等體液標本中同樣篩選到了一些結核病診斷的潛在標志物。如Mu等[15]采用iTRAQ?技術結合LC-MS/MS技術發(fā)現(xiàn)載脂蛋白B可用于區(qū)分結核性腦膜炎患者與健康對照和病毒性腦膜炎患者，其敏感度和特異度分別達到89.3%和92.0%。Shi等[16]應用iTRAQTM結合LC-MS/MS技術對結核性胸腔積液和惡性胸腔積液的差異蛋白進行了篩選，發(fā)現(xiàn)纖連蛋白、組織蛋白酶G和白三烯-A4水解酶具有潛在的診斷價值，且其組合在區(qū)分結核性胸腔積液和惡性胸腔積液時有較高的診斷能力。此外，還報道了利用蛋白質組學技術在體液標本中篩選結核病診斷標志物的研究成果[17,18,19]，提示蛋白質組學技術在結核病診斷標志物的篩選中正發(fā)揮著越來越重要的作用。三、蛋白質組學技術在MTB潛伏感染人群篩查中的應用研究結果顯示，絕大多數(shù)的結核病來自MTB潛伏感染的活化，因此MTB的潛伏感染者是結核病的主要來源。WHO的報告顯示，MTB潛伏感染人群約17億[1]。一般情況下，這些潛伏感染者中5%~10%的人最終發(fā)展為活動性結核病，但對于免疫功能低下人群，如并發(fā)HIV感染、接受激素或免疫抑制劑治療的感染者，結核病活化的概率大大提高，因此準確鑒別出這一人群并有針對性地加以干預，對于預防MTB的活化具有積極意義。MTB潛伏感染者機體內長期帶菌，可能會誘導抗體產(chǎn)生免疫防御反應，導致相關蛋白的表達發(fā)生變化，這些變化的人體應答蛋白和MTB釋放的蛋白可作為診斷和鑒別診斷的潛在生物標志物。如通過采用弱陽離子交換磁珠分餾聯(lián)合MALDI-TOFMS技術對MTB潛伏感染者和健康人的差異血漿蛋白進行篩選，發(fā)現(xiàn)了5個差異性蛋白峰，隨后采用納米液相色譜-離子噴霧-串聯(lián)質譜聯(lián)用技術從中成功鑒定了14個潛在的MTB潛伏感染的生物標志物，并通過免疫印跡技術對其中6種蛋白進行了驗證[14]。Sun等[20]采用無標記蛋白質組學技術（label-free）對活動性肺結核和MTB潛伏感染者血漿中差異蛋白進行了篩選，發(fā)現(xiàn)了31個在肺結核、MTB潛伏感染和健康人群中具有顯著表達差異的蛋白，通過Westernblot和ELISA技術的驗證，發(fā)現(xiàn)α-1-抗胰凝乳蛋白酶、α-1-酸性糖蛋白1和E-鈣黏蛋白具有潛在的診斷價值，基于這3種蛋白建立的聯(lián)合診斷模型顯示，聯(lián)合這3個指標可較好的區(qū)分肺結核患者和MTB潛伏感染者，其敏感度和特異度分別達到75.0%和96.1%。四、蛋白質組學技術在耐藥結核病生物標志物篩選中的應用耐藥結核病是當今世界非常嚴峻的公共衛(wèi)生問題,直接影響著全球結核病疫情的控制。藥敏試驗是耐藥結核病診斷的金標準，但常規(guī)的MTB藥敏試驗需要6~8周才能得到結果。因此，有研究者希望借助蛋白質組學技術篩選和鑒定與MTB耐藥性相關的生物標志物，以作為耐藥結核病的輔助診斷工具[21]。通過對耐藥菌株的蛋白質組進行分析可發(fā)現(xiàn)一些耐藥性的潛在標志物。Sharma等[22]應用二維凝膠電泳（2DGE）結合MALDI-TOF-MS技術對鏈霉素耐藥及敏感菌株的分泌蛋白進行差異蛋白質組學分析，發(fā)現(xiàn)在耐藥分離株中有15種分泌蛋白的表達水平顯著上調，其中5種蛋白具有未知的功能，這些過表達蛋白的累積效應可能與鏈霉素耐藥有關，可作為診斷標志物或潛在的藥物靶點。deKeijzer等[23]先應用納米氣相色譜-質譜聯(lián)用技術對分離自臨床結核病患者的、較常出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象的MTB北京株和對結核病治療藥物敏感的MTB標準株H37Rv的蛋白質進行比較分析，然后通過數(shù)據(jù)依賴采集和靶向蛋白質組學方法，對其中存在差異表達的33個候選蛋白的豐度進行量化，結果顯示在MTB北京株和標準株間確實存在表達顯著差異的蛋白質，但由于作者并未對這些候選分子進行進一步的研究分析，其臨床診斷效能尚需臨床驗證。此外，還有些學者[24,25,26]通過對MTB的耐多藥菌株與敏感菌株進行比較蛋白質組學分析，在耐多藥MTB中鑒定到了一些差異表達蛋白，這些蛋白可能成為有價值的結核病候選疫苗或耐藥結核病快速診斷的標志物。除了分析MTB來源的差異蛋白外，對不同MTB感染的宿主蛋白組的比較分析也是耐藥結核病診斷研究的主要目標之一。我國學者Wang等[27]通過iTRAQ與測序技術的聯(lián)合應用，在耐多藥結核病患者血清中鑒定出了50個差異表達蛋白和43個差異表達miRNA，在分別采用ELISA技術和qRT-PCR技術進行驗證后，作者建立了聯(lián)合CD44、KNG1激肽原1、miR-4433b-5p、miR-424-5p和miR-199b-5p生物標志物的耐多藥結核病診斷模型。作者認為這一整合的轉錄組學和蛋白質組學數(shù)據(jù)不僅發(fā)現(xiàn)了一組可能用于耐多藥結核病診斷的miRNA或蛋白，而且對揭示耐多藥結核病的分子發(fā)病機制具有重要意義。五、問題與展望近十年來，國內外很多研究者應用蛋白質組學技術開展了大量結核病診斷標志物的篩選研究，并取得了一定進展。但通過綜合這些研究可以發(fā)現(xiàn)，蛋白質組學技術在結核病診斷標志物的篩選研究和應用中仍存在一些亟需解決的問題：（1）檢測標準化較差：樣品的采集標準、樣品準備的一致性及操作流程不同均可導致研究結果的差異，如尿樣在儲存過程中經(jīng)常不穩(wěn)定，因此需要研究穩(wěn)定尿蛋白的最佳方法。（2）敏感度不夠：樣本預處理需去除高豐度蛋白，這將面臨著低豐度蛋白質損失嚴重、疏水性膜蛋白質溶解困難等問題,進而影響蛋白質檢測的敏感度。（3）生物標志物的驗證是蛋白質組學研究成果應用于臨床的重