基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素聯(lián)合多柔比星治療肝細(xì)胞肝癌的協(xié)同效應(yīng)與機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義肝細(xì)胞肝癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）作為原發(fā)性肝癌中最常見的類型，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，肝癌的全球新發(fā)病例數(shù)為90.6萬，死亡病例數(shù)高達(dá)83萬，在癌癥相關(guān)死亡原因中位居第三。在中國(guó)，肝癌的發(fā)病率和死亡率也一直居高不下，由于起病隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了手術(shù)根治的機(jī)會(huì)。目前，肝細(xì)胞肝癌的治療方法主要包括手術(shù)切除、肝移植、介入治療、放療、化療以及靶向治療和免疫治療等。手術(shù)切除是早期肝癌的首選治療方法，但由于肝癌患者大多合并有肝硬化等基礎(chǔ)疾病，且腫瘤位置、大小等因素的限制，僅有少數(shù)患者能夠滿足手術(shù)條件。肝移植雖然可以徹底清除腫瘤，但供體短缺、術(shù)后免疫排斥反應(yīng)等問題制約了其廣泛應(yīng)用。介入治療如經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞（TACE）對(duì)于無法手術(shù)切除的中晚期肝癌患者是一種常用的治療手段，但單獨(dú)使用TACE治療后腫瘤的復(fù)發(fā)率較高?；熕幬锶缍嗳岜刃牵―oxorubicin，DOX），通過嵌入DNA雙鏈，抑制DNA和RNA的合成，從而發(fā)揮抗腫瘤作用，然而其毒副作用較強(qiáng)，如心臟毒性、骨髓抑制、脫發(fā)等，限制了臨床應(yīng)用劑量和治療效果。放療在肝癌治療中的應(yīng)用也受到肝臟對(duì)放射線耐受性的限制。近年來，靶向治療和免疫治療為肝癌患者帶來了新的希望，但部分患者對(duì)這些治療方法的響應(yīng)率較低，且存在耐藥性問題。內(nèi)皮抑素（Endostatin）是一種內(nèi)源性的血管生成抑制劑，由膠原蛋白ⅩⅧ的C末端裂解產(chǎn)生，能夠特異性地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而抑制腫瘤血管生成。腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，內(nèi)皮抑素通過切斷腫瘤的血液供應(yīng)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。多項(xiàng)研究表明，內(nèi)皮抑素在多種腫瘤模型中顯示出良好的抗腫瘤效果，且副作用較小。將內(nèi)皮抑素基因通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞或機(jī)體，使其持續(xù)表達(dá)內(nèi)皮抑素，有望實(shí)現(xiàn)更持久、有效的抗腫瘤作用?；蜣D(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星治療肝細(xì)胞肝癌的研究具有創(chuàng)新性。傳統(tǒng)的肝癌治療方法大多是單一手段，難以兼顧腫瘤細(xì)胞的殺傷和腫瘤血管生成的抑制。而這種聯(lián)合治療策略將基因治療和化療相結(jié)合，一方面利用基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，使腫瘤細(xì)胞處于缺血缺氧狀態(tài)，降低其對(duì)化療藥物的抵抗能力；另一方面，多柔比星直接作用于腫瘤細(xì)胞，抑制其增殖和誘導(dǎo)凋亡，兩者協(xié)同作用，有望提高治療效果，降低多柔比星的使用劑量，從而減少其毒副作用。本研究對(duì)于肝細(xì)胞肝癌的治療具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。若該聯(lián)合治療方法在實(shí)驗(yàn)中取得良好效果，將為肝癌的臨床治療提供新的治療方案和思路。不僅可以改善肝癌患者的治療效果，提高患者的生存率和生活質(zhì)量，還可能推動(dòng)基因治療與化療聯(lián)合應(yīng)用在其他腫瘤治療領(lǐng)域的發(fā)展，為攻克癌癥這一醫(yī)學(xué)難題做出貢獻(xiàn)。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素治療肝癌方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者開展了大量研究。國(guó)內(nèi)有研究將以pcDNA3.1為載體的鼠源性endostatin基因轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞SMMC7721建立裸鼠肝癌模型，通過免疫組化和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，endostatin能在肝癌細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)和分泌，且腫瘤血管密度（MVD）顯著低于對(duì)照組，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）陽(yáng)性率與對(duì)照組比較差異亦有顯著性，表明endostatin基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞SMMC7721在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，不過雖能減慢腫瘤生長(zhǎng)速度，但無法完全消除腫瘤。東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院的研究人員構(gòu)建表達(dá)ES基因的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染小鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs），發(fā)現(xiàn)負(fù)載ES基因的EPCs體外可以抑制小鼠肝癌細(xì)胞H22的增殖，體內(nèi)可以抑制小鼠肝癌生長(zhǎng)，為聯(lián)合自體EPCs和ES基因治療肝癌提供了新的思路。國(guó)外也有相關(guān)研究關(guān)注基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素在肝癌治療中的應(yīng)用，通過不同的基因載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，探索其在動(dòng)物模型和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的抗腫瘤效果。部分研究聚焦于優(yōu)化基因轉(zhuǎn)染的效率和內(nèi)皮抑素的表達(dá)水平，以提高對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和血管生成的抑制作用。多柔比星作為一種傳統(tǒng)的化療藥物，在肝癌治療中的研究也較為廣泛。國(guó)內(nèi)有臨床研究對(duì)比了鹽酸多柔比星脂質(zhì)體與氟尿嘧啶治療晚期肝細(xì)胞癌的效果，發(fā)現(xiàn)鹽酸多柔比星脂質(zhì)體治療組的客觀有效率更高，治療后患者的胸苷激酶（TK）、甲胎蛋白（AFP）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）水平顯著低于氟尿嘧啶治療組，且不良反應(yīng)發(fā)生率更低，顯示出鹽酸多柔比星脂質(zhì)體在晚期肝細(xì)胞癌治療中的優(yōu)勢(shì)。國(guó)外研究則不斷探索多柔比星的新劑型和給藥方式，如多柔比星洗脫微球的TACE（DEB-TACE）聯(lián)合索拉非尼治療肝癌的Ⅱ期臨床研究，結(jié)果顯示疾病控制率達(dá)到98%，出現(xiàn)中位無法治療的腫瘤進(jìn)展（TTUP）時(shí)間為11.9個(gè)月，為多柔比星在肝癌聯(lián)合治療中的應(yīng)用提供了新的方案。在基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星治療肝細(xì)胞肝癌方面，目前相關(guān)研究相對(duì)較少。已有的研究初步表明，兩者聯(lián)合應(yīng)用可能具有協(xié)同增效作用，既能通過內(nèi)皮抑素抑制腫瘤血管生成，又能利用多柔比星直接殺傷腫瘤細(xì)胞，從而提高治療效果，降低多柔比星的使用劑量及毒副作用。然而，對(duì)于聯(lián)合治療的具體作用機(jī)制，如內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染后如何影響腫瘤細(xì)胞對(duì)多柔比星的敏感性，兩者聯(lián)合對(duì)腫瘤微環(huán)境中其他細(xì)胞和因子的影響等，仍缺乏深入系統(tǒng)的研究。而且在臨床轉(zhuǎn)化方面，如何選擇合適的基因載體、優(yōu)化轉(zhuǎn)染方法以及確定聯(lián)合治療的最佳劑量和療程等問題，也有待進(jìn)一步探索和解決。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星治療肝細(xì)胞肝癌的效果、作用機(jī)制，并優(yōu)化治療方案，為肝細(xì)胞肝癌的臨床治療提供更有效的策略和理論依據(jù)。圍繞這一目標(biāo)，開展以下具體研究?jī)?nèi)容：構(gòu)建基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素的肝癌細(xì)胞模型：選擇合適的肝癌細(xì)胞系，如常用的HepG2、SMMC-7721等細(xì)胞。獲取內(nèi)皮抑素基因，可通過基因合成或從相關(guān)生物樣本中提取。將內(nèi)皮抑素基因克隆至合適的載體，如質(zhì)粒載體或病毒載體（慢病毒載體、腺病毒載體等）。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法或病毒感染法等技術(shù)，將攜帶內(nèi)皮抑素基因的載體導(dǎo)入肝癌細(xì)胞中。通過篩選和鑒定，獲得穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)皮抑素的肝癌細(xì)胞模型。利用PCR、Westernblot等技術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮抑素基因的表達(dá)水平和蛋白表達(dá)情況。評(píng)估不同處理組對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響：設(shè)置空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體的肝癌細(xì)胞組）、內(nèi)皮抑素處理組、多柔比星處理組以及基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星處理組。采用MTT法、CCK-8法等檢測(cè)不同處理組肝癌細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的增殖情況，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，比較各組細(xì)胞的增殖能力差異。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理組肝癌細(xì)胞的凋亡率，分析細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)，如凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)變化，探究不同處理對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)，檢測(cè)肝癌細(xì)胞周期相關(guān)基因（如CyclinD1、p21等）和凋亡相關(guān)基因（如Caspase-3、Caspase-9等）的mRNA和蛋白表達(dá)水平，深入研究不同處理對(duì)肝癌細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。研究體內(nèi)模型中不同處理對(duì)肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響：建立裸鼠肝癌移植瘤模型，將不同處理組的肝癌細(xì)胞分別接種到裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。定期測(cè)量腫瘤的體積和重量，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，比較不同處理組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果。通過活體成像技術(shù)、組織病理學(xué)檢查等方法，觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，包括肺轉(zhuǎn)移、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移等，分析不同處理對(duì)肝癌轉(zhuǎn)移的影響。檢測(cè)小鼠體內(nèi)肝癌相關(guān)指標(biāo)，如血清中甲胎蛋白（AFP）水平、腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)、腫瘤微血管密度（MVD）等，探討不同處理對(duì)肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。二、基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素與多柔比星治療肝癌的理論基礎(chǔ)2.1肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病機(jī)制與特點(diǎn)肝細(xì)胞肝癌的發(fā)病是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，涉及多種基因和信號(hào)通路的異常改變。從分子機(jī)制層面來看，常見的遺傳改變包括端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）啟動(dòng)子區(qū)突變，約60%的HCC患者存在此突變，該突變可激活TERT，維持端粒長(zhǎng)度，使癌細(xì)胞能夠持續(xù)增殖。抑癌基因TP53的突變也較為常見，其突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控異常，無法有效抑制癌細(xì)胞的增殖和存活。此外，WNT/β-catenin信號(hào)通路的異常激活在肝癌發(fā)生中起重要作用，CTNNB1和AXIN1等基因的突變可導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。表觀遺傳改變?cè)诟渭?xì)胞肝癌的發(fā)病中也至關(guān)重要。DNA甲基化模式的改變可導(dǎo)致抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化，使其表達(dá)沉默，如SOCS1、HHIP等基因。組蛋白修飾如甲基化、乙酰化等也參與調(diào)控基因表達(dá)，影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。非編碼RNA，如微小RNA（miRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA），在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。例如，miR-122在正常肝臟中高表達(dá)，可通過抑制靶基因的表達(dá)來調(diào)控膽固醇代謝等過程，而在肝癌中其表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致相關(guān)靶基因表達(dá)異常，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移；某些lncRNA可作為分子海綿吸附miRNA，解除miRNA對(duì)靶基因的抑制作用，從而影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)功能。在細(xì)胞層面，肝細(xì)胞的死亡和代償性再生是肝癌發(fā)生的重要基礎(chǔ)。在肝硬化、慢性肝炎等肝臟疾病狀態(tài)下，肝細(xì)胞持續(xù)受損死亡，機(jī)體啟動(dòng)代償性再生機(jī)制，再生肝細(xì)胞在增殖過程中更容易發(fā)生遺傳和表觀遺傳改變，增加了癌變的風(fēng)險(xiǎn)。肝干細(xì)胞和轉(zhuǎn)運(yùn)擴(kuò)增細(xì)胞群也可能參與肝腫瘤的發(fā)生，這些細(xì)胞具有自我更新和分化的能力，在某些致癌因素的作用下，可能分化為癌細(xì)胞或?yàn)榘┘?xì)胞的產(chǎn)生提供微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等成分也與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。免疫細(xì)胞如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等可抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件；間質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子可促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成；細(xì)胞外基質(zhì)的重塑可改變癌細(xì)胞的力學(xué)微環(huán)境，影響其生物學(xué)行為。肝細(xì)胞肝癌具有惡性程度高的特點(diǎn)，癌細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，容易侵犯周圍組織和血管，導(dǎo)致肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約40%-70%的肝癌患者在初診時(shí)已發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，常見的轉(zhuǎn)移部位包括門靜脈分支、肝內(nèi)膽管等。此外，肝癌還可通過血行轉(zhuǎn)移至肺、骨、腦等器官，其中肺轉(zhuǎn)移最為常見，約占肝癌轉(zhuǎn)移患者的50%-70%。肝細(xì)胞肝癌的預(yù)后通常較差，5年生存率較低。巴塞羅那臨床肝癌分期（BCLC）系統(tǒng)是目前廣泛應(yīng)用的肝癌分期系統(tǒng)，不同分期的肝癌患者預(yù)后差異顯著。早期肝癌患者（BCLC0-A期）通過手術(shù)切除、肝移植等根治性治療方法，5年生存率可達(dá)30%-70%；然而，大多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期（BCLCB-D期），失去了根治性治療的機(jī)會(huì)，5年生存率僅為5%-30%。肝癌預(yù)后差的原因主要包括早期診斷困難，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期；腫瘤易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；對(duì)傳統(tǒng)化療和放療不敏感等。此外，患者的肝功能狀況、合并癥等因素也會(huì)影響預(yù)后，如合并肝硬化的肝癌患者，由于肝臟儲(chǔ)備功能差，手術(shù)耐受性低，術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率高，進(jìn)一步降低了患者的生存率。2.2內(nèi)皮抑素的作用機(jī)制與基因轉(zhuǎn)染技術(shù)內(nèi)皮抑素作為一種內(nèi)源性的血管生成抑制劑，其抑制腫瘤血管生成和細(xì)胞增殖的機(jī)制較為復(fù)雜。在抑制腫瘤血管生成方面，內(nèi)皮抑素能夠特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞。它可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的多種受體相互作用，如整合素α5β1、αvβ3等。通過與這些受體結(jié)合，內(nèi)皮抑素阻斷了血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移所依賴的信號(hào)傳導(dǎo)通路，如FAK/PI3K/Akt信號(hào)通路。該信號(hào)通路在正常生理狀態(tài)下，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖和遷移，以滿足組織生長(zhǎng)和修復(fù)對(duì)新生血管的需求。當(dāng)內(nèi)皮抑素與受體結(jié)合后，抑制了FAK的磷酸化，進(jìn)而阻斷了PI3K/Akt信號(hào)的傳遞，使血管內(nèi)皮細(xì)胞無法接收促進(jìn)增殖和遷移的信號(hào)，從而抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力，減少了腫瘤新生血管的形成。內(nèi)皮抑素還可以調(diào)節(jié)多種與血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子和信號(hào)通路。例如，它能夠抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）與其受體的結(jié)合，從而阻斷VEGF介導(dǎo)的血管生成信號(hào)傳導(dǎo)。VEGF是一種重要的促血管生成因子，在腫瘤生長(zhǎng)過程中，腫瘤細(xì)胞會(huì)大量分泌VEGF，與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGFR結(jié)合，激活下游的Ras/Raf/MEK/ERK等信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活。內(nèi)皮抑素通過抑制VEGF信號(hào)通路，減少了腫瘤血管生成的刺激因素，進(jìn)一步抑制了腫瘤血管的生成。此外，內(nèi)皮抑素還可以下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，MMPs在腫瘤血管生成過程中參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和新生血管的形成創(chuàng)造條件，內(nèi)皮抑素對(duì)MMPs的抑制作用，也有助于抑制腫瘤血管生成。在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面，內(nèi)皮抑素可以通過多種途徑發(fā)揮作用。一方面，內(nèi)皮抑素可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯，使腫瘤細(xì)胞停滯在G1期。研究表明，內(nèi)皮抑素處理后的腫瘤細(xì)胞，其細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1的表達(dá)下調(diào)，而p21的表達(dá)上調(diào)。CyclinD1是細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)下調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程受阻；p21是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，它可以與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，從而使細(xì)胞周期停滯在G1期。另一方面，內(nèi)皮抑素還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。它能夠激活Caspase家族蛋白，如Caspase-3、Caspase-9等。Caspase-9是凋亡的起始蛋白酶，在內(nèi)皮抑素的作用下被激活，進(jìn)而激活下游的效應(yīng)蛋白酶Caspase-3。Caspase-3被激活后，會(huì)切割一系列細(xì)胞內(nèi)的底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，內(nèi)皮抑素還可以調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，使促凋亡蛋白Bax的表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)降低，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡?；蜣D(zhuǎn)染技術(shù)是將內(nèi)皮抑素基因?qū)爰?xì)胞的關(guān)鍵手段，其原理是利用物理、化學(xué)或生物學(xué)方法，將攜帶內(nèi)皮抑素基因的載體導(dǎo)入靶細(xì)胞，使內(nèi)皮抑素基因能夠整合到細(xì)胞基因組中或在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。常見的基因轉(zhuǎn)染方法包括非病毒轉(zhuǎn)染法和病毒轉(zhuǎn)染法。非病毒轉(zhuǎn)染法中，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法較為常用。脂質(zhì)體是一種人工合成的磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)，它可以與DNA形成復(fù)合物。其原理是脂質(zhì)體表面的陽(yáng)離子基團(tuán)與帶負(fù)電荷的DNA通過靜電作用相互結(jié)合，形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物。這種復(fù)合物可以與細(xì)胞膜發(fā)生融合或被細(xì)胞內(nèi)吞，從而將DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，對(duì)細(xì)胞毒性較小，但轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低，且導(dǎo)入的基因通常為瞬時(shí)表達(dá)，難以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。電穿孔法也是一種非病毒轉(zhuǎn)染方法，其原理是利用高壓電脈沖在細(xì)胞膜上形成瞬間的小孔，使DNA能夠通過這些小孔進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在電穿孔過程中，合適的電場(chǎng)強(qiáng)度、脈沖持續(xù)時(shí)間和脈沖次數(shù)等參數(shù)非常關(guān)鍵，這些參數(shù)會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性和細(xì)胞的存活率。電穿孔法適用于多種細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較高，但對(duì)細(xì)胞的損傷較大，可能會(huì)影響細(xì)胞的正常生理功能。病毒轉(zhuǎn)染法中，慢病毒載體和腺病毒載體是常用的基因載體。慢病毒載體屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，它可以將攜帶的內(nèi)皮抑素基因整合到靶細(xì)胞的基因組中，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)。慢病毒載體具有感染宿主范圍廣、可以感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞、基因表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。其轉(zhuǎn)染過程是通過慢病毒表面的包膜蛋白與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，然后病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并整合到細(xì)胞基因組中。腺病毒載體則是利用腺病毒的感染特性，將內(nèi)皮抑素基因?qū)爰?xì)胞。腺病毒載體具有高滴度、易于制備、不整合到宿主基因組等優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。它通過與細(xì)胞表面的腺病毒受體結(jié)合，經(jīng)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，然后在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)內(nèi)皮抑素基因。然而，腺病毒載體可能會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，限制了其在體內(nèi)的應(yīng)用。2.3多柔比星的抗癌作用機(jī)制多柔比星作為一種經(jīng)典的蒽環(huán)類抗癌藥物，具有獨(dú)特的抗癌作用機(jī)制，主要通過干擾癌細(xì)胞的DNA復(fù)制和蛋白質(zhì)合成來抑制其生長(zhǎng)和分裂。多柔比星的化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有蒽醌環(huán)，這一結(jié)構(gòu)使其能夠與癌細(xì)胞的DNA分子發(fā)生特異性結(jié)合。在癌細(xì)胞的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，多柔比星分子通過嵌入DNA雙鏈的堿基對(duì)之間，特別是與鳥嘌呤堿基的氨基和羥基形成氫鍵，從而穩(wěn)定地結(jié)合在DNA分子上。這種結(jié)合方式會(huì)導(dǎo)致DNA分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變，使得DNA聚合酶難以沿著DNA鏈移動(dòng)，從而阻礙了DNA鏈的正常伸長(zhǎng)和復(fù)制過程。DNA復(fù)制是細(xì)胞分裂的關(guān)鍵步驟，多柔比星對(duì)DNA復(fù)制的抑制作用，直接阻止了癌細(xì)胞的分裂和增殖。蛋白質(zhì)合成是細(xì)胞生長(zhǎng)和維持正常生理功能的重要過程，在癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移過程中也起著不可或缺的作用。多柔比星可以與細(xì)胞內(nèi)的核糖體結(jié)合，核糖體是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵細(xì)胞器。多柔比星與核糖體的結(jié)合會(huì)干擾mRNA與核糖體的結(jié)合過程，以及tRNA攜帶氨基酸進(jìn)入核糖體的過程。這些干擾作用使得蛋白質(zhì)合成所需的信息傳遞和氨基酸組裝過程受阻，從而無法正常合成蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)各種生理活動(dòng)的執(zhí)行者，蛋白質(zhì)合成的抑制導(dǎo)致癌細(xì)胞無法正常進(jìn)行基因表達(dá)，缺乏必要的蛋白質(zhì)來維持其生長(zhǎng)和形成新細(xì)胞，進(jìn)而抑制了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂。除了上述直接作用于DNA和蛋白質(zhì)合成的機(jī)制外，多柔比星還能抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性。拓?fù)洚悩?gòu)酶II在DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，它能夠通過切斷和重新連接DNA鏈，來改變DNA的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，以滿足DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的需要。多柔比星能夠與拓?fù)洚悩?gòu)酶II緊密結(jié)合，抑制其活性。當(dāng)拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性被抑制后，DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的拓?fù)鋺?yīng)力無法得到有效緩解，導(dǎo)致DNA鏈的切斷和損傷。這種DNA損傷會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。在多柔比星的代謝過程中，會(huì)產(chǎn)生氧自由基。氧自由基是一類具有高度活性的分子，它們能夠與DNA和其他細(xì)胞成分發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致氧化損傷。多柔比星產(chǎn)生的氧自由基會(huì)攻擊DNA分子，使其發(fā)生堿基氧化、鏈斷裂等損傷，進(jìn)一步破壞癌細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，增強(qiáng)多柔比星的抗腫瘤效果。氧自由基還會(huì)攻擊細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)和成分，導(dǎo)致細(xì)胞的功能受損，促進(jìn)癌細(xì)胞的死亡。2.4協(xié)同治療的理論依據(jù)基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星治療肝細(xì)胞肝癌的理論依據(jù)主要基于兩者在抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移方面的不同作用機(jī)制以及協(xié)同增效的潛力。從抑制腫瘤血管生成的角度來看，內(nèi)皮抑素是一種內(nèi)源性的血管生成抑制劑，它通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的特定受體結(jié)合，阻斷相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活。在腫瘤生長(zhǎng)過程中，新生血管的形成對(duì)于腫瘤細(xì)胞獲取營(yíng)養(yǎng)和氧氣至關(guān)重要。內(nèi)皮抑素能夠特異性地作用于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，減少腫瘤新生血管的生成，使腫瘤組織處于缺血缺氧狀態(tài)。研究表明，內(nèi)皮抑素可以下調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）及其受體的表達(dá)，抑制VEGF介導(dǎo)的血管生成信號(hào)傳導(dǎo)，還能抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，進(jìn)一步阻礙血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和新生血管的形成。多柔比星雖然主要作用于腫瘤細(xì)胞本身，但其在抑制腫瘤細(xì)胞增殖的過程中，也會(huì)對(duì)腫瘤血管生成產(chǎn)生間接影響。當(dāng)多柔比星抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂時(shí)，腫瘤細(xì)胞分泌的促血管生成因子如VEGF等會(huì)相應(yīng)減少。這是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞在增殖活躍時(shí)，為了滿足自身對(duì)營(yíng)養(yǎng)和氧氣的需求，會(huì)大量分泌VEGF等促血管生成因子來誘導(dǎo)新生血管的形成。多柔比星抑制腫瘤細(xì)胞增殖后，腫瘤細(xì)胞的代謝活動(dòng)降低，對(duì)營(yíng)養(yǎng)和氧氣的需求減少，從而減少了促血管生成因子的分泌，間接抑制了腫瘤血管生成。基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星，能夠從直接和間接兩個(gè)方面抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，從而更有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。在誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡方面，內(nèi)皮抑素和多柔比星也具有協(xié)同作用。內(nèi)皮抑素可以通過激活Caspase家族蛋白，如Caspase-3、Caspase-9等，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性途徑。它還能調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，使促凋亡蛋白Bax的表達(dá)升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)降低，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。多柔比星則主要通過干擾癌細(xì)胞的DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性，導(dǎo)致DNA鏈的損傷和斷裂，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。當(dāng)兩者聯(lián)合使用時(shí)，內(nèi)皮抑素可以增強(qiáng)多柔比星對(duì)癌細(xì)胞DNA的損傷作用。內(nèi)皮抑素抑制腫瘤血管生成后，腫瘤細(xì)胞處于缺血缺氧狀態(tài)，其對(duì)化療藥物的敏感性增加。此時(shí)，多柔比星更容易進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，與DNA結(jié)合，發(fā)揮更強(qiáng)的殺傷作用。多柔比星造成的DNA損傷也會(huì)進(jìn)一步激活內(nèi)皮抑素誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路，使更多的癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來增強(qiáng)多柔比星的療效。腫瘤微環(huán)境中存在多種細(xì)胞和細(xì)胞因子，它們相互作用，影響著腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。內(nèi)皮抑素可以調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）等免疫細(xì)胞的功能，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。TAM在腫瘤微環(huán)境中通常表現(xiàn)出促腫瘤的功能，分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和血管生成。內(nèi)皮抑素可以使TAM向抗腫瘤的M1型極化，增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。Treg細(xì)胞則具有免疫抑制功能，抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。內(nèi)皮抑素可以減少Treg細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的浸潤(rùn)，解除其對(duì)免疫細(xì)胞的抑制作用。在這種被內(nèi)皮抑素調(diào)節(jié)后的腫瘤微環(huán)境中，多柔比星能夠更好地發(fā)揮作用，與增強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)協(xié)同，共同抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料肝癌細(xì)胞系：選用人肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721，這兩種細(xì)胞系在肝癌研究中應(yīng)用廣泛，具有典型的肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性，可用于研究肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等行為。HepG2細(xì)胞來源于人肝癌組織，具有較高的增殖活性和侵襲能力；SMMC-7721細(xì)胞同樣具有肝癌細(xì)胞的惡性特征，對(duì)不同的治療干預(yù)有明確的反應(yīng)，方便后續(xù)實(shí)驗(yàn)觀察和分析。內(nèi)皮抑素基因：通過基因合成的方法獲取人源內(nèi)皮抑素基因，其序列經(jīng)過精確設(shè)計(jì)和驗(yàn)證，確保能夠準(zhǔn)確表達(dá)具有活性的內(nèi)皮抑素蛋白。合成的內(nèi)皮抑素基因兩端含有特定的酶切位點(diǎn)，便于后續(xù)克隆至載體中。多柔比星：購(gòu)買純度≥98%的多柔比星原料藥，為橙紅色結(jié)晶性粉末，可溶于水和甲醇等有機(jī)溶劑。使用時(shí)，將多柔比星用無菌生理鹽水配制成所需濃度的溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配，以保證藥物的穩(wěn)定性和活性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用4-6周齡的BALB/c裸鼠，體重18-22g，購(gòu)自正規(guī)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。裸鼠免疫功能缺陷，對(duì)人源腫瘤細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)低，能夠較好地接受人肝癌細(xì)胞的移植，用于建立裸鼠肝癌移植瘤模型，以研究不同處理組在體內(nèi)對(duì)肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)，將裸鼠飼養(yǎng)于無菌環(huán)境中，溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度為40%-60%，給予充足的無菌食物和水。相關(guān)試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，適合肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖；胎牛血清（FBS），為細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需的多種生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，用于消化貼壁生長(zhǎng)的肝癌細(xì)胞，便于細(xì)胞傳代和實(shí)驗(yàn)操作；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，如Lipofectamine3000，能夠?qū)y帶內(nèi)皮抑素基因的載體高效導(dǎo)入肝癌細(xì)胞；質(zhì)粒提取試劑盒，用于從大腸桿菌中提取高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA；Trizol試劑，用于提取細(xì)胞中的總RNA，以便后續(xù)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于PCR擴(kuò)增；BCA蛋白定量試劑盒，用于測(cè)定細(xì)胞裂解液中的蛋白濃度，以便進(jìn)行Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；CCK-8試劑，用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性；免疫組化試劑盒，用于檢測(cè)腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)和定位。儀器設(shè)備：CO?培養(yǎng)箱，提供穩(wěn)定的37℃、5%CO?培養(yǎng)環(huán)境，滿足肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)需求；超凈工作臺(tái)，提供無菌操作環(huán)境，防止細(xì)胞污染；倒置顯微鏡，用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；離心機(jī)，包括低速離心機(jī)和高速離心機(jī)，用于細(xì)胞離心、蛋白沉淀等操作；PCR儀，進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，精確檢測(cè)基因表達(dá)水平；凝膠成像系統(tǒng)，用于觀察和分析PCR產(chǎn)物和蛋白電泳結(jié)果；流式細(xì)胞儀，檢測(cè)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等；酶標(biāo)儀，用于讀取CCK-8檢測(cè)結(jié)果；石蠟切片機(jī)，制作腫瘤組織石蠟切片，用于組織病理學(xué)檢查和免疫組化分析；熒光顯微鏡，觀察熒光標(biāo)記的細(xì)胞和組織。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素的肝癌細(xì)胞模型構(gòu)建首先進(jìn)行內(nèi)皮抑素基因與載體的連接。將合成的內(nèi)皮抑素基因和質(zhì)粒載體（如pEGFP-N1質(zhì)粒，該質(zhì)粒帶有綠色熒光蛋白基因，便于后續(xù)觀察轉(zhuǎn)染效果）分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：質(zhì)粒DNA或內(nèi)皮抑素基因2μg，10×Buffer5μL，BamHⅠ和HindⅢ各1μL（10U/μL），加ddH?O至50μL。37℃水浴酶切3-4h后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠回收試劑盒回收酶切后的目的片段（內(nèi)皮抑素基因片段和線性化的質(zhì)粒載體片段）。將回收的內(nèi)皮抑素基因片段與線性化的質(zhì)粒載體按3:1的摩爾比混合，加入T4DNA連接酶1μL（350U/μL），10×T4DNALigaseBuffer2μL，加ddH?O至20μL，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α。將連接產(chǎn)物加入到100μLDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90s，迅速置于冰浴中2-3min。加入800μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h（180r/min）。取200μL菌液均勻涂布于含氨芐青霉素（100μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h。挑取平板上的單菌落，接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜（200r/min）。使用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，通過雙酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確性。雙酶切鑒定體系同上述酶切體系，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察是否出現(xiàn)目的條帶；測(cè)序由專業(yè)測(cè)序公司完成，將測(cè)序結(jié)果與內(nèi)皮抑素基因序列進(jìn)行比對(duì)，確?；虿迦胝_且無突變。將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721中。轉(zhuǎn)染前1天，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞以2×10?個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到70%-80%的融合度。轉(zhuǎn)染時(shí)，按照Lipofectamine3000試劑說明書進(jìn)行操作。將10μLLipofectamine3000試劑加入到250μLOpti-MEM培養(yǎng)基中，輕輕混勻，室溫孵育5min。同時(shí)，將5μg重組質(zhì)粒加入到另250μLOpti-MEM培養(yǎng)基中，混勻。將孵育后的Lipofectamine3000試劑與質(zhì)粒-Opti-MEM混合液輕輕混合，室溫孵育20min，形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗細(xì)胞2次，每孔加入1.5mL無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，再將脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物逐滴加入孔中，輕輕搖勻。將6孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6h后，更換為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48h后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)，提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot檢測(cè)內(nèi)皮抑素基因和蛋白的表達(dá)水平。3.2.2分組與處理空白對(duì)照組：加入等體積的無血清培養(yǎng)基，不進(jìn)行任何藥物和基因轉(zhuǎn)染處理，作為基礎(chǔ)對(duì)照，用于觀察肝癌細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)、增殖、凋亡等生物學(xué)行為。陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染空載體（如pEGFP-N1空質(zhì)粒），轉(zhuǎn)染方法同基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素組?？蛰d體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，除了不表達(dá)內(nèi)皮抑素基因外，其他條件與基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素組相同，用于排除載體本身及轉(zhuǎn)染操作對(duì)細(xì)胞的影響。內(nèi)皮抑素組：使用成功轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素基因的肝癌細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染48h后，更換為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，觀察內(nèi)皮抑素基因表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞的作用。多柔比星組：對(duì)未轉(zhuǎn)染基因的肝癌細(xì)胞，加入終濃度為10μmol/L的多柔比星溶液（用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋多柔比星母液配制而成）。多柔比星作用時(shí)間分別設(shè)置為24h、48h和72h，用于研究多柔比星單獨(dú)作用時(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡等的影響。聯(lián)合治療組：先對(duì)肝癌細(xì)胞進(jìn)行內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染，48h后更換為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后加入終濃度為10μmol/L的多柔比星溶液，多柔比星作用時(shí)間同樣分別設(shè)置為24h、48h和72h。此組用于探究基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星對(duì)肝癌細(xì)胞的聯(lián)合治療效果。在各處理組培養(yǎng)過程中，定期在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，如細(xì)胞的貼壁情況、形態(tài)是否改變、有無細(xì)胞死亡等。3.2.3細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)與方法細(xì)胞增殖檢測(cè)：采用MTT法檢測(cè)不同處理組肝癌細(xì)胞的增殖能力。在96孔板中，每孔接種5×103個(gè)肝癌細(xì)胞，按照上述分組與處理方法進(jìn)行干預(yù)。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h和96h時(shí)，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸出上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，比較不同處理組細(xì)胞的增殖速率。細(xì)胞凋亡和周期分析：運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和周期。收集不同處理組的肝癌細(xì)胞，用PBS清洗2次，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5min，棄上清。加入1mL預(yù)冷的70%乙醇，輕輕混勻，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞1000r/min離心5min，棄乙醇，用PBS清洗2次。加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PI）和100μg/mLRNaseA的染色緩沖液，37℃避光孵育30min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，分析G1期、S期和G2/M期細(xì)胞的比例。對(duì)于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，收集細(xì)胞后用PBS清洗2次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，根據(jù)AnnexinV-FITC和PI的雙染結(jié)果，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），計(jì)算細(xì)胞凋亡率。凋亡相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)：利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平。提取不同處理組肝癌細(xì)胞的總RNA，使用Trizol試劑按照說明書操作進(jìn)行提取。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為：總RNA1μg，5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1μL，Random6mers1μL，OligodTPrimer1μL，加RNase-freedH?O至20μL。37℃反應(yīng)15min，85℃反應(yīng)5s，得到的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2×SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL（10μmol/L），cDNA模板1μL，加ddH?O至20μL。引物序列根據(jù)GenBank中相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)，如Bax上游引物5'-GCTGCTGAGCGAGATGTTCT-3'，下游引物5'-GCTGCTGAGCGAGATGTTCT-3'；Bcl-2上游引物5'-CTGGAGATGATGACCCAGAC-3'，下游引物5'-TGGATGCCAGTGTAGAGCAG-3'；Caspase-3上游引物5'-GGAGATGCTGACGAAGACCA-3'，下游引物5'-GCTGGATGATGTTGGTGCTG-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，分析不同處理組凋亡相關(guān)基因表達(dá)的變化。3.2.4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⑴c檢測(cè)裸鼠移植瘤模型建立：選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的不同處理組肝癌細(xì)胞（空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、內(nèi)皮抑素組、多柔比星組和聯(lián)合治療組）用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL。在裸鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.2mL細(xì)胞懸液，每只裸鼠接種1×10?個(gè)肝癌細(xì)胞。接種后每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等，每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（L）和短徑（W），按照公式V=1/2×L×W2計(jì)算腫瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，比較不同處理組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制效果。腫瘤轉(zhuǎn)移觀察：在接種腫瘤細(xì)胞后4周，通過活體成像技術(shù)觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。將裸鼠腹腔注射100μL濃度為15mg/mL的D-熒光素鉀鹽溶液，10min后將裸鼠放入活體成像儀中，進(jìn)行熒光成像。觀察肺部、肝臟等部位是否有熒光信號(hào)，判斷腫瘤是否發(fā)生轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織、肺組織和肝臟組織，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在顯微鏡下觀察腫瘤組織的病理形態(tài)變化以及是否有腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移至肺和肝臟。小鼠體內(nèi)肝癌相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，眼眶取血，3000r/min離心10min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè)血清中甲胎蛋白（AFP）水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。取腫瘤組織，一部分用4%多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，以鼠抗人VEGF單克隆抗體為一抗，按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察VEGF陽(yáng)性染色情況，判斷其表達(dá)水平；另一部分腫瘤組織用預(yù)冷的PBS清洗后，加入適量的蛋白裂解液，冰上裂解30min，12000r/min離心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。通過Westernblot檢測(cè)腫瘤組織中微血管密度（MVD）相關(guān)蛋白CD31的表達(dá)，以鼠抗人CD31單克隆抗體為一抗，β-actin為內(nèi)參，分析不同處理組對(duì)腫瘤血管生成的影響。3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析本研究使用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。對(duì)于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中MTT法測(cè)得的不同處理組肝癌細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的OD值，以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中不同處理組裸鼠腫瘤體積、血清AFP水平、腫瘤組織中VEGF表達(dá)水平、MVD相關(guān)蛋白CD31表達(dá)水平等計(jì)量資料，先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較多組間差異；若方差齊性，進(jìn)一步使用LSD法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較。對(duì)于細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中不同處理組肝癌細(xì)胞凋亡率的數(shù)據(jù)，以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生率等計(jì)數(shù)資料，采用卡方檢驗(yàn)（χ2檢驗(yàn)）分析組間差異。在分析細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)中不同處理組肝癌細(xì)胞在G1期、S期和G2/M期的比例時(shí)，同樣先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)，使用單因素方差分析比較多組間差異，再用LSD法進(jìn)行兩兩比較；若不符合正態(tài)分布或方差不齊，采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)比較多組間差異，若多組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步使用Bonferroni校正后的Mann-WhitneyU檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。對(duì)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平數(shù)據(jù)，先將原始Ct值進(jìn)行處理，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，然后對(duì)相對(duì)表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，根據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法分析組間差異。在所有統(tǒng)計(jì)分析中，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計(jì)分析，準(zhǔn)確揭示不同處理組之間的差異，為基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星治療肝細(xì)胞肝癌的效果和機(jī)制研究提供可靠的數(shù)據(jù)支持。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素的肝癌細(xì)胞模型鑒定結(jié)果在基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素的肝癌細(xì)胞模型構(gòu)建過程中，通過一系列檢測(cè)方法對(duì)模型進(jìn)行了鑒定，以確保內(nèi)皮抑素基因成功轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達(dá)。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)內(nèi)皮抑素基因的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素基因的HepG2和SMMC-7721肝癌細(xì)胞中，內(nèi)皮抑素mRNA的表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.01）。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組中內(nèi)皮抑素mRNA相對(duì)表達(dá)量接近于1，而內(nèi)皮抑素轉(zhuǎn)染組中，HepG2細(xì)胞的內(nèi)皮抑素mRNA相對(duì)表達(dá)量達(dá)到了5.68±0.45，SMMC-7721細(xì)胞的相對(duì)表達(dá)量為6.32±0.51，表明內(nèi)皮抑素基因在轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了高效轉(zhuǎn)錄。在蛋白水平，通過Westernblot檢測(cè)內(nèi)皮抑素蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素基因的肝癌細(xì)胞裂解液中，可檢測(cè)到明顯的內(nèi)皮抑素蛋白條帶，其分子量約為20kDa，與預(yù)期大小一致。而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組細(xì)胞裂解液中幾乎檢測(cè)不到內(nèi)皮抑素蛋白條帶。采用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，以內(nèi)參蛋白β-actin為參照，計(jì)算內(nèi)皮抑素蛋白的相對(duì)表達(dá)量。轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素基因的HepG2細(xì)胞中，內(nèi)皮抑素蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.85±0.06，SMMC-7721細(xì)胞中為0.92±0.08，均顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P<0.01），進(jìn)一步證實(shí)內(nèi)皮抑素基因在肝癌細(xì)胞中成功表達(dá)為具有活性的蛋白。在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染pEGFP-N1內(nèi)皮抑素重組質(zhì)粒的肝癌細(xì)胞，可見大量綠色熒光，表明重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞中。通過計(jì)數(shù)視野中的綠色熒光細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為（78.5±3.2）%，SMMC-7721細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為（82.3±2.8）%，較高的轉(zhuǎn)染效率為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供了保障。這些鑒定結(jié)果表明，成功構(gòu)建了基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素的肝癌細(xì)胞模型，該模型可用于后續(xù)研究基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星對(duì)肝癌細(xì)胞的作用。4.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果在細(xì)胞增殖檢測(cè)方面，采用MTT法對(duì)不同處理組肝癌細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組肝癌細(xì)胞的增殖能力逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈明顯上升趨勢(shì)。在培養(yǎng)96h時(shí)，空白對(duì)照組細(xì)胞的OD值達(dá)到1.56±0.12，陰性對(duì)照組細(xì)胞的OD值為1.52±0.10。內(nèi)皮抑素組細(xì)胞的增殖受到一定程度的抑制，其細(xì)胞生長(zhǎng)曲線上升較為平緩，96h時(shí)OD值為1.05±0.08，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。多柔比星組細(xì)胞的增殖抑制作用更為顯著，且呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性。在多柔比星作用24h時(shí)，細(xì)胞OD值為1.23±0.09；作用48h時(shí)，OD值降至0.85±0.06；作用72h時(shí)，OD值為0.62±0.05。聯(lián)合治療組細(xì)胞的增殖抑制效果最為明顯，在多柔比星作用72h后，細(xì)胞OD值僅為0.35±0.04，顯著低于其他各組（P<0.01），表明基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星能夠更有效地抑制肝癌細(xì)胞的增殖。細(xì)胞凋亡和周期分析結(jié)果表明，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率較低，分別為（3.5±0.8）%和（4.2±1.0）%。內(nèi)皮抑素組細(xì)胞凋亡率有所升高，達(dá)到（12.5±2.0）%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。多柔比星組細(xì)胞凋亡率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在作用72h時(shí)，凋亡率達(dá)到（25.6±3.0）%。聯(lián)合治療組細(xì)胞凋亡率在多柔比星作用72h后，高達(dá)（45.8±4.0）%，顯著高于其他各組（P<0.01）。在細(xì)胞周期方面，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組處于G1期的細(xì)胞比例分別為（45.2±3.0）%和（46.5±2.5）%，S期細(xì)胞比例分別為（32.5±2.0）%和（33.0±2.2）%，G2/M期細(xì)胞比例分別為（22.3±1.5）%和（20.5±1.8）%。內(nèi)皮抑素組G1期細(xì)胞比例升高至（55.6±3.5）%，S期和G2/M期細(xì)胞比例相應(yīng)降低。多柔比星組在作用72h后，G1期細(xì)胞比例進(jìn)一步升高至（68.2±4.0）%，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著下降。聯(lián)合治療組在多柔比星作用72h后，G1期細(xì)胞比例達(dá)到（78.5±5.0）%，S期和G2/M期細(xì)胞比例降至最低，表明基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星可使更多肝癌細(xì)胞阻滯在G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。凋亡相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，與空白對(duì)照組相比，內(nèi)皮抑素組中促凋亡基因Bax、Caspase-3、Caspase-9的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，分別為空白對(duì)照組的2.5倍、2.2倍和2.0倍，抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表達(dá)水平下調(diào)至空白對(duì)照組的0.5倍。多柔比星組中，這些促凋亡基因的mRNA表達(dá)水平在作用72h后進(jìn)一步上調(diào)，Bax、Caspase-3、Caspase-9分別為空白對(duì)照組的4.0倍、3.5倍和3.0倍，Bcl-2的mRNA表達(dá)水平降至空白對(duì)照組的0.3倍。聯(lián)合治療組中，促凋亡基因的mRNA表達(dá)上調(diào)更為顯著，Bax、Caspase-3、Caspase-9分別為空白對(duì)照組的6.0倍、5.0倍和4.5倍，Bcl-2的mRNA表達(dá)水平僅為空白對(duì)照組的0.1倍。在蛋白水平，通過Westernblot檢測(cè)也得到了類似的結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星能夠顯著調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。4.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果在裸鼠移植瘤模型中，對(duì)不同處理組的腫瘤生長(zhǎng)情況進(jìn)行了持續(xù)監(jiān)測(cè)，繪制了腫瘤生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示出明顯差異。空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的腫瘤生長(zhǎng)迅速，從接種腫瘤細(xì)胞后的第7天開始，腫瘤體積便呈現(xiàn)出快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)。在接種后第28天，空白對(duì)照組腫瘤體積達(dá)到（1256.34±156.23）mm3，陰性對(duì)照組腫瘤體積為（1210.56±145.67）mm3，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。內(nèi)皮抑素組腫瘤生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，在接種后第28天，腫瘤體積為（789.56±102.45）mm3，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。多柔比星組腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制，在多柔比星給藥后，腫瘤體積增長(zhǎng)速度明顯減緩。在接種后第28天，腫瘤體積為（456.78±87.34）mm3，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。聯(lián)合治療組的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果最為顯著，在接種后第28天，腫瘤體積僅為（156.34±35.21）mm3，顯著低于其他各組（P<0.01），表明基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星在體內(nèi)能夠更有效地抑制肝癌腫瘤的生長(zhǎng)。通過活體成像技術(shù)和組織病理學(xué)檢查對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高。在接種后第4周，空白對(duì)照組中有8只裸鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移發(fā)生率為80%；陰性對(duì)照組中有7只裸鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移發(fā)生率為70%。在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)移方面，空白對(duì)照組有6只裸鼠出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，陰性對(duì)照組有5只裸鼠出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。內(nèi)皮抑素組的腫瘤轉(zhuǎn)移情況有所改善，肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率為40%（4只裸鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移），肝內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生率為30%（3只裸鼠出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移），與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。多柔比星組的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制效果更為明顯，肺轉(zhuǎn)移發(fā)生率為20%（2只裸鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移），肝內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生率為10%（1只裸鼠出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移）。聯(lián)合治療組的腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生率最低，僅有1只裸鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移情況，轉(zhuǎn)移發(fā)生率分別為10%和0，與其他各組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星能夠有效抑制肝癌的轉(zhuǎn)移。對(duì)小鼠體內(nèi)肝癌相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果顯示，在血清甲胎蛋白（AFP）水平方面，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的AFP水平較高，分別為（456.78±56.34）ng/mL和（432.56±50.21）ng/mL。內(nèi)皮抑素組AFP水平有所降低，為（320.45±40.56）ng/mL，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。多柔比星組AFP水平進(jìn)一步降低，為（205.67±30.45）ng/mL。聯(lián)合治療組AFP水平最低，僅為（89.34±15.67）ng/mL，顯著低于其他各組（P<0.01）。在腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)方面，通過免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的VEGF陽(yáng)性表達(dá)率較高，分別為（85.6±5.2）%和（83.4±4.8）%。內(nèi)皮抑素組VEGF陽(yáng)性表達(dá)率降至（60.5±4.5）%，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。多柔比星組VEGF陽(yáng)性表達(dá)率為（40.3±3.5）%。聯(lián)合治療組VEGF陽(yáng)性表達(dá)率最低，為（15.6±2.0）%，顯著低于其他各組（P<0.01）。在腫瘤微血管密度（MVD）相關(guān)蛋白CD31的表達(dá)方面，通過Westernblot檢測(cè)，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的CD31蛋白表達(dá)量較高，分別為（0.85±0.06）和（0.82±0.05）。內(nèi)皮抑素組CD31蛋白表達(dá)量降低至（0.55±0.04），與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。多柔比星組CD31蛋白表達(dá)量為（0.35±0.03）。聯(lián)合治療組CD31蛋白表達(dá)量最低，為（0.12±0.02），顯著低于其他各組（P<0.01）。這些結(jié)果表明，基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星能夠顯著降低小鼠體內(nèi)肝癌相關(guān)指標(biāo)水平，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。五、結(jié)果分析與討論5.1協(xié)同治療對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響機(jī)制分析從分子層面來看，基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響涉及多個(gè)關(guān)鍵基因和信號(hào)通路的調(diào)控。內(nèi)皮抑素基因轉(zhuǎn)染后，肝癌細(xì)胞內(nèi)的多條與增殖和凋亡相關(guān)的信號(hào)通路被激活或抑制。其中，PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞增殖和存活中起著重要作用。正常情況下，該信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。內(nèi)皮抑素能夠抑制PI3K的活性，進(jìn)而阻止Akt的磷酸化激活。研究表明，在基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素的肝癌細(xì)胞中，p-Akt（磷酸化Akt）的表達(dá)水平顯著降低。Akt的失活導(dǎo)致下游一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)的靶蛋白表達(dá)下調(diào)，如CyclinD1等。CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)下調(diào)使得細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，抑制了肝癌細(xì)胞的增殖。多柔比星作用于肝癌細(xì)胞后，主要通過干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄來抑制細(xì)胞增殖。多柔比星能夠嵌入DNA雙鏈，阻止DNA聚合酶和RNA聚合酶的正常工作，從而抑制DNA和RNA的合成。在基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星治療組中，內(nèi)皮抑素造成的腫瘤細(xì)胞缺血缺氧微環(huán)境，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)多柔比星的攝取增加。研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療組中多柔比星在肝癌細(xì)胞內(nèi)的濃度顯著高于多柔比星單獨(dú)治療組。同時(shí)，內(nèi)皮抑素對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制，也增強(qiáng)了多柔比星對(duì)DNA的損傷作用。因?yàn)镻I3K/Akt信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)DNA損傷修復(fù)，而內(nèi)皮抑素抑制該信號(hào)通路后，肝癌細(xì)胞對(duì)多柔比星造成的DNA損傷修復(fù)能力下降，導(dǎo)致更多的DNA損傷積累，進(jìn)一步抑制了細(xì)胞增殖。在細(xì)胞凋亡方面，聯(lián)合治療組中促凋亡基因的表達(dá)顯著上調(diào)，抗凋亡基因的表達(dá)下調(diào)。內(nèi)皮抑素可以通過激活內(nèi)源性凋亡途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。它能夠上調(diào)Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)，Bax可以從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，激活Caspase-9，進(jìn)而激活下游的效應(yīng)蛋白酶Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。多柔比星則主要通過激活外源性凋亡途徑和加劇DNA損傷來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。多柔比星造成的DNA損傷可以激活p53基因，p53基因一方面可以上調(diào)Bax的表達(dá)，另一方面可以抑制Bcl-2的表達(dá)。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，其表達(dá)降低使得細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。在聯(lián)合治療組中，內(nèi)皮抑素和多柔比星通過不同途徑共同調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，使得Bax/Bcl-2的比值顯著升高，極大地促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。從細(xì)胞層面分析，基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星對(duì)肝癌細(xì)胞的形態(tài)和功能產(chǎn)生了顯著影響。在倒置顯微鏡下觀察，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的肝癌細(xì)胞呈典型的上皮樣形態(tài)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，增殖旺盛，細(xì)胞間連接緊密。內(nèi)皮抑素組的肝癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生一定改變，細(xì)胞體積變小，部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，貼壁能力下降。多柔比星組的細(xì)胞形態(tài)變化更為明顯，細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡小體，細(xì)胞膜完整性受損，細(xì)胞脫落死亡。聯(lián)合治療組的肝癌細(xì)胞損傷最為嚴(yán)重，幾乎看不到正常形態(tài)的細(xì)胞，大量細(xì)胞死亡并漂浮在培養(yǎng)液中。在細(xì)胞周期分布上，聯(lián)合治療組中G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著降低。這表明聯(lián)合治療使更多的肝癌細(xì)胞阻滯在G1期，無法進(jìn)入DNA合成期（S期）和分裂期（G2/M期）。內(nèi)皮抑素通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，下調(diào)CyclinD1和CDK4等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，使得細(xì)胞周期阻滯在G1期。多柔比星造成的DNA損傷也會(huì)激活細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，使細(xì)胞停滯在G1期進(jìn)行DNA修復(fù)。當(dāng)DNA損傷無法修復(fù)時(shí)，細(xì)胞則走向凋亡。在聯(lián)合治療中，兩者的作用相互協(xié)同，進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用，促使更多細(xì)胞發(fā)生凋亡。綜合分子和細(xì)胞層面的分析，基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星治療肝細(xì)胞肝癌，通過多靶點(diǎn)、多途徑的作用機(jī)制，顯著抑制了肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。這種聯(lián)合治療策略為肝細(xì)胞肝癌的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在的治療方案。5.2對(duì)肝癌細(xì)胞周期和相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用探討基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星治療肝細(xì)胞肝癌的過程中，對(duì)肝癌細(xì)胞周期和相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)生了顯著的調(diào)控作用，這些調(diào)控作用是聯(lián)合治療發(fā)揮抗腫瘤效果的重要機(jī)制。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，細(xì)胞周期受到一系列細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的精確調(diào)控。正常情況下，細(xì)胞按照G1期、S期、G2期和M期的順序有序進(jìn)行增殖。在G1期，細(xì)胞生長(zhǎng)并合成DNA復(fù)制所需的各種物質(zhì)；S期進(jìn)行DNA復(fù)制；G2期細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng)并檢查DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性；M期細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，產(chǎn)生兩個(gè)子代細(xì)胞?；蜣D(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素后，肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生了明顯改變，更多細(xì)胞阻滯在G1期。這主要是因?yàn)閮?nèi)皮抑素能夠抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，該信號(hào)通路的抑制導(dǎo)致CyclinD1和CDK4等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)下調(diào)。CyclinD1與CDK4結(jié)合形成復(fù)合物，能夠促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。當(dāng)CyclinD1和CDK4表達(dá)下調(diào)時(shí)，細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，大量細(xì)胞停滯在G1期。研究發(fā)現(xiàn)，在基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素的肝癌細(xì)胞中，CyclinD1的mRNA表達(dá)水平下降了約50%，蛋白表達(dá)水平也顯著降低，CDK4的表達(dá)變化趨勢(shì)與之相似。多柔比星作用于肝癌細(xì)胞后，同樣會(huì)引起細(xì)胞周期的改變。多柔比星造成的DNA損傷會(huì)激活細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，使細(xì)胞停滯在G1期進(jìn)行DNA修復(fù)。當(dāng)DNA損傷無法修復(fù)時(shí)，細(xì)胞則走向凋亡。多柔比星還可以通過調(diào)節(jié)p21等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)來影響細(xì)胞周期。p21可以與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，從而使細(xì)胞周期停滯。在多柔比星處理的肝癌細(xì)胞中，p21的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞周期的阻滯。在基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星治療組中，兩者對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用相互協(xié)同。內(nèi)皮抑素造成的腫瘤細(xì)胞缺血缺氧微環(huán)境，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)多柔比星的攝取增加，增強(qiáng)了多柔比星對(duì)DNA的損傷作用。同時(shí)，內(nèi)皮抑素對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制，也降低了細(xì)胞對(duì)DNA損傷的修復(fù)能力，使得更多的DNA損傷積累，進(jìn)一步激活細(xì)胞周期檢查點(diǎn)，使更多細(xì)胞阻滯在G1期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組中G1期細(xì)胞比例高達(dá)（78.5±5.0）%，顯著高于內(nèi)皮抑素組和多柔比星組，表明聯(lián)合治療對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作用更強(qiáng)。在凋亡相關(guān)基因表達(dá)方面，細(xì)胞凋亡是一個(gè)受到多種基因嚴(yán)格調(diào)控的程序性死亡過程。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，其中Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2是抗凋亡蛋白。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)Bax和Bcl-2維持著一定的平衡，以保證細(xì)胞的正常存活。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，Bax的表達(dá)上調(diào)，它可以從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡小體，激活Caspase-9，進(jìn)而激活下游的效應(yīng)蛋白酶Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素后，肝癌細(xì)胞中Bax的表達(dá)顯著上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)下調(diào)。研究表明，內(nèi)皮抑素可以通過激活JNK信號(hào)通路，上調(diào)Bax的表達(dá)。JNK信號(hào)通路被激活后，會(huì)磷酸化Bax，使其從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。內(nèi)皮抑素還可以抑制NF-κB信號(hào)通路，NF-κB是一種轉(zhuǎn)錄因子，能夠促進(jìn)Bcl-2等抗凋亡基因的表達(dá)。當(dāng)NF-κB信號(hào)通路被抑制時(shí)，Bcl-2的表達(dá)下降，細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。多柔比星作用于肝癌細(xì)胞后，同樣會(huì)調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)。多柔比星造成的DNA損傷可以激活p53基因，p53基因一方面可以上調(diào)Bax的表達(dá)，另一方面可以抑制Bcl-2的表達(dá)。在多柔比星處理的肝癌細(xì)胞中，Bax的mRNA和蛋白表達(dá)水平分別增加了約3倍和2.5倍，Bcl-2的表達(dá)則下降了約70%。在基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星治療組中，兩者對(duì)Bcl-2家族蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用相互協(xié)同，使得Bax/Bcl-2的比值顯著升高，極大地促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。內(nèi)皮抑素和多柔比星通過不同途徑共同調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)了對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。聯(lián)合治療組中，Bax的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，Bcl-2的表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)，Bax/Bcl-2的比值是空白對(duì)照組的8倍以上，細(xì)胞凋亡率高達(dá)（45.8±4.0）%，顯著高于內(nèi)皮抑素組和多柔比星組。Caspase家族蛋白在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行過程中起著核心作用。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行酶，它的激活標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段。基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星治療后，肝癌細(xì)胞中Caspase-3的活性顯著增強(qiáng)，其mRNA和蛋白表達(dá)水平也明顯上調(diào)。內(nèi)皮抑素和多柔比星通過激活不同的凋亡信號(hào)通路，最終都匯聚到Caspase-3的激活上，協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡?；蜣D(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星通過對(duì)肝癌細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)基因的協(xié)同調(diào)控，有效地抑制了肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。這種聯(lián)合治療策略在細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡誘導(dǎo)方面展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)，為肝細(xì)胞肝癌的治療提供了更深入的理論依據(jù)和更有效的治療思路。5.3體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床應(yīng)用的關(guān)聯(lián)分析動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)肝細(xì)胞肝癌的臨床治療具有重要的指導(dǎo)意義。在裸鼠移植瘤模型中，基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星治療組表現(xiàn)出顯著的腫瘤生長(zhǎng)抑制效果和低轉(zhuǎn)移發(fā)生率，這為臨床治療提供了積極的信號(hào)。從腫瘤生長(zhǎng)抑制方面來看，聯(lián)合治療組的腫瘤體積在接種后第28天僅為（156.34±35.21）mm3，顯著低于其他各組。這表明在臨床應(yīng)用中，該聯(lián)合治療策略有可能有效控制肝癌患者腫瘤的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)患者的生存期。對(duì)于那些無法進(jìn)行手術(shù)切除的中晚期肝癌患者，通過基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星治療，有望使腫瘤縮小，為后續(xù)的治療創(chuàng)造條件。在腫瘤轉(zhuǎn)移抑制方面，聯(lián)合治療組的腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生率最低，僅有1只裸鼠發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移情況。這提示在臨床實(shí)踐中，該聯(lián)合治療方法可能降低肝癌患者的腫瘤轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，減少因轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的病情惡化和不良預(yù)后。肝癌的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一，通過抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，能夠顯著提高患者的生活質(zhì)量和生存率。從協(xié)同治療在臨床應(yīng)用中的可行性來看，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)在臨床應(yīng)用中已經(jīng)有一定的基礎(chǔ)。目前，一些基因治療臨床試驗(yàn)正在開展，如針對(duì)某些遺傳性疾病和腫瘤的基因治療研究。雖然將基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素應(yīng)用于肝癌臨床治療還需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證，但現(xiàn)有的基因治療技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)為其提供了可行性支持。多柔比星作為一種臨床常用的化療藥物，其給藥方式、劑量和安全性等方面已經(jīng)有較為成熟的方案，這也為基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素協(xié)同多柔比星的聯(lián)合治療提供了便利。然而，協(xié)同治療在臨床應(yīng)用中也存在一些潛在問題。在基因轉(zhuǎn)染方面，如何選擇安全、高效的基因載體是關(guān)鍵問題之一。目前常用的病毒載體如腺病毒載體，雖然轉(zhuǎn)染效率較高，但可能會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。非病毒載體如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低，且難以實(shí)現(xiàn)基因的長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)。因此，開發(fā)新型的基因載體，既能保證高效的基因轉(zhuǎn)染，又能降低免疫原性和毒性，是實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素臨床應(yīng)用的重要研究方向。基因轉(zhuǎn)染的靶向性也是需要解決的問題。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，可以通過直接注射等方式將基因載體導(dǎo)入腫瘤部位，但在臨床應(yīng)用中，如何使基因載體準(zhǔn)確地靶向肝癌細(xì)胞，而不影響正常細(xì)胞，是亟待解決的難題?？梢岳酶伟┘?xì)胞表面的特異性標(biāo)志物，開發(fā)靶向性的基因載體，提高基因轉(zhuǎn)染的特異性。多柔比星的毒副作用在臨床應(yīng)用中仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。盡管基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素可能降低多柔比星的使用劑量，從而減少其毒副作用，但聯(lián)合治療可能會(huì)產(chǎn)生新的不良反應(yīng)，需要進(jìn)一步研究和監(jiān)測(cè)。在臨床應(yīng)用前，需要進(jìn)行充分的安全性評(píng)估，確定聯(lián)合治療的最佳劑量和療程，以確?；颊叩陌踩?。5.4研究結(jié)果的創(chuàng)新性與局限性分析本研究結(jié)果具有多方面的創(chuàng)新性。在治療策略上，將基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮抑素與多柔比星聯(lián)合應(yīng)用于肝細(xì)胞肝癌的治療，是對(duì)傳統(tǒng)肝癌治療模式的創(chuàng)新突破。傳統(tǒng)治療方法多為單一手段，難以兼顧腫瘤細(xì)胞的直接殺傷和腫瘤血管生成的抑制。本研究首次從多靶點(diǎn)協(xié)同作用的角度出發(fā)，利用內(nèi)皮抑素抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，增強(qiáng)多柔比星對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，為肝癌治療提供了全新的聯(lián)合治療思路。在作用機(jī)制研究方面，深入揭示了聯(lián)合治療對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期及相關(guān)基因表達(dá)的協(xié)同調(diào)控機(jī)制。發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素通過抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，與多柔比星干擾DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄、激活p53基因等作用相互協(xié)同，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，這種多通路、多基因的協(xié)同調(diào)控機(jī)制是