缺氧誘導(dǎo)食管鱗癌細(xì)胞中白細(xì)胞介素-7表達(dá)促進(jìn)腫瘤進(jìn)展（全文）［摘要］背景與目的：缺氧和細(xì)胞因子均能介導(dǎo)食管鱗癌（esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC）的進(jìn)展，但是相關(guān)機(jī)制仍未可知。探討缺氧促進(jìn)ESCC細(xì)胞中白細(xì)胞介素-7（interleukin-7，IL-7）分泌增強(qiáng)，進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤進(jìn)展的機(jī)制。方法：采用三氣培養(yǎng)箱建立缺氧模型，通過(guò)ESCC細(xì)胞系KYSE410，并采用細(xì)胞因子陣列蛋白芯片技術(shù)觀察缺氧對(duì)ESCC中細(xì)胞因子分泌的影響。通過(guò)KYSE410及KYSE30ESCC細(xì)胞系，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）法觀察缺氧對(duì)ESCC細(xì)胞IL-7分泌的影響。以磷酸鹽緩沖液（phosphate-bufferedsaline，PBS）為對(duì)照組，IL-7中和抗體為治療組，采用MTS法觀察IL-7是否能夠介導(dǎo)缺氧狀態(tài)下ESCC細(xì)胞增殖。采用transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)缺氧狀態(tài)下，IL-7對(duì)ESCC細(xì)胞侵襲能力的影響。采用信號(hào)通路定量ELISA法，檢測(cè)缺氧通過(guò)IL-7對(duì)ESCC細(xì)胞系中蛋白激酶B（proteinkinaseB，AKT）活性的影響。結(jié)果：缺氧24h后，KYSE410細(xì)胞中多種細(xì)胞因子分泌增高，其中以IL-7最為明顯。ELISA法進(jìn)一步證實(shí)，缺氧能夠顯著誘導(dǎo)KYSE410及KYSE30細(xì)胞中IL-7分泌增強(qiáng)。MTS法及transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-7中和抗體能夠顯著抑制缺氧狀態(tài)下KYSE410及KYSE30細(xì)胞系的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移。信號(hào)通路ELISA法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-7調(diào)控缺氧ESCC細(xì)胞系中AKT的活性。結(jié)論：IL-7是介導(dǎo)缺氧促進(jìn)ESCC進(jìn)展的重要細(xì)胞因子，本研究為基于IL-7確立ESCC治療新策略提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。食管癌是常見(jiàn)的消化道腫瘤，中國(guó)是食管癌高發(fā)國(guó)家之一，世界上超過(guò)50%的食管癌發(fā)生在中國(guó)［1-3］。現(xiàn)階段中國(guó)食管癌患者5年生存率為30.3%。食管癌有兩種主要的病理學(xué)類型，分別為食管鱗癌（esophagealsquamouscellcarcinoma，ESCC）和食管腺癌（esophagealadenocarcinoma，EAC）。在中國(guó)，食管癌的類型主要為ESCC，占95%以上。臨床上治療ESCC的一線化療藥物主要為順鉑，但是其效果不佳，極易出現(xiàn)耐藥。此外，ESCC分子分型不明確，導(dǎo)致很多基于分子靶點(diǎn)開(kāi)展的靶向治療的效果仍存在爭(zhēng)議。因此，闡明誘導(dǎo)ESCC進(jìn)展的分子機(jī)制將為治療ESCC提供有效的分子靶點(diǎn)。缺氧是介導(dǎo)實(shí)體瘤進(jìn)展的重要因素［4］。臨床研究［5］顯示，缺氧與腫瘤患者不良預(yù)后密切相關(guān)。在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中，缺氧能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞代謝改變、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）及腫瘤干細(xì)胞形成，使腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，并產(chǎn)生放化療抵抗［6-8］。研究［9］發(fā)現(xiàn)，缺氧能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自分泌細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。本研究將篩選缺氧誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)譜，并重點(diǎn)研究白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-7對(duì)缺氧情況下ESCC進(jìn)展的影響。1、材料和方法1.1試劑與耗材IL-7中和抗體（貨號(hào)：MAB207）及IL-7酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）試劑盒（貨號(hào)：HS750）均購(gòu)自美國(guó)R&D公司，細(xì)胞因子陣列蛋白芯片（貨號(hào)：AAH-CYT-6）及蛋白激酶B（proteinkinaseB，AKT）定量ELISA活性檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：PEL-AKT-S473-T-1）購(gòu)自美國(guó)RayBiotech公司，MTS檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：G3580）購(gòu)自美國(guó)Progema公司，RPMI-1640培養(yǎng)基（貨號(hào)：A1049101）及胎牛血清（貨號(hào)：10099）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，transwell侵襲小室（貨號(hào)：CLS3422）購(gòu)自美國(guó)Corning公司。1.2細(xì)胞培養(yǎng)人ESCC細(xì)胞系KYSE410和KYSE30均由惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制及轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。常氧培養(yǎng)條件為：37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%。缺氧培養(yǎng)條件為：37℃、N2體積分?jǐn)?shù)為94%、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、O2體積分?jǐn)?shù)為1%。1.3細(xì)胞因子陣列蛋白芯片檢測(cè)細(xì)胞因子分泌將KYSE410細(xì)胞分別置于常氧及缺氧條件下培養(yǎng)。24h后，收集上清液，將1mL細(xì)胞上清液與包被細(xì)胞因子抗體的蛋白芯片于4℃過(guò)夜溫育。之后棄上清液，加入洗液清洗蛋白芯片后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素（horseradishperoxidase-streptavidin，HRP-SA）室溫溫育2h后，洗去HRP-SA，加入顯色液曝光顯影。1.4MTS法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以每孔3000個(gè)細(xì)胞的密度均勻接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁后，置于缺氧培養(yǎng)環(huán)境并加入磷酸鹽緩沖液（phosphate-bufferedsaline，PBS）及IL-7中和抗體。48h后，每孔加入10μLMTS溶液。使用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)處每孔的吸光度（D）值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次取平均值。1.5侵襲遷移實(shí)驗(yàn)將KYSE410及KYSE30在不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中于常氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。12h后，收集細(xì)胞，以每孔10000/200μL的密度接種于覆蓋（侵襲實(shí)驗(yàn)）或不覆蓋基質(zhì)膠（遷移實(shí)驗(yàn)）的transwell小室的上室，下室中加入1mL含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，缺氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h后取出小室，甲醇固定5min，結(jié)晶紫染色30min后，擦去上室內(nèi)的細(xì)胞。顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次取平均值。1.6ELISA法檢測(cè)IL-7分泌及AKT活性在檢測(cè)IL-7分泌的過(guò)程中，將KYSE410及KYSE30細(xì)胞分別置于常氧及缺氧培養(yǎng)條件下。24h后，收集上清液，將20μL樣本與80μL樣本稀釋液混勻后，加入96孔板中，室溫溫育2h后，洗掉樣本。逐步加入一抗稀釋液、洗脫、加入HRP-SA、洗脫、加入顯色液、置于室溫避光溫育30min后，加入終止液，混勻后酶標(biāo)儀檢測(cè)D值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。在檢測(cè)AKT活性的過(guò)程中，將KYSE410及KYSE30細(xì)胞分別置于常氧及缺氧培養(yǎng)條件下。24h后，收集細(xì)胞，用裂解液裂解蛋白，將蛋白裂解液（約20μg/孔）加入96孔板后，按照試劑盒使用說(shuō)明檢測(cè)腫瘤細(xì)胞AKT活性（磷酸化AKTSer473的D值/總AKT的D值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次取平均值。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPadPrism7.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以x±s的形式表示。獨(dú)立兩組間比較使用非配對(duì)t檢驗(yàn)。量效關(guān)系使用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2、結(jié)果2.1缺氧誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞中細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)譜改變?nèi)毖跷h(huán)境可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌增強(qiáng)，但是缺氧對(duì)ESCC細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)控仍未可知。為明確缺氧調(diào)控ESCC細(xì)胞中哪些細(xì)胞因子，本研究采用細(xì)胞因子陣列蛋白芯片技術(shù)分析常氧狀態(tài)下ESCC細(xì)胞系KYSE410與缺氧狀態(tài)下KYSE410中的細(xì)胞因子表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)缺氧處理24h后，KYSE410細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，如IL-10、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-7、單核細(xì)胞趨化蛋白2（monocytechemoattractantprotein2，MCP2）、C-C趨化因子配體（C-Cmotifchemokineligand，CCL）5、CCL17、CCL18及腫瘤壞死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）等。這些細(xì)胞因子均與腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切，參與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、血管新生及免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用。其中，ESCC細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下IL-7的分泌增高最為明顯（圖1）。2.2缺氧誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞中IL-7分泌增強(qiáng)進(jìn)一步研究缺氧是否可以介導(dǎo)ESCC細(xì)胞中IL-7分泌增多，以常氧條件培養(yǎng)的KYSE410、KYSE30細(xì)胞系為常氧組，缺氧24h培養(yǎng)的KYSE410、KYSE30細(xì)胞系為缺氧組，并通過(guò)ELISA法分析兩個(gè)細(xì)胞系中IL-7的分泌情況。ELISA法實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧顯著誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞系中IL-7的分泌。對(duì)照組KYSE410細(xì)胞IL-7分泌量為（275.70±82.98）pg/mL，實(shí)驗(yàn)組KYSE410細(xì)胞IL-7分泌量為（2451.00±87.90）pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）；對(duì)照組KYSE30細(xì)胞IL-7分泌量為（325.80±85.46）pg/mL，實(shí)驗(yàn)組KYSE410細(xì)胞IL-7分泌量為（2653.00±126.70）pg/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，圖2）。圖1缺氧誘導(dǎo)KYSE410細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)譜改變Fig.1HypoxiainducedtheexpressionprofileofcytokinesandchemokinesofKYSE410cell圖2缺氧誘導(dǎo)KYSE410及KYSE30細(xì)胞中IL-7分泌增強(qiáng)Fig.2HypoxiainducedtheIL-7secretionfromKYSE410andKYSE30cellsELISAassaywasusedtoassesstheIL-7secretionfromKYSE410andKYSE30cellsundernormoxicorhypoxicconditionfor24h.***:P<0.001,comparedwithnormoxia2.3IL-7中和抗體抑制缺氧狀態(tài)下ESCC細(xì)胞的增殖在缺氧狀態(tài)下（48h），以PBS為對(duì)照，采用不同濃度的IL-7中和抗體（5、10μg/mL）處理KYSE410及KYSE30細(xì)胞。MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IL-7中和抗體能夠劑量依賴性地抑制ESCC細(xì)胞系增殖。對(duì)照組KYSE410細(xì)胞相對(duì)增殖率（與本組比較）為1.000±0.055，IL-7中和抗體（5μg/mL）處理KYSE410細(xì)胞組相對(duì)增殖率（與對(duì)照組比較）為0.610±0.026，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。IL-7中和抗體（10μg/mL）處理KYSE410細(xì)胞組相對(duì)增殖率（與對(duì)照組比較）為0.326±0.022，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。對(duì)照組KYSE30細(xì)胞相對(duì)增殖率（與本組比較）為1.000±0.036，IL-7中和抗體（5μg/mL）處理KYSE30細(xì)胞組相對(duì)增殖率（與對(duì)照組比較）為0.673±0.019，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。IL-7中和抗體（10μg/mL）處理KYSE30細(xì)胞組相對(duì)增殖率（與對(duì)照組比較）為0.359±0.017，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，圖3）。圖3IL-7中和抗體抑制缺氧狀態(tài)下KYSE410及KYSE30細(xì)胞的增殖Fig.3IL-7neutralizingantibodyinhibitedproliferationofKYSE410andKYSE30cellsunderhypoxiaMTSassaywasappliedtoevaluatethegrowthabilityofKYSE410andKYSE30cellstreatedwithPBS(controlsolvent),orIL-7antibody(5,10μg/mL),underhypoxiafor2d.***:P<0.001,comparedwithcontrolgroup2.4IL-7中和抗體抑制缺氧狀態(tài)下ESCC細(xì)胞的侵襲及遷移Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，隨著IL-7中和抗體（5、10μg/mL）濃度的增高，缺氧狀態(tài)下，ESCC細(xì)胞系KYSE410及KYSE30侵襲及遷移能力顯著降低。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組KYSE410細(xì)胞相對(duì)侵襲率（與本組比較）為1.000±0.117，IL-7中和抗體（5μg/mL）處理KYSE410細(xì)胞組相對(duì)侵襲率（與對(duì)照組比較）為0.388±0.070，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。IL-7中和抗體（10μg/mL）處理KYSE410細(xì)胞組相對(duì)侵襲率（與對(duì)照組比較）為0.174±0.025，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。對(duì)照組KYSE30細(xì)胞相對(duì)侵襲率（與本組比較）為1.000±0.090，IL-7中和抗體（5μg/mL）處理KYSE30細(xì)胞組相對(duì)侵襲率（與對(duì)照組比較）為0.433±0.040，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。IL-7中和抗體（10μg/mL）處理KYSE30細(xì)胞組相對(duì)侵襲率（與對(duì)照組比較）為0.210±0.037，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，圖4A）。遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組KYSE410細(xì)胞相對(duì)遷移率（與本組比較）為1.000±0.162，IL-7中和抗體（5μg/mL）處理KYSE410細(xì)胞組相對(duì)遷移率（與對(duì)照組比較）為0.450±0.080，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。IL-7中和抗體（10μg/mL）處理KYSE410細(xì)胞組相對(duì)遷移率（與對(duì)照組比較）為0.163±0.028，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。對(duì)照組KYSE30細(xì)胞相對(duì)遷移率（與本組比較）為1.000±0.100，IL-7中和抗體（5μg/mL）處理KYSE30細(xì)胞組相對(duì)遷移率（與對(duì)照組比較）為0.272±0.063，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。IL-7中和抗體（10μg/mL）處理KYSE30細(xì)胞組相對(duì)遷移率（與對(duì)照組比較）為0.160±0.049，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，圖4B）。2.5IL-7中和抗體抑制缺氧狀態(tài)下ESCC細(xì)胞中信號(hào)分子AKT的活性本研究通過(guò)ELISA法分析缺氧對(duì)ESCC細(xì)胞系中AKT活性的影響，結(jié)果顯示，缺氧24h后，ESCC細(xì)胞系KYSE410及KYSE30中AKTSer473活性顯著上調(diào)（圖5A）。對(duì)照組KYSE410細(xì)胞AKT活性為0.454±0.019，實(shí)驗(yàn)組KYSE410細(xì)胞AKT活性為0.744±0.047，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），對(duì)照組KYSE30細(xì)胞AKT活性為0.462±0.037，實(shí)驗(yàn)組KYSE30細(xì)胞AKT活性為0.809±0.064，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，圖5A）。外加IL-7中和抗體能夠有效地抑制KYSE410及KYSE30細(xì)胞中AKTSer473的磷酸化激活（圖5B）。對(duì)照組KYSE410細(xì)胞AKT活性為0.756±0.058，IL-7中和抗體（5μg/mL）處理KYSE410細(xì)胞組AKT活性為0.441±0.038，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。IL-7中和抗體（10μg/mL）處理KYSE410細(xì)胞組AKT活性為0.214±0.028，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。對(duì)照組KYSE30細(xì)胞AKT活性為0.815±0.082，IL-7中和抗體（5μg/mL）處理KYSE30細(xì)胞組AKT活性為0.472±0.04，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。IL-7中和抗體（10μg/mL）處理KYSE30細(xì)胞組AKT活性為0.234±0.029，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，圖5B）。圖4IL-7中和抗體抑制缺氧狀態(tài)下KYSE410及KYSE30細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移Fig.4IL-7antibodyinhibitedinvasionormigrationofKYSE410andKYSE30cellsunderhypoxiaInvasion(A)ormigration(B)assaywasusedtoevaluatetheinvasiveabilitiesofKYSE410andKYSE30cellstreatedwithPBS(controlsolvent),orIL-7antibody(5,10μg/mL),underhypoxiafor24h.***:P<0.001,comparedwithcontrolgroup圖5IL-7中和抗體抑制缺氧狀態(tài)下KYSE410及KYSE30細(xì)胞中AKT活性Fig.5IL-7antibodyinhibitedtheAKTactivityofKYSE410andKYSE30cellsunderhypoxiaA:QuantitativeELISAassaywasusedtoevaluatetheDvalueofpAKTSer473/theDvalueoftotalAKT(AKTactivity)inKYSE410andKYSE30cellsundernormoxicorhypoxicconditionfor24h.B:QuantitativeELISAassaywasappliedtoexaminetheAKTactivityinKYSE410andKYSE30cellstreatedwithPBS(controlsolvent),orIL-7antibody(5,10μg/mL),underhypoxiafor24h.**:P<0.001,comparedwithnormoxia;***:P<0.001,comparedwithcontrolgroup3、討論本研究顯示，缺氧可誘導(dǎo)ESCC細(xì)胞中多種細(xì)胞因子及趨化因子的自分泌表達(dá)，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-10、MCP2及CCL5等。其中，TNF-α、IL-1β及IL-10是慢性炎癥與腫瘤關(guān)聯(lián)的重要細(xì)胞因子，這些因子的多態(tài)性與腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切［10］。IL-6能夠通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞可塑性、介導(dǎo)化療耐藥，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。腫瘤微環(huán)境釋放的CCL5，能夠通過(guò)作用于腫瘤細(xì)胞中相應(yīng)受體CCR5，介導(dǎo)腫瘤的多種惡性表型［11］。因此，細(xì)胞因子的活性增強(qiáng)是調(diào)控腫瘤進(jìn)展的重要因素之一。本研究重點(diǎn)闡明了IL-7作為缺氧誘導(dǎo)細(xì)胞因子，介導(dǎo)ESCC進(jìn)展及相關(guān)分子機(jī)制。IL-7能夠產(chǎn)生廣泛免疫效應(yīng)，在免疫細(xì)胞活化過(guò)程、產(chǎn)生免疫應(yīng)答效應(yīng)、調(diào)控自身免疫性疾病及抗纖維化中具有重要作用，是細(xì)胞因子研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)因子。在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，IL-7與腫瘤關(guān)系復(fù)雜。其中，IL-7參與多種免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)增殖的調(diào)控。在嵌合抗原受體T（chimeri