ICS65.020.30CCSB43NXSLX寧夏飼料工業(yè)協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/NXSLX0207—2025牛體細(xì)胞體外培養(yǎng)與冷凍保存操作規(guī)程Operatingrulesforinvitrocultureandcryopreservationofbovinesomaticcells2025-11-7發(fā)布 2025-12-7實(shí)施寧夏飼料工業(yè)協(xié)會(huì)??發(fā)布T/NXSLX0207T/NXSLX0207—2025前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由寧夏大學(xué)提出。本文件由寧夏飼料工業(yè)協(xié)會(huì)歸口。本文件起草單位：寧夏大學(xué)、寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所、吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)、西北農(nóng)林科技大學(xué)、海原縣科學(xué)技術(shù)局、固原富民農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司本文件主要起草人：魏大為、姜超、張久盤、宋雅萍、馬云、張娟、房義、黃永震、田平、張令鍇、胡亞美、聶路瑋、焦若普、楊東梅、龔紅芳、馬藝倫、何學(xué)亮、咸海龍IT/NXSLX0207T/NXSLX0207—2025PAGEPAGE1牛體細(xì)胞體外培養(yǎng)與冷凍保存操作規(guī)程范圍本文件規(guī)定了牛體細(xì)胞（主要為耳緣組織成纖維細(xì)胞）體外培養(yǎng)與冷凍保存操作的術(shù)語(yǔ)和定義、技術(shù)要求、質(zhì)量檢測(cè)、記錄檔案管理和注意事項(xiàng)。本文件適用于牛體細(xì)胞分離培養(yǎng)與冷凍保存操作。規(guī)范性引用文件（且相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照GB/T35892標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行）。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T35892實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查指南GB/T42466生物樣本庫(kù)多能干細(xì)胞管理技術(shù)規(guī)范GB/T24863畜禽細(xì)胞體外培養(yǎng)與冷凍保存技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1900畜禽細(xì)胞與胚胎冷凍保種技術(shù)規(guī)范術(shù)語(yǔ)和定義GB/T24863和NY/T1900界定的術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。技術(shù)要求組織樣本采集牛只準(zhǔn)備確認(rèn)牛只身份，記錄品種、年齡、性別等信息。組織采集按照GB/T24863的規(guī)定對(duì)牛耳緣組織進(jìn)行消毒處理，然后用無(wú)菌活檢打孔器（直徑6-8mm）或無(wú)菌手術(shù)剪采集組織塊，用無(wú)菌紗布按壓傷口止血。樣本處理樣本組織塊用75%酒精涮洗30s后，用無(wú)菌且含5%雙抗（青霉素、鏈霉素）的PBS溶液清洗3遍，再將組織放入預(yù)冷的、含2%雙抗的PBS溶液的無(wú)菌離心管中保存。樣本運(yùn)輸在4℃條件下盡快運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，最長(zhǎng)不應(yīng)超過(guò)24h。原代細(xì)胞培養(yǎng)準(zhǔn)備操作所有操作均在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行，使用無(wú)菌器械和耗材。在培養(yǎng)皿中用含3%雙抗的PBS溶液反復(fù)沖洗組織塊，直至清洗液清澈。組織塊法分離將組織塊剪成約1mm3的小塊，均勻貼附于細(xì)胞培養(yǎng)瓶底，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶使組織塊在上，于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6h，待組織塊稍干涸貼壁后，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入完全培養(yǎng)基（10%FBS+1%雙抗+89%DMEM/Highglucose），使其完全覆蓋組織塊。此時(shí)記為分離第0110組織塊四周均出現(xiàn)細(xì)胞時(shí)，去除組織塊，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，之后每2天更換一次培養(yǎng)基。酶消化法分離使用膠原酶濃度在37℃消化組織塊1～220%的高糖DMEM培養(yǎng)16h后，更換培養(yǎng)基，觀察細(xì)胞形態(tài)。傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。棄去舊培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次。加入適量0.25%胰蛋白酶消化液，于37℃消化1～3min。在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓、間隙增胞懸液移入離心管，1000rpm離心5min。棄去上清，用新鮮完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。按1：2至1：3的比例將細(xì)胞懸液接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充足量培養(yǎng)基，放入CO?培養(yǎng)箱，每2天更換一次培養(yǎng)基。細(xì)胞冷凍保存細(xì)胞凍存操作（建議在第3～5代進(jìn)行凍存1×106～5×106cells/mL將1.0～1.5mL細(xì)胞懸液分裝至標(biāo)注清晰的專用細(xì)胞凍存管中（標(biāo)注內(nèi)容：牛只ID、代次、凍存日期）。細(xì)胞凍存方式若有程序降溫盒，將凍存管立即放入充滿異丙醇的程序降溫盒中，于-80℃冰箱中放置18～24-1℃/min4℃30min→-20℃2h→-80℃過(guò)夜。24h內(nèi)將凍存管從-80℃轉(zhuǎn)移至液氮罐中長(zhǎng)期保存。細(xì)胞復(fù)蘇37℃1min內(nèi)完全融化。用酒精消毒凍存管外壁，在安全柜中打開。將細(xì)胞懸液緩慢轉(zhuǎn)移至含5mL預(yù)rpm離心5DMSO用新鮮完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種至培養(yǎng)瓶/皿中，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24h后更換一次培養(yǎng)基，以進(jìn)一步去除死細(xì)胞和碎片。質(zhì)量檢測(cè)無(wú)菌檢測(cè)：定期取培養(yǎng)上清液進(jìn)行細(xì)菌、真菌和支原體檢測(cè)。細(xì)胞鑒定：可通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察（成纖維樣細(xì)胞形態(tài)）及種屬特異性PCR進(jìn)行鑒定。存活率檢測(cè)：凍存前和復(fù)蘇后均需使用臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行細(xì)胞活率計(jì)數(shù)，復(fù)蘇后活率應(yīng)高于85%。記錄檔案管理參考GB/T42466，詳細(xì)記錄每份樣本的供體牛信息、細(xì)胞分離日期、凍存情況和復(fù)蘇情況，建立電子和紙質(zhì)雙重檔案系統(tǒng)，詳見附錄A。注意事項(xiàng)操作液氮時(shí)需佩戴防凍手套和護(hù)目鏡，防止凍傷。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持良好通風(fēng)，防止液氮大量蒸發(fā)導(dǎo)致缺氧。嚴(yán)格遵守GB19489的生物安全規(guī)程，妥善處理廢棄物及污染材料。附錄A（資