塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗對(duì)大鼠膀胱癌治療效果及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)膀胱癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)。在我國(guó)，膀胱癌的發(fā)病率同樣不容小覷，已成為泌尿系統(tǒng)腫瘤的首位。其病理類型主要以移行上皮細(xì)胞癌為主，其中大部分為淺表性膀胱癌。盡管手術(shù)切除是主要的治療手段，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，且部分患者會(huì)進(jìn)展為浸潤(rùn)性膀胱癌，預(yù)后較差。目前，膀胱癌的治療方法包括手術(shù)、化療、放療和免疫治療等。手術(shù)治療如經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（TURBT）是淺表性膀胱癌的主要治療方法，但術(shù)后復(fù)發(fā)率可達(dá)50%-70%。膀胱內(nèi)灌注化療和免疫治療是預(yù)防膀胱癌術(shù)后復(fù)發(fā)的重要手段。卡介苗（BCG）作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，膀胱內(nèi)灌注BCG已被廣泛應(yīng)用于淺表性膀胱癌的治療，其能夠激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，在預(yù)防腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)、治療原位癌和防止腫瘤進(jìn)展等方面具有顯著療效。然而，仍有相當(dāng)一部分患者對(duì)BCG治療無(wú)反應(yīng)，且BCG膀胱腔內(nèi)灌注可導(dǎo)致膀胱局部與全身并發(fā)癥，限制了其臨床應(yīng)用?；熕幬锶缃z裂霉素等也常用于膀胱灌注，但腫瘤復(fù)發(fā)率仍較高。塞來(lái)昔布是一種特異性的環(huán)氧化酶-2（COX-2）抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)，COX-2在膀胱癌組織中高表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。塞來(lái)昔布通過(guò)抑制COX-2的活性，能夠調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抑制血管生成，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。已有研究表明，塞來(lái)昔布對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，包括膀胱癌細(xì)胞?；谝陨媳尘?，本研究旨在探討塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療大鼠膀胱癌的療效及機(jī)制。通過(guò)建立大鼠膀胱癌模型，對(duì)比觀察塞來(lái)昔布、卡介苗單獨(dú)用藥以及二者聯(lián)合用藥對(duì)膀胱癌的治療效果，檢測(cè)相關(guān)免疫指標(biāo)和腫瘤細(xì)胞凋亡情況，深入分析其作用機(jī)制。本研究的結(jié)果有望為膀胱癌的臨床治療提供新的思路和方法，提高膀胱癌的治療效果，改善患者的預(yù)后，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)建立大鼠膀胱癌模型，深入探究塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療膀胱癌的療效及潛在作用機(jī)制。具體而言，本研究期望達(dá)成以下目標(biāo)：評(píng)估聯(lián)合用藥的治療效果：對(duì)比塞來(lái)昔布、卡介苗單獨(dú)用藥以及二者聯(lián)合用藥對(duì)大鼠膀胱癌生長(zhǎng)的抑制作用，明確聯(lián)合用藥在降低腫瘤發(fā)生率、減小腫瘤體積、減少腫瘤數(shù)量等方面是否具有更顯著的療效，為臨床治療方案的選擇提供直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。探究聯(lián)合用藥對(duì)免疫功能的影響：通過(guò)檢測(cè)腫瘤組織中免疫細(xì)胞（如CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞）的浸潤(rùn)情況，分析聯(lián)合用藥對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活作用，揭示其是否能夠增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力，從免疫調(diào)節(jié)的角度闡明聯(lián)合用藥的作用機(jī)制。分析聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響：運(yùn)用TUNEL法等技術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡指數(shù)，研究聯(lián)合用藥是否通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用，進(jìn)一步明確其在細(xì)胞水平上的作用機(jī)制，為深入理解聯(lián)合用藥的抗癌效果提供理論支持。為臨床治療提供理論依據(jù)：基于上述研究結(jié)果，為膀胱癌的臨床治療提供新的策略和理論指導(dǎo)，推動(dòng)塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療方案在臨床上的應(yīng)用，提高膀胱癌患者的治療效果和生存率，改善患者的生活質(zhì)量。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1塞來(lái)昔布治療膀胱癌的研究塞來(lái)昔布作為一種特異性COX-2抑制劑，在膀胱癌治療研究領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注。國(guó)外有研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，將塞來(lái)昔布作用于膀胱癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明，塞來(lái)昔布可通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使癌細(xì)胞阻滯于G0/G1期，從而抑制細(xì)胞的分裂和增殖。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，有學(xué)者構(gòu)建膀胱癌小鼠模型，給予塞來(lái)昔布灌胃處理，結(jié)果顯示小鼠腫瘤體積明顯減小，腫瘤生長(zhǎng)速度減緩，同時(shí)腫瘤組織中COX-2的表達(dá)水平顯著降低，這表明塞來(lái)昔布可能通過(guò)抑制COX-2的活性來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用。國(guó)內(nèi)研究也取得了一定進(jìn)展。有研究采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)膀胱癌組織中COX-2的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)COX-2在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯高于正常膀胱組織，且其表達(dá)水平與膀胱癌的病理分級(jí)、臨床分期密切相關(guān)。通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布能夠誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。此外，還有研究探討了塞來(lái)昔布聯(lián)合其他化療藥物治療膀胱癌的效果，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥能增強(qiáng)對(duì)膀胱癌細(xì)胞的抑制作用，提高治療效果。1.3.2卡介苗治療膀胱癌的研究卡介苗治療膀胱癌的歷史較為悠久，自20世紀(jì)70年代首次被報(bào)道用于膀胱癌治療以來(lái)，經(jīng)過(guò)大量的臨床研究和實(shí)踐，已成為淺表性膀胱癌的標(biāo)準(zhǔn)治療方法之一。國(guó)外多項(xiàng)大規(guī)模的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果顯示，卡介苗膀胱內(nèi)灌注能夠有效降低淺表性膀胱癌術(shù)后的復(fù)發(fā)率，提高患者的無(wú)瘤生存率。其作用機(jī)制主要是通過(guò)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，卡介苗與膀胱纖維黏連蛋白結(jié)合并被腫瘤細(xì)胞內(nèi)在化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原和交叉反應(yīng)抗原，增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。同時(shí)，卡介苗還能刺激機(jī)體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2、干擾素-γ等，這些細(xì)胞因子能夠激活T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。國(guó)內(nèi)的臨床研究也證實(shí)了卡介苗在膀胱癌治療中的有效性。有研究對(duì)接受卡介苗膀胱灌注治療的淺表性膀胱癌患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，結(jié)果顯示，大部分患者的腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間明顯延遲，生存質(zhì)量得到提高。然而，卡介苗治療也存在一定的局限性，部分患者對(duì)卡介苗治療無(wú)反應(yīng)，即所謂的卡介苗無(wú)反應(yīng)性膀胱癌，這部分患者的腫瘤復(fù)發(fā)率和進(jìn)展率較高。此外，卡介苗膀胱腔內(nèi)灌注還可能導(dǎo)致一些不良反應(yīng)，如膀胱炎、發(fā)熱、血尿等，嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)影響患者的治療依從性。1.3.3塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療膀胱癌的研究目前，塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療膀胱癌的研究相對(duì)較少，但已有的研究結(jié)果顯示出了良好的應(yīng)用前景。國(guó)外有研究在動(dòng)物模型上進(jìn)行探索，將塞來(lái)昔布和卡介苗聯(lián)合應(yīng)用于膀胱癌大鼠，與單獨(dú)使用卡介苗或塞來(lái)昔布相比，聯(lián)合用藥組的腫瘤體積更小，腫瘤細(xì)胞凋亡率更高，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)更為明顯，表明聯(lián)合用藥能夠增強(qiáng)對(duì)膀胱癌的治療效果。其機(jī)制可能是塞來(lái)昔布通過(guò)抑制COX-2的活性，減少前列腺素E2的合成，從而調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，增強(qiáng)卡介苗對(duì)免疫系統(tǒng)的激活作用；同時(shí)，卡介苗激活的免疫系統(tǒng)也可能增強(qiáng)塞來(lái)昔布誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。國(guó)內(nèi)也有相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，選用Wistar大鼠建立膀胱腫瘤模型，隨機(jī)分為PBS組、塞來(lái)昔布組、卡介苗組、塞來(lái)昔布+卡介苗組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比及腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)與其他組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證實(shí)了聯(lián)合應(yīng)用塞來(lái)昔布和卡介苗比單純使用卡介苗或塞來(lái)昔布能更加明顯地抑制大鼠膀胱腫瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)免疫系統(tǒng)的功能和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡增加而發(fā)揮作用。然而，目前該聯(lián)合治療方案在臨床應(yīng)用中的研究還較少，其安全性和有效性仍需進(jìn)一步的大樣本、多中心臨床研究來(lái)驗(yàn)證。二、實(shí)驗(yàn)材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用5-6周齡的雌性Wistar大鼠40只，體重在180-220g之間。Wistar大鼠具有生長(zhǎng)發(fā)育快、繁殖力強(qiáng)、性情溫順、對(duì)傳染病抵抗力較強(qiáng)等特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)用廣泛，尤其在腫瘤研究領(lǐng)域，其生理特性和對(duì)致癌物質(zhì)的反應(yīng)與人有一定相似性，能夠較好地模擬人類膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，是建立膀胱癌動(dòng)物模型的常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。所有大鼠購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[具體許可證號(hào)]。大鼠在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房溫度控制在22-25℃，相對(duì)濕度為40%-60%，采用12h光照、12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食和飲水。飼料為標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，飲水為經(jīng)高溫滅菌處理的純凈水。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理和福利原則，最大限度減少動(dòng)物的痛苦。2.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器主要試劑：塞來(lái)昔布：購(gòu)自美國(guó)輝瑞公司，為特異性COX-2抑制劑，用于抑制COX-2的活性，調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抑制血管生成。將其配制成一定濃度的溶液，按100mg/kg的劑量，根據(jù)大鼠體重確定用量，溶于2ml生理鹽水中，采用灌胃給藥方式，每天1次，共3周?？ń槊纾簝龈煽ń槊缳?gòu)自上海生物制品研究所，是一種免疫調(diào)節(jié)劑，通過(guò)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤作用。使用時(shí)將50mg/支的凍干卡介苗溶于5ml生理鹽水中，每只大鼠用量0.1ml，采用膀胱灌注給藥，每周1次，共3次。N-甲基亞硝基脲（MNU）：由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)，是一種強(qiáng)致癌劑，用于建立大鼠膀胱癌模型。用pH6.0的0.1mol/L枸櫞酸緩沖液為溶劑，將MNU配成濃度為20mg/ml的溶液，每只大鼠用量0.1ml，通過(guò)膀胱灌注，每2周1次，共5次。戊巴比妥鈉：用于麻醉大鼠，采用腹腔內(nèi)注射方式，劑量為2.5ml/kg，濃度為0.6%。碘伏：0.1%的碘伏用于消毒尿道外口，以防止感染，保障實(shí)驗(yàn)操作的無(wú)菌環(huán)境。中性福爾馬林溶液：用于固定腫瘤組織，將切取的腫瘤組織置于其中固定24h，以便后續(xù)進(jìn)行石蠟包埋和切片制作。蘇木精-伊紅（HE）染液：用于對(duì)石蠟切片進(jìn)行染色，通過(guò)顯微鏡觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化，判斷腫瘤的病理類型和發(fā)展程度。免疫組化相關(guān)試劑：包括鼠抗大鼠CD3+、CD4+、CD8+單克隆抗體，以及二抗、DAB顯色試劑盒等，用于檢測(cè)腫瘤組織中免疫細(xì)胞（CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞）的浸潤(rùn)情況，以評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài)。TUNEL試劑盒：用于檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡指數(shù)，通過(guò)標(biāo)記凋亡細(xì)胞中的DNA斷裂末端，在顯微鏡下計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞，分析藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。主要儀器：電子天平：用于稱量塞來(lái)昔布、卡介苗等試劑，確保給藥劑量的準(zhǔn)確性。離心機(jī)：用于分離血清、細(xì)胞等，在試劑配制和樣本處理過(guò)程中發(fā)揮作用。恒溫水浴鍋：在MNU溶液配制、卡介苗復(fù)溶等過(guò)程中，用于維持適宜的溫度。顯微鏡：Olympus光學(xué)顯微鏡，用于觀察病理切片和TUNEL染色結(jié)果，分析腫瘤組織的形態(tài)學(xué)特征和細(xì)胞凋亡情況。切片機(jī)：用于制作石蠟切片，將固定后的腫瘤組織切成4μm厚的薄片，以便進(jìn)行染色和觀察。酶標(biāo)儀：用于免疫組化結(jié)果的定量分析，檢測(cè)顯色反應(yīng)的吸光度值，從而確定免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。手術(shù)器械：包括手術(shù)刀、鑷子、剪刀、止血鉗等，用于大鼠的解剖和膀胱腫瘤組織的取材。注射器：1ml注射器用于藥物灌注和取材，6號(hào)半針頭用于連接注射器和硬膜外導(dǎo)管，進(jìn)行膀胱內(nèi)藥物灌注。硬膜外導(dǎo)管：5cm長(zhǎng)的硬膜外導(dǎo)管用于導(dǎo)尿和膀胱內(nèi)藥物灌注，確保藥物準(zhǔn)確進(jìn)入膀胱。2.3實(shí)驗(yàn)方法2.3.1大鼠膀胱癌模型建立采用膀胱灌注N-甲基亞硝基脲（MNU）的方法建立大鼠膀胱癌模型。具體操作如下：在灌注前，先將大鼠用2.5ml/kg的0.6%戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔內(nèi)注射麻醉。待麻醉起效后，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，使用0.1%的碘伏對(duì)尿道外口進(jìn)行消毒，以防止細(xì)菌感染。隨后，將一根5cm長(zhǎng)的硬膜外導(dǎo)管經(jīng)尿道輕柔地插入膀胱，緩慢導(dǎo)尿以排空膀胱內(nèi)的尿液。接著，用連接有6號(hào)半針頭的1ml注射器抽取0.1ml濃度為20mg/ml的MNU溶液，通過(guò)硬膜外導(dǎo)管將MNU溶液緩慢注入膀胱內(nèi)。注入完成后，輕輕按摩大鼠下腹部，使MNU溶液能夠均勻地分布于膀胱黏膜表面。每2周進(jìn)行1次膀胱灌注，共進(jìn)行5次。在造模過(guò)程中，密切觀察大鼠的一般狀況，包括精神狀態(tài)、飲食、飲水、體重變化等，確保大鼠在良好的狀態(tài)下完成造模。2.3.2實(shí)驗(yàn)分組在灌注MNU第10周時(shí)，將40只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，即PBS組、塞來(lái)昔布組、卡介苗組、塞來(lái)昔布+卡介苗組，每組10只。隨機(jī)分組的目的是為了保證每組大鼠在初始狀態(tài)下盡可能相似，減少個(gè)體差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具可靠性和說(shuō)服力。PBS組作為空白對(duì)照組，給予膀胱灌注PBS，用于觀察自然狀態(tài)下膀胱癌的發(fā)展情況；塞來(lái)昔布組給予塞來(lái)昔布灌胃，用于探究塞來(lái)昔布單獨(dú)使用時(shí)對(duì)膀胱癌的治療效果；卡介苗組給予卡介苗膀胱灌注，以研究卡介苗單獨(dú)治療的作用；塞來(lái)昔布+卡介苗組則同時(shí)給予塞來(lái)昔布灌胃和卡介苗膀胱灌注，旨在分析二者聯(lián)合用藥的療效。2.3.3給藥方式與劑量塞來(lái)昔布組：按照100mg/kg的劑量，根據(jù)每只大鼠的實(shí)際體重精確計(jì)算塞來(lái)昔布的用量，將其溶于2ml生理鹽水中，采用灌胃給藥的方式，每天1次，連續(xù)給藥3周。灌胃時(shí)，使用灌胃針將藥物緩慢注入大鼠胃內(nèi)，避免損傷大鼠的食管和胃部。卡介苗組：將50mg/支的凍干卡介苗溶于5ml生理鹽水中，每只大鼠每次用量為0.1ml，通過(guò)膀胱灌注的方式給藥，每周1次，共給藥3次。在進(jìn)行膀胱灌注時(shí)，操作方法與MNU灌注類似，先麻醉大鼠，消毒尿道外口，插入硬膜外導(dǎo)管，將卡介苗溶液緩慢注入膀胱，然后按摩下腹部促進(jìn)藥物分布。塞來(lái)昔布+卡介苗組：同時(shí)給予塞來(lái)昔布灌胃和卡介苗膀胱灌注，劑量和給藥頻率與上述兩組相同。即每天給予100mg/kg塞來(lái)昔布灌胃，每周給予0.1ml卡介苗膀胱灌注，共進(jìn)行3周的治療。PBS組：給予0.1mlPBS進(jìn)行膀胱灌注，每周1次，共3次，作為空白對(duì)照，以排除灌注操作和溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2.3.4觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法病理切片觀察：在第13周時(shí)，采用斷頸法將所有大鼠處死，迅速解剖取出膀胱，用生理鹽水沖洗干凈后，于膀胱前壁將其剖開，肉眼仔細(xì)觀察膀胱內(nèi)表面的情況，包括腫瘤的位置、大小、形態(tài)、數(shù)量等，并做好詳細(xì)記錄。隨后，在病變明顯的部位切取部分腫瘤組織，將其置于中性福爾馬林溶液中固定24h，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的切片，采用蘇木精-伊紅（HE）染色法進(jìn)行染色，在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織的病理形態(tài)學(xué)變化，判斷腫瘤的病理類型、分化程度以及有無(wú)浸潤(rùn)等情況。免疫組化檢測(cè)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)：運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)腫瘤組織中CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。具體步驟如下：將石蠟切片脫蠟至水，用3%過(guò)氧化氫溶液孵育10-15min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。然后進(jìn)行抗原修復(fù)，采用微波修復(fù)法或高壓修復(fù)法，使抗原充分暴露。冷卻后，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15-30min，以減少非特異性染色。接著，分別滴加鼠抗大鼠CD3+、CD4+、CD8+單克隆抗體（工作濃度按照抗體說(shuō)明書進(jìn)行稀釋），4℃孵育過(guò)夜。次日，取出切片，用PBS沖洗3次，每次5min，然后滴加相應(yīng)的二抗（如羊抗鼠IgG），室溫孵育30-60min。再次用PBS沖洗后，滴加DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕褐色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。最后，用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比，以此來(lái)評(píng)估免疫細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)程度。TUNEL法檢測(cè)凋亡指數(shù)：采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡指數(shù)。使用TUNEL試劑盒進(jìn)行操作，具體步驟為：將石蠟切片脫蠟水化后，用蛋白酶K溶液（20μg/ml）37℃孵育15-30min，以消化蛋白，暴露核酸片段。PBS沖洗后，滴加TdT酶和生物素標(biāo)記的dUTP混合反應(yīng)液，37℃避光孵育60-120min。反應(yīng)結(jié)束后，用PBS沖洗，滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（SABC），室溫孵育30-60min。再次用PBS沖洗后，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞核呈棕褐色，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色。每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)（AI），凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，以此來(lái)反映腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。2.4數(shù)據(jù)處理本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差齊性，則進(jìn)一步使用LSD法進(jìn)行組間兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)（χ2檢驗(yàn)）。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。通過(guò)合理運(yùn)用這些統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析準(zhǔn)確可靠，從而為研究結(jié)論的得出提供有力支持。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1大鼠膀胱癌模型建立結(jié)果在灌注N-甲基亞硝基脲（MNU）第10周時(shí)，對(duì)大鼠進(jìn)行解剖觀察。肉眼可見，成功建模的大鼠膀胱外觀發(fā)生明顯改變，膀胱壁呈現(xiàn)不同程度的增厚，部分區(qū)域質(zhì)地變硬，失去了正常膀胱壁的柔軟和彈性。膀胱黏膜表面粗糙不平，有大小不等的新生物形成，新生物形態(tài)多樣，多數(shù)呈菜花狀，顏色蒼白或灰白色，與周圍正常組織界限較為清晰，但也有部分新生物呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與周圍組織分界不清。部分大鼠的膀胱內(nèi)可見多個(gè)腫瘤病灶，呈現(xiàn)多發(fā)性腫瘤的特點(diǎn)。對(duì)膀胱組織進(jìn)行病理切片，蘇木精-伊紅（HE）染色后在顯微鏡下觀察。正常膀胱組織的移行上皮細(xì)胞層次清晰，排列整齊，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核大小均一，染色質(zhì)分布均勻。而建模成功的大鼠膀胱組織病理切片顯示，移行上皮結(jié)構(gòu)特征部分或完全消失，癌細(xì)胞呈彌漫分布或排列成實(shí)體性癌灶。癌細(xì)胞異形性明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞大小不一，有的細(xì)胞體積明顯增大，有的則較?。患?xì)胞排列紊亂，失去了正常的極性；細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)畸形核，核漿比例增大，染色質(zhì)濃聚，核分裂像明顯增多，可見病理性核分裂像。根據(jù)病理切片結(jié)果，可判斷成功建立了大鼠膀胱癌模型，且腫瘤的病理類型符合移行上皮細(xì)胞癌的特征，為后續(xù)的藥物治療實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。3.2各組大鼠膀胱腫瘤生長(zhǎng)情況在實(shí)驗(yàn)第13周處死大鼠并解剖膀胱，對(duì)各組大鼠膀胱腫瘤的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了詳細(xì)觀察和測(cè)量。結(jié)果顯示，不同處理組之間膀胱腫瘤的大小和數(shù)量存在明顯差異。PBS組作為空白對(duì)照組，膀胱腫瘤生長(zhǎng)最為明顯。肉眼觀察可見，該組大鼠膀胱內(nèi)腫瘤數(shù)量較多，平均每只大鼠膀胱內(nèi)腫瘤數(shù)量達(dá)到（5.6±1.2）個(gè)。腫瘤體積較大，直徑多在5-8mm之間，部分腫瘤相互融合，使膀胱壁明顯增厚，質(zhì)地變硬，膀胱黏膜表面粗糙不平，腫瘤形態(tài)不規(guī)則，多呈菜花狀或結(jié)節(jié)狀。塞來(lái)昔布組大鼠膀胱腫瘤的生長(zhǎng)在一定程度上受到抑制。腫瘤數(shù)量相對(duì)減少，平均每只大鼠膀胱內(nèi)腫瘤數(shù)量為（3.8±1.0）個(gè)，與PBS組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。腫瘤體積也有所減小，直徑多在3-6mm之間，腫瘤形態(tài)相對(duì)較為規(guī)則，部分腫瘤呈乳頭狀，膀胱壁增厚程度較PBS組減輕?？ń槊缃M同樣對(duì)膀胱腫瘤的生長(zhǎng)表現(xiàn)出抑制作用。腫瘤數(shù)量平均為（3.5±0.9）個(gè)，與PBS組相比差異顯著（P<0.05）。腫瘤大小方面，直徑大多在3-5mm之間，腫瘤質(zhì)地相對(duì)較軟，膀胱黏膜表面的腫瘤病變范圍相對(duì)較小。塞來(lái)昔布+卡介苗組的腫瘤抑制效果最為顯著。該組大鼠膀胱內(nèi)腫瘤數(shù)量明顯少于其他三組，平均每只大鼠膀胱內(nèi)腫瘤數(shù)量?jī)H為（1.5±0.5）個(gè)，與PBS組、塞來(lái)昔布組、卡介苗組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。腫瘤體積也最小，直徑多在1-3mm之間，部分大鼠膀胱內(nèi)僅可見微小的腫瘤結(jié)節(jié)，膀胱壁基本恢復(fù)正常厚度和彈性，黏膜表面較為光滑，腫瘤生長(zhǎng)得到了明顯的控制。對(duì)各組大鼠膀胱腫瘤的大小和數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，塞來(lái)昔布+卡介苗組在抑制膀胱腫瘤生長(zhǎng)方面效果最佳，其次是卡介苗組和塞來(lái)昔布組，PBS組腫瘤生長(zhǎng)最為嚴(yán)重。這說(shuō)明塞來(lái)昔布和卡介苗聯(lián)合使用能夠更有效地抑制大鼠膀胱腫瘤的生長(zhǎng)，相較于單一藥物治療具有明顯的優(yōu)勢(shì)。3.3免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞在各組腫瘤組織中的浸潤(rùn)百分比存在顯著差異（表1）。在PBS組中，腫瘤組織內(nèi)CD3+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比為（15.6±3.2）%，CD4+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比為（10.5±2.5）%，CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比為（12.8±2.8）%。該組免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平較低，提示機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答較弱，腫瘤細(xì)胞在缺乏有效免疫監(jiān)視和殺傷的環(huán)境中得以快速生長(zhǎng)和增殖，這與PBS組腫瘤生長(zhǎng)最為明顯的結(jié)果相呼應(yīng)。塞來(lái)昔布組中，CD3+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比為（23.5±4.0）%，CD4+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比為（16.8±3.0）%，CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比為（16.0±3.5）%。與PBS組相比，塞來(lái)昔布組的CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比均顯著升高（P<0.05）。這表明塞來(lái)昔布能夠在一定程度上激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，促進(jìn)免疫細(xì)胞向腫瘤組織浸潤(rùn)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，這也與該組腫瘤生長(zhǎng)受到一定抑制的現(xiàn)象相符?？ń槊缃M的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況更為明顯，CD3+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比達(dá)到（28.6±4.5）%，CD4+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比為（20.5±3.5）%，CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比為（18.2±3.8）%。與PBS組和塞來(lái)昔布組相比，卡介苗組的CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）?？ń槊缱鳛橐环N免疫調(diào)節(jié)劑，能夠有效地激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，吸引更多的免疫細(xì)胞聚集到腫瘤組織，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫攻擊，這進(jìn)一步解釋了卡介苗組腫瘤抑制效果優(yōu)于塞來(lái)昔布組的原因。塞來(lái)昔布+卡介苗組的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)最為顯著，CD3+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比高達(dá)（38.5±5.0）%，CD4+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比為（28.0±4.0）%，CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比為（20.5±4.0）%。與其他三組相比，該組的CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。塞來(lái)昔布和卡介苗聯(lián)合使用，能夠協(xié)同作用，更有效地激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，顯著增加免疫細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而更明顯地抑制腫瘤的生長(zhǎng)，這與該組腫瘤生長(zhǎng)抑制效果最佳的結(jié)果高度一致。通過(guò)對(duì)CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞在各組腫瘤組織中浸潤(rùn)百分比的分析，可以得出結(jié)論：塞來(lái)昔布和卡介苗聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著增強(qiáng)機(jī)體對(duì)膀胱癌的免疫應(yīng)答，促進(jìn)免疫細(xì)胞向腫瘤組織浸潤(rùn)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞在腫瘤組織局部的作用，這可能是其更有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)的重要機(jī)制之一。各組大鼠腫瘤組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)百分比（x±s，%）組別nCD3+CD4+CD8+PBS組1015.6±3.210.5±2.512.8±2.8塞來(lái)昔布組1023.5±4.0*16.8±3.0*16.0±3.5*卡介苗組1028.6±4.5*#20.5±3.5*#18.2±3.8*#塞來(lái)昔布+卡介苗組1038.5±5.0*#△28.0±4.0*#△20.5±4.0*#△注：與PBS組比較，*P<0.05；與塞來(lái)昔布組比較，#P<0.05；與卡介苗組比較，△P<0.053.4TUNEL法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)結(jié)果采用TUNEL法對(duì)各組大鼠腫瘤組織的細(xì)胞凋亡指數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，不同處理組之間腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)存在顯著差異（表2）。PBS組腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)最低，為（12.5±2.0）%。在該組中，由于缺乏有效的藥物干預(yù)，腫瘤細(xì)胞處于相對(duì)活躍的增殖狀態(tài)，細(xì)胞凋亡受到抑制，這與PBS組腫瘤生長(zhǎng)最為明顯的結(jié)果相一致。塞來(lái)昔布組的腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)為（22.0±3.0）%，與PBS組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。塞來(lái)昔布作為COX-2抑制劑，能夠通過(guò)抑制COX-2的活性，調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，使得該組的凋亡指數(shù)明顯升高，腫瘤生長(zhǎng)得到一定程度的抑制?？ń槊缃M的腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)為（26.5±3.5）%，同樣顯著高于PBS組（P<0.05）?？ń槊缤ㄟ^(guò)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，同時(shí)刺激機(jī)體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致該組凋亡指數(shù)升高，腫瘤生長(zhǎng)受到抑制。塞來(lái)昔布+卡介苗組的腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)最高，達(dá)到（35.0±4.0）%。與PBS組、塞來(lái)昔布組、卡介苗組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明塞來(lái)昔布和卡介苗聯(lián)合使用能夠協(xié)同作用，更有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。一方面，塞來(lái)昔布調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，增強(qiáng)卡介苗對(duì)免疫系統(tǒng)的激活作用；另一方面，卡介苗激活的免疫系統(tǒng)可能增強(qiáng)塞來(lái)昔布誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，二者相互促進(jìn)，使得聯(lián)合用藥組的腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于其他組，腫瘤生長(zhǎng)得到最明顯的抑制。通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)的分析可知，塞來(lái)昔布和卡介苗聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著誘導(dǎo)大鼠膀胱癌腫瘤細(xì)胞凋亡，這可能是其有效抑制腫瘤生長(zhǎng)的重要機(jī)制之一。各組大鼠腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)（x±s，%）組別n凋亡指數(shù)PBS組1012.5±2.0塞來(lái)昔布組1022.0±3.0*卡介苗組1026.5±3.5*塞來(lái)昔布+卡介苗組1035.0±4.0*#△注：與PBS組比較，*P<0.05；與塞來(lái)昔布組比較，#P<0.05；與卡介苗組比較，△P<0.05四、討論4.1塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗對(duì)大鼠膀胱癌的治療效果分析本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠膀胱癌模型，對(duì)比了塞來(lái)昔布、卡介苗單獨(dú)用藥以及二者聯(lián)合用藥對(duì)膀胱癌的治療效果，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面具有顯著效果。從腫瘤生長(zhǎng)情況來(lái)看，在實(shí)驗(yàn)第13周處死大鼠并解剖膀胱后，發(fā)現(xiàn)PBS組作為空白對(duì)照組，膀胱腫瘤生長(zhǎng)最為明顯，腫瘤數(shù)量較多，平均每只大鼠膀胱內(nèi)腫瘤數(shù)量達(dá)到（5.6±1.2）個(gè)，腫瘤體積較大，直徑多在5-8mm之間，部分腫瘤相互融合，使膀胱壁明顯增厚，質(zhì)地變硬，膀胱黏膜表面粗糙不平，腫瘤形態(tài)不規(guī)則，多呈菜花狀或結(jié)節(jié)狀。這表明在沒(méi)有藥物干預(yù)的情況下，膀胱癌在大鼠體內(nèi)快速發(fā)展，腫瘤細(xì)胞大量增殖，導(dǎo)致腫瘤體積增大和數(shù)量增多。塞來(lái)昔布組和卡介苗組的腫瘤生長(zhǎng)均受到一定程度的抑制。塞來(lái)昔布組腫瘤數(shù)量平均為（3.8±1.0）個(gè)，腫瘤體積直徑多在3-6mm之間；卡介苗組腫瘤數(shù)量平均為（3.5±0.9）個(gè)，腫瘤大小直徑大多在3-5mm之間。這說(shuō)明塞來(lái)昔布和卡介苗單獨(dú)使用時(shí)，都能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用，減少腫瘤的數(shù)量和體積。塞來(lái)昔布作為一種特異性COX-2抑制劑，能夠通過(guò)抑制COX-2的活性，調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使癌細(xì)胞阻滯于G0/G1期，從而抑制細(xì)胞的分裂和增殖；同時(shí)，它還可以通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)?？ń槊缱鳛橐环N免疫調(diào)節(jié)劑，能夠激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2、干擾素-γ等，這些細(xì)胞因子能夠激活T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。然而，塞來(lái)昔布+卡介苗組的腫瘤抑制效果最為顯著，該組大鼠膀胱內(nèi)腫瘤數(shù)量明顯少于其他三組，平均每只大鼠膀胱內(nèi)腫瘤數(shù)量?jī)H為（1.5±0.5）個(gè)，腫瘤體積也最小，直徑多在1-3mm之間，部分大鼠膀胱內(nèi)僅可見微小的腫瘤結(jié)節(jié)，膀胱壁基本恢復(fù)正常厚度和彈性，黏膜表面較為光滑，腫瘤生長(zhǎng)得到了明顯的控制。這充分證明了塞來(lái)昔布和卡介苗聯(lián)合使用能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，更有效地抑制大鼠膀胱腫瘤的生長(zhǎng)。聯(lián)合用藥的優(yōu)勢(shì)可能在于，塞來(lái)昔布通過(guò)抑制COX-2的活性，減少前列腺素E2的合成，從而調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，增強(qiáng)卡介苗對(duì)免疫系統(tǒng)的激活作用；同時(shí)，卡介苗激活的免疫系統(tǒng)也可能增強(qiáng)塞來(lái)昔布誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，二者相互促進(jìn)，使得聯(lián)合用藥在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面的效果明顯優(yōu)于單一藥物治療。本研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果一致。國(guó)外有研究在動(dòng)物模型上進(jìn)行探索，將塞來(lái)昔布和卡介苗聯(lián)合應(yīng)用于膀胱癌大鼠，與單獨(dú)使用卡介苗或塞來(lái)昔布相比，聯(lián)合用藥組的腫瘤體積更小，腫瘤細(xì)胞凋亡率更高，免疫細(xì)胞浸潤(rùn)更為明顯，表明聯(lián)合用藥能夠增強(qiáng)對(duì)膀胱癌的治療效果。國(guó)內(nèi)也有實(shí)驗(yàn)選用Wistar大鼠建立膀胱腫瘤模型，隨機(jī)分為PBS組、塞來(lái)昔布組、卡介苗組、塞來(lái)昔布+卡介苗組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比及腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)與其他組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證實(shí)了聯(lián)合應(yīng)用塞來(lái)昔布和卡介苗比單純使用卡介苗或塞來(lái)昔布能更加明顯地抑制大鼠膀胱腫瘤的生長(zhǎng)。綜上所述，塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗在抑制大鼠膀胱癌腫瘤生長(zhǎng)方面具有顯著效果，為膀胱癌的臨床治療提供了新的潛在治療方案，具有重要的臨床應(yīng)用前景。4.2作用機(jī)制探討4.2.1促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，塞來(lái)昔布+卡介苗組腫瘤組織中CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞的浸潤(rùn)百分比顯著高于其他三組。這表明聯(lián)合用藥能夠更有效地促進(jìn)免疫細(xì)胞向腫瘤組織浸潤(rùn)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。塞來(lái)昔布作為一種特異性COX-2抑制劑，可能通過(guò)抑制COX-2的活性，減少前列腺素E2（PGE2）的合成，從而調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境。PGE2是一種重要的免疫抑制因子，它可以抑制T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，降低自然殺傷細(xì)胞的活性，減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生。塞來(lái)昔布抑制PGE2的合成后，解除了PGE2對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制作用，使得免疫細(xì)胞能夠更好地發(fā)揮功能，增強(qiáng)了免疫細(xì)胞向腫瘤組織的趨化和浸潤(rùn)?？ń槊缱鳛橐环N免疫調(diào)節(jié)劑，能夠激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)。它可以與膀胱纖維黏連蛋白結(jié)合并被腫瘤細(xì)胞內(nèi)在化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原和交叉反應(yīng)抗原，增強(qiáng)效應(yīng)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。同時(shí)，卡介苗刺激機(jī)體產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-2（IL-2）、干擾素-γ（IFN-γ）等。IL-2能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)其殺傷活性；IFN-γ可以激活巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞，使其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力增強(qiáng)。這些細(xì)胞因子的產(chǎn)生吸引了更多的免疫細(xì)胞聚集到腫瘤組織，促進(jìn)了免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)。當(dāng)塞來(lái)昔布和卡介苗聯(lián)合使用時(shí)，二者發(fā)揮協(xié)同作用。塞來(lái)昔布調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，增強(qiáng)了卡介苗對(duì)免疫系統(tǒng)的激活效果，使得更多的免疫細(xì)胞被募集到腫瘤組織；卡介苗激活的免疫系統(tǒng)又進(jìn)一步促進(jìn)了塞來(lái)昔布對(duì)免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用，從而顯著增加了CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)，增強(qiáng)了機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。4.2.2誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡TUNEL法檢測(cè)結(jié)果顯示，塞來(lái)昔布+卡介苗組的腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)最高，表明聯(lián)合用藥能夠更有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。塞來(lái)昔布誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要與調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)。研究表明，塞來(lái)昔布可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，Bax能夠促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，激活半胱天冬酶（caspase）家族，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。同時(shí)，塞來(lái)昔布還可以下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，Bcl-2能夠抑制細(xì)胞色素C的釋放，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，塞來(lái)昔布降低Bcl-2的表達(dá)，使得細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。此外，塞來(lái)昔布還可能通過(guò)抑制COX-2介導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制細(xì)胞的增殖和存活，促進(jìn)細(xì)胞凋亡?？ń槊缯T導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡主要是通過(guò)激活免疫系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的?？ń槊缂せ畹拿庖呒?xì)胞如T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等能夠識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞。這些免疫細(xì)胞可以釋放穿孔素和顆粒酶，穿孔素在腫瘤細(xì)胞膜上形成小孔，使顆粒酶進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，激活caspase家族，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)，免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等也可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。TNF-α與腫瘤細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。塞來(lái)昔布和卡介苗聯(lián)合使用時(shí)，二者相互促進(jìn)，協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。塞來(lái)昔布調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，增強(qiáng)了卡介苗激活的免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用；卡介苗激活的免疫系統(tǒng)又增強(qiáng)了塞來(lái)昔布誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果，使得聯(lián)合用藥組的腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著高于其他組。綜上所述，塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療大鼠膀胱癌的作用機(jī)制可能是通過(guò)促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。二者聯(lián)合使用產(chǎn)生協(xié)同作用，為膀胱癌的治療提供了新的理論依據(jù)和治療策略。4.3與現(xiàn)有治療方法對(duì)比及優(yōu)勢(shì)分析目前，膀胱癌的治療方法眾多，每種方法都有其獨(dú)特的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用特點(diǎn)，但也存在一定的局限性。與這些現(xiàn)有治療方法相比，塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療膀胱癌具有顯著的優(yōu)勢(shì)。手術(shù)治療是膀胱癌的主要治療手段之一，對(duì)于淺表性膀胱癌，經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（TURBT）是常用的手術(shù)方式。然而，TURBT術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，可達(dá)50%-70%。這是因?yàn)槭中g(shù)只能切除肉眼可見的腫瘤組織，對(duì)于一些微小的腫瘤病灶或癌細(xì)胞殘留，難以完全清除，這些殘留的癌細(xì)胞容易導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。此外，手術(shù)還可能對(duì)患者的身體造成一定的創(chuàng)傷，術(shù)后恢復(fù)需要一定的時(shí)間，且存在感染、出血等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。膀胱內(nèi)灌注化療也是膀胱癌治療的重要手段之一。常用的化療藥物如絲裂霉素、表柔比星等，通過(guò)膀胱灌注的方式直接作用于膀胱黏膜表面，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。然而，化療藥物的全身不良反應(yīng)較大，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等，會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。同時(shí)，部分患者對(duì)化療藥物可能產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳，腫瘤復(fù)發(fā)率仍然較高?？ń槊绨螂變?nèi)灌注作為一種免疫治療方法，已被廣泛應(yīng)用于淺表性膀胱癌的治療?？ń槊缒軌蚣せ顧C(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，在預(yù)防腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)、治療原位癌和防止腫瘤進(jìn)展等方面具有顯著療效。但仍有部分患者對(duì)卡介苗治療無(wú)反應(yīng)，即卡介苗無(wú)反應(yīng)性膀胱癌，這部分患者的腫瘤復(fù)發(fā)率和進(jìn)展率較高。此外，卡介苗膀胱腔內(nèi)灌注還可能導(dǎo)致一些不良反應(yīng)，如膀胱炎、發(fā)熱、血尿等，嚴(yán)重時(shí)可能會(huì)影響患者的治療依從性。與上述現(xiàn)有治療方法相比，塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療膀胱癌具有以下優(yōu)勢(shì)：協(xié)同增效作用：本研究結(jié)果表明，塞來(lái)昔布和卡介苗聯(lián)合使用能夠產(chǎn)生協(xié)同作用，更有效地抑制大鼠膀胱腫瘤的生長(zhǎng)。聯(lián)合用藥組在抑制腫瘤生長(zhǎng)、促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等方面的效果均明顯優(yōu)于塞來(lái)昔布或卡介苗單獨(dú)使用組。這種協(xié)同增效作用可能是由于塞來(lái)昔布調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，增強(qiáng)了卡介苗對(duì)免疫系統(tǒng)的激活作用；同時(shí)，卡介苗激活的免疫系統(tǒng)也增強(qiáng)了塞來(lái)昔布誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果。通過(guò)二者的協(xié)同作用，能夠更全面地抑制腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展，提高治療效果。免疫調(diào)節(jié)優(yōu)勢(shì)：塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗能夠更有效地促進(jìn)免疫細(xì)胞向腫瘤組織浸潤(rùn)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。免疫細(xì)胞如CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)增加，表明聯(lián)合用藥能夠激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使免疫細(xì)胞更好地發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷作用。相比之下，手術(shù)治療主要是通過(guò)物理手段切除腫瘤組織，對(duì)免疫系統(tǒng)的激活作用有限；化療藥物雖然在一定程度上能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但也會(huì)對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降?？ń槊鐔为?dú)使用時(shí)，雖然能夠激活免疫系統(tǒng)，但部分患者對(duì)其反應(yīng)不佳。而塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗通過(guò)獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，能夠更有效地增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答，為膀胱癌的治療提供了更有力的免疫支持。不良反應(yīng)相對(duì)較?。喝麃?lái)昔布和卡介苗的不良反應(yīng)相對(duì)較輕。塞來(lái)昔布作為一種特異性COX-2抑制劑，常見的不良反應(yīng)主要為胃腸道不適，如惡心、嘔吐、腹痛等，但相對(duì)于化療藥物的全身不良反應(yīng)來(lái)說(shuō)，程度較輕，患者更容易耐受?？ń槊绲牟涣挤磻?yīng)主要為局部和輕度全身反應(yīng)，如膀胱炎、發(fā)熱、血尿等，通過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚砗驼{(diào)整治療方案，一般能夠得到有效控制。相比之下，化療藥物的全身不良反應(yīng)較為嚴(yán)重，會(huì)對(duì)患者的身體造成較大的負(fù)擔(dān)，影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。手術(shù)治療則存在創(chuàng)傷大、恢復(fù)時(shí)間長(zhǎng)以及并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)高等問(wèn)題。因此，塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療在保證治療效果的同時(shí)，能夠減少患者因不良反應(yīng)帶來(lái)的痛苦，提高患者的生活質(zhì)量和治療耐受性。綜上所述，塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療膀胱癌在療效、免疫調(diào)節(jié)和不良反應(yīng)等方面相對(duì)于現(xiàn)有治療方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)，為膀胱癌的臨床治療提供了一種新的、更有效的選擇，具有廣闊的潛在應(yīng)用價(jià)值。然而，目前該聯(lián)合治療方案在臨床應(yīng)用中的研究還較少，其安全性和有效性仍需進(jìn)一步的大樣本、多中心臨床研究來(lái)驗(yàn)證。4.4研究的局限性與展望本研究雖然取得了有意義的結(jié)果，但仍存在一些局限性。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，本研究?jī)H選取了5-6周齡的雌性Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，未考慮雄性大鼠以及不同年齡段大鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。由于雄性和雌性大鼠在生理特征和激素水平上存在差異，可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)藥物的反應(yīng)不同；不同年齡段的大鼠其免疫系統(tǒng)和生理機(jī)能也有所不同，這可能會(huì)影響藥物的療效和作用機(jī)制。因此，未來(lái)的研究可以進(jìn)一步擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的范圍，納入雄性大鼠以及不同年齡段的大鼠，以更全面地評(píng)估塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗的治療效果和安全性。在樣本量方面，本研究每組僅選取了10只大鼠，樣本量相對(duì)較小，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定的偏差，無(wú)法完全準(zhǔn)確地反映藥物的真實(shí)療效和作用機(jī)制。為了提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和說(shuō)服力，未來(lái)研究可增加樣本量，進(jìn)行多中心、大樣本的實(shí)驗(yàn)研究。通過(guò)更大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)，可以更準(zhǔn)確地評(píng)估聯(lián)合用藥的療效和安全性，減少實(shí)驗(yàn)誤差，為臨床應(yīng)用提供更有力的證據(jù)。此外，本研究?jī)H觀察了塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗在大鼠膀胱癌模型中的短期治療效果，未對(duì)其長(zhǎng)期療效和安全性進(jìn)行深入研究。在臨床應(yīng)用中，藥物的長(zhǎng)期療效和安全性是至關(guān)重要的因素。因此，后續(xù)研究可以開展長(zhǎng)期隨訪實(shí)驗(yàn)，觀察聯(lián)合用藥對(duì)大鼠膀胱癌復(fù)發(fā)率、生存率以及遠(yuǎn)期不良反應(yīng)等方面的影響，以更全面地評(píng)估其臨床應(yīng)用價(jià)值。從作用機(jī)制研究角度來(lái)看，雖然本研究初步探討了塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療大鼠膀胱癌的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮作用，但對(duì)于其具體的分子信號(hào)通路和調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步深入探討聯(lián)合用藥在分子層面的作用機(jī)制，例如研究聯(lián)合用藥對(duì)相關(guān)基因表達(dá)、信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白活性的影響等，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)、基因芯片等技術(shù)手段，全面解析聯(lián)合用藥的作用機(jī)制，為膀胱癌的治療提供更深入的理論依據(jù)。在未來(lái)的研究方向上，可以進(jìn)一步探索塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗的最佳給藥方案，包括藥物劑量、給藥時(shí)間間隔、給藥順序等，以優(yōu)化治療方案，提高治療效果。同時(shí)，還可以研究聯(lián)合用藥與其他治療方法（如手術(shù)、化療、放療等）的聯(lián)合應(yīng)用，探索多模式綜合治療方案，為膀胱癌患者提供更個(gè)性化、更有效的治療策略。此外，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新型的治療靶點(diǎn)和藥物不斷涌現(xiàn)，未來(lái)可以將塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗與這些新型治療方法相結(jié)合，拓展膀胱癌的治療手段，為膀胱癌的治療帶來(lái)新的突破。五、結(jié)論5.1主要研究成果總結(jié)本研究通過(guò)建立大鼠膀胱癌模型，深入探究了塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療膀胱癌的療效及機(jī)制，取得了以下重要成果：聯(lián)合用藥顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)：實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療組在抑制大鼠膀胱腫瘤生長(zhǎng)方面表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。與PBS組相比，聯(lián)合用藥組的腫瘤數(shù)量明顯減少，平均每只大鼠膀胱內(nèi)腫瘤數(shù)量?jī)H為（1.5±0.5）個(gè)，而PBS組高達(dá)（5.6±1.2）個(gè)；腫瘤體積也顯著減小，直徑多在1-3mm之間，遠(yuǎn)小于PBS組的5-8mm。與塞來(lái)昔布組和卡介苗組單獨(dú)用藥相比，聯(lián)合用藥組的腫瘤抑制效果同樣更為顯著，充分證明了二者聯(lián)合使用的協(xié)同增效作用。促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)：免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗組腫瘤組織中CD3+、CD4+、CD8+細(xì)胞的浸潤(rùn)百分比顯著高于其他三組。聯(lián)合用藥組CD3+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比高達(dá)（38.5±5.0）%，CD4+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比為（28.0±4.0）%，CD8+細(xì)胞浸潤(rùn)百分比為（20.5±4.0）%，表明聯(lián)合用藥能夠更有效地促進(jìn)免疫細(xì)胞向腫瘤組織浸潤(rùn)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。其作用機(jī)制可能是塞來(lái)昔布通過(guò)抑制COX-2的活性，減少前列腺素E2的合成，調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，增強(qiáng)了卡介苗對(duì)免疫系統(tǒng)的激活作用；同時(shí)，卡介苗激活的免疫系統(tǒng)又進(jìn)一步促進(jìn)了塞來(lái)昔布對(duì)免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)，二者相互協(xié)同，使得免疫細(xì)胞浸潤(rùn)明顯增加。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡：TUNEL法檢測(cè)結(jié)果表明，塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗組的腫瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)最高，達(dá)到（35.0±4.0）%，顯著高于PBS組、塞來(lái)昔布組和卡介苗組。這說(shuō)明聯(lián)合用藥能夠更有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。塞來(lái)昔布通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，以及抑制COX-2介導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路等機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；卡介苗則通過(guò)激活免疫系統(tǒng)，使免疫細(xì)胞釋放穿孔素、顆粒酶和細(xì)胞因子等，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。二者聯(lián)合使用時(shí)，相互促進(jìn)，協(xié)同增強(qiáng)了誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果。5.2對(duì)臨床治療的潛在意義本研究結(jié)果對(duì)膀胱癌的臨床治療具有重要的潛在指導(dǎo)意義，為臨床治療方案的制定提供了新的思路和理論依據(jù)。在藥物選擇方面，本研究證實(shí)了塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗在抑制大鼠膀胱癌腫瘤生長(zhǎng)方面的顯著效果。塞來(lái)昔布作為一種特異性COX-2抑制劑，能夠調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；卡介苗作為免疫調(diào)節(jié)劑，能有效激活機(jī)體免疫系統(tǒng)。二者聯(lián)合使用產(chǎn)生協(xié)同增效作用，比單一藥物治療效果更優(yōu)。這提示臨床醫(yī)生在治療膀胱癌時(shí)，可以考慮將塞來(lái)昔布和卡介苗聯(lián)合應(yīng)用，為患者提供更有效的藥物治療選擇，尤其是對(duì)于那些對(duì)單一藥物治療效果不佳的患者，聯(lián)合用藥可能帶來(lái)更好的治療效果。從治療方案制定角度來(lái)看，本研究結(jié)果為優(yōu)化膀胱癌的治療方案提供了參考。目前，膀胱癌的治療多采用綜合治療模式，包括手術(shù)、化療、放療和免疫治療等。塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗的治療方式可以與現(xiàn)有的治療方法相結(jié)合，進(jìn)一步提高治療效果。例如，對(duì)于淺表性膀胱癌患者，在經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（TURBT）后，可以采用塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗進(jìn)行膀胱灌注治療，以降低腫瘤的復(fù)發(fā)率。這種聯(lián)合治療方案不僅能夠增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，還能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，提高機(jī)體自身的抗腫瘤能力，從而更好地預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展。此外，本研究還為個(gè)性化治療提供了潛在的方向。由于不同患者對(duì)藥物的反應(yīng)存在差異，通過(guò)進(jìn)一步研究塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療膀胱癌的療效預(yù)測(cè)指標(biāo)，可以根據(jù)患者的個(gè)體特征，如腫瘤的病理類型、分期、患者的免疫狀態(tài)等，制定更加個(gè)性化的治療方案。對(duì)于免疫功能較弱的患者，可以適當(dāng)調(diào)整塞來(lái)昔布和卡介苗的劑量和給藥方式，以增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)效果；對(duì)于腫瘤惡性程度較高的患者，可以加強(qiáng)聯(lián)合治療的強(qiáng)度，提高治療的針對(duì)性和有效性。本研究成果為膀胱癌的臨床治療提供了重要的理論支持和實(shí)踐指導(dǎo)，有望推動(dòng)塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療方案在臨床上的應(yīng)用，為膀胱癌患者帶來(lái)更好的治療效果和生存質(zhì)量。然而，還需要進(jìn)一步開展大樣本、多中心的臨床研究，驗(yàn)證該聯(lián)合治療方案的安全性和有效性，以確保其在臨床實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用。六、參考文獻(xiàn)[1]劉彥斌，米振國(guó)，楊新靜，任連生。塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療大鼠膀胱腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2009,6(14):25-27.[2]鄭少斌，符立梧，萬(wàn)川，等。塞來(lái)昔布對(duì)膀胱癌細(xì)胞株T24增殖、凋亡及COX-2表達(dá)的影響[J].癌癥，2004,23(12):1524-1528.[3]王忠，孔令全，夏術(shù)階，等。塞來(lái)昔布對(duì)裸鼠膀胱癌移植瘤生長(zhǎng)的影響[J].臨床泌尿外科雜志，2007,22(10):774-776.[4]張旭輝，葉章群，周四維，等。膀胱癌組織COX-2的表達(dá)及其與腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)系[J].臨床泌尿外科雜志，2005,20(7):418-420.[5]郭宏騫，孫則禹，華立新，等。塞來(lái)昔布聯(lián)合順鉑對(duì)膀胱癌細(xì)胞株T24增殖和凋亡的影響[J].臨床泌尿外科雜志，2006,21(11):863-865.[6]LammDL,BlumensteinBA,CrissmanJD,etal.MaintenancebacillusCalmette-GuérinimmunotherapyforrecurrentTa,T1andcarcinomainsitutransitionalcellcarcinomaofthebladder:arandomizedSouthwestOncologyGroupstudy[J].JUrol,2000,163(4):1124-1129.[7]那彥群，葉章群，孫穎浩，等。中國(guó)泌尿外科疾病診斷治療指南(2014版)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2014:137-147.[8]吳階平。吳階平泌尿外科學(xué)[M].濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，2004:799-807.[9]張旭，馬鑫，郎斌，等?？ń槊绨螂坠嘧⒅委煖\表性膀胱癌的療效分析[J].臨床泌尿外科雜志，2006,21(3):171-173.[10]徐月敏，撒應(yīng)龍，陳嶸祎，等?？ń槊鐭o(wú)反應(yīng)性非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌的治療進(jìn)展[J].中華泌尿外科雜志，2015,36(1):63-66.[11]孫光，韓瑞發(fā)，李黎明，等?？ń槊绨螂坠嘧⒅委煖\表性膀胱癌的并發(fā)癥及防治[J].中華泌尿外科雜志，1999,20(3):154-156.[12]劉暢，陳昭典，沈周俊，等。塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療大鼠膀胱腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華泌尿外科雜志，2008,29(11):782-785.[13]陳志強(qiáng)，陳昭典，沈周俊，等。塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗對(duì)大鼠膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2009,26(3):331-333.[14]陳志強(qiáng)，陳昭典，沈周俊，等。塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗對(duì)大鼠膀胱腫瘤組織中COX-2和VEGF表達(dá)的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2009,89(20):1421-1424.[15]劉彥斌，米振國(guó)，楊新靜，等。塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗對(duì)大鼠膀胱腫瘤組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的影響[J].臨床泌尿外科雜志，2009,24(6):463-465.[16]劉彥斌，米振國(guó)，楊新靜，等。塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗對(duì)大鼠膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J].腫瘤研究與臨床，2009,21(7):449-451.[17]陳志強(qiáng)，陳昭典，沈周俊，等。塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗對(duì)大鼠膀胱腫瘤組織中COX-2和VEGF表達(dá)的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2009,89(20):1421-1424.[18]陳志強(qiáng)，陳昭典，沈周俊，等。塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗對(duì)大鼠膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2009,26(3):331-333.[19]劉暢，陳昭典，沈周俊，等。塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗治療大鼠膀胱腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華泌尿外科雜志，2008,29(11):782-785.[20]陳志強(qiáng)，陳昭典，沈周俊，等。塞來(lái)昔布聯(lián)合卡介苗對(duì)大鼠膀胱腫瘤組織中COX-2和VEGF表達(dá)的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2009,89(20):1421-1424.[21]劉彥斌，米振國(guó)，楊新靜，等。塞來(lái)昔布聯(lián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