ICS65.020.30CCSB43NXSLX寧夏飼料工業(yè)協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/NXSLX0211—2025肉牛精液冷凍保存技術(shù)規(guī)范TechnicalSpecificationforCryopreservationofCattleSemen2025-11-7發(fā)布 2025-12-7實(shí)施寧夏飼料工業(yè)協(xié)會(huì)??發(fā)布T/NXSLX0211T/NXSLX0211—2025前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由寧夏大學(xué)提出。本文件由寧夏飼料工業(yè)協(xié)會(huì)歸口。本文件起草單位：寧夏大學(xué)、固原富民農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司、西北農(nóng)林科技大學(xué)。本文件主要起草人：張令鍇、王娜娜、魏大為、胡亞美、馬云、金昊延、聶路瑋、陶金忠、何學(xué)良、咸海龍、黃永震、劉佳妮、解雅茹。IT/NXSLX0211T/NXSLX0211—2025PAGEPAGE10肉牛精液冷凍保存技術(shù)規(guī)范范圍解凍、記錄與檔案管理以及安全注意事項(xiàng)。本文件適用于有肉牛冷凍精液保存需求的場(chǎng)景。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文件中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4143 牛冷凍精液GB/T31581牛性控冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)GB14925 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境及設(shè)施GB19489 實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要NY/T815 肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)《家畜人工授精技術(shù)規(guī)范》術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。肉牛冷凍精液CattleFrozenSemen（-196℃）的肉牛種用精液。基本要求場(chǎng)地要求應(yīng)具備獨(dú)立的采精大廳、精液處理實(shí)驗(yàn)室（潔凈區(qū)）、精液冷凍與儲(chǔ)存區(qū)。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件應(yīng)符合GB14925中相關(guān)潔凈度要求。人員要求操作人員應(yīng)經(jīng)過(guò)專業(yè)技術(shù)培訓(xùn)，熟練掌握精液冷凍保存的操作規(guī)程。設(shè)備要求應(yīng)配備假陰道、采精架等采精設(shè)備；恒溫水浴槽、顯微鏡（帶恒溫臺(tái)和相差功能）、電子天平、pH（CASA）（儲(chǔ)存罐和運(yùn)輸罐）（見(jiàn)附AA.2）。生物安全精液處理實(shí)驗(yàn)室應(yīng)潔凈、無(wú)塵，定期消毒。操作臺(tái)面溫度應(yīng)維持在18℃-25℃。實(shí)驗(yàn)室生物安全管理應(yīng)符合GB19489的規(guī)定。操作流程與技術(shù)要點(diǎn)采精前的準(zhǔn)備種公牛管理NY/T816采精前應(yīng)對(duì)其外生殖器進(jìn)行清潔。器械準(zhǔn)備所有接觸精液的器械必須嚴(yán)格消毒，使用前用經(jīng)滅菌的稀釋液沖洗。假陰道內(nèi)膽溫度應(yīng)保持在42℃±2℃。精液采集采用假陰道法采集精液，操作應(yīng)符合《家畜人工授精技術(shù)規(guī)范》要求。操作應(yīng)溫和、迅速，避免對(duì)種公牛造成應(yīng)激和精液污染。精液保存采集的精液應(yīng)迅速置于37℃±1℃恒溫水浴槽中，并在30分鐘內(nèi)進(jìn)行品質(zhì)檢查。精液品質(zhì)檢查感官檢查正常精液呈乳白色或淡黃色，略有腥味，無(wú)雜質(zhì)?；盍z查取一滴精液在37℃±1℃預(yù)熱的載玻片上，置于帶有恒溫臺(tái)的顯微鏡下評(píng)估直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子的百分比。原精活力低于70%者應(yīng)廢棄（見(jiàn)附錄表B表B.1）。密度檢查使用精子密度儀或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行測(cè)定?；温蕶z查使用精子計(jì)數(shù)板和計(jì)算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（CASA），計(jì)算形態(tài)異常精子比例?；温食^(guò)15%的精液應(yīng)廢棄（見(jiàn)附錄表B表B.1）。精液稀釋（如（AGB/T31581其稀釋應(yīng)遵循GB4143要求：稀釋液溫度必須與精液溫度一致（37℃±1℃）；先以不含甘油的基礎(chǔ)液進(jìn)行第一次稀釋，緩慢降溫至4-5℃后，再加入等溫的含甘油稀釋液進(jìn)行第二次稀釋（見(jiàn)附錄表C表C.1）。平衡與灌裝平衡4-52-4灌裝與封口使用精液灌裝機(jī)將平衡后的精液分裝至無(wú)毒塑料細(xì)管內(nèi)，并精確封口。在細(xì)管上標(biāo)明公牛號(hào)、采集日期、品種等信息，標(biāo)識(shí)應(yīng)清晰、耐久。冷凍4-54℃4-6℃的速率降至-10℃，10-15℃的速率降至-100℃最后迅速投入液氮（-196℃）中保存（CC.1）。精子復(fù)蘇率檢查隨機(jī)抽取每批次冷凍精液的細(xì)管（抽樣比例不低于3%），在37-40℃水浴中快速解凍（1537℃±1℃35%廢棄（AA.1）。儲(chǔ)存與運(yùn)輸儲(chǔ)存經(jīng)檢驗(yàn)合格的冷凍精液必須儲(chǔ)存于-196℃的液氮中。儲(chǔ)存液氮罐應(yīng)放置在安全、通風(fēng)的室內(nèi)，定期檢查液氮量，確保精液始終浸沒(méi)在液氮面以下。液氮量少于總?cè)萘咳种粫r(shí)應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充（見(jiàn)附錄表A表A.2）。登記建立完善的庫(kù)存檔案，詳細(xì)記錄每頭公牛的精液儲(chǔ)存位置、數(shù)量、品質(zhì)等信息。運(yùn)輸運(yùn)輸條件應(yīng)保證精液質(zhì)量不受影響（AA.2）。記錄與檔案管理精液采集記錄日期、采精量）、精液品質(zhì)檢查記錄活力、密度、畸形率、冷凍精液（液氮添加記錄（BB.2B.3）。所有記錄應(yīng)真實(shí)、準(zhǔn)確、完整，并至少保存5年以上，以備追溯。安全注意事項(xiàng)操作液氮時(shí)需佩戴防凍手套和護(hù)目鏡，防止凍傷。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持良好通風(fēng)，防止液氮大量蒸發(fā)導(dǎo)致缺氧。嚴(yán)格遵守GB19489的生物安全規(guī)程，妥善處理廢棄精液及污染材料。附錄A（資料性）冷凍精液稀釋劑配方及所需試劑耗材種公牛冷凍精液保存稀釋劑配方及試劑耗材種公牛冷凍精液保存稀釋劑配方及試劑耗材見(jiàn)表A.1。表A.1精液冷凍保存常用添加劑和耗材類別 名稱 關(guān)鍵技術(shù)參考終濃度4%根據(jù)精液稀釋液配方調(diào)整甘油99.5%。卵黃（無(wú)菌）

終濃度10%-20%，需取自健康無(wú)疫病母雞，經(jīng)離心除菌。添加劑

青霉素-鏈霉素混合液

終濃度：青霉素1000-2000IU/mL，鏈霉素1000-2000μg/mL。檸檬酸鈉 濃度0.05-0.1mol/L，純度≥99.0%。蔗糖 終濃度1%-3%，純度≥99.5%。無(wú)菌離心管

材質(zhì)為聚丙烯（PP），耐低溫（-80℃至121℃），無(wú)菌無(wú)酶。精液冷凍細(xì)管耗材

材質(zhì)為聚乙烯，內(nèi)壁光滑無(wú)雜質(zhì)，密封性能良好，可耐受-196℃至37℃溫差。一次性無(wú)菌移液槍頭 材質(zhì)為聚丙烯，無(wú)菌無(wú)RNA酶/DNA酶。精子計(jì)數(shù)板 一樣一用，不得混用。種公牛精液冷保存所需儀器表種公牛精液冷保存所需儀器見(jiàn)表A.2。表A.2精液冷凍保存儀器表儀器名稱 關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)生物顯微（帶CASA） 配備相差物鏡；載物臺(tái)溫度可調(diào)控（37±0.5℃）。精液密度儀

測(cè)量范圍101000×10?個(gè)（2025℃）檢測(cè)。高速離心機(jī)

最大轉(zhuǎn)速≥10000r/min，離心容量支持50mL離心管；控溫范圍4-25℃。恒溫水浴鍋 控溫精度±0.1℃；水浴槽容積≥5L。液氮罐

靜態(tài)蒸發(fā)率≤1.5L/天（10L規(guī)格），真空度≥10?3Pa；配備提筒和標(biāo)尺。程序降溫儀

降溫范圍-196℃至室溫，降溫速率調(diào)節(jié)精度±0.5℃/min；可存儲(chǔ)≥10組程序。電子天平 最大稱量≥200g，分度值0.001g；支持防風(fēng)罩設(shè)計(jì)。pH計(jì) 測(cè)量范圍0-14精度±0.01pH；支持溫度補(bǔ)。附錄B（資料性）種公牛精液品質(zhì)檢查種公牛精液品質(zhì)檢查標(biāo)準(zhǔn)種公牛精液品質(zhì)檢查標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表B.1。表B.1精液品質(zhì)評(píng)定參考標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目?jī)?yōu)質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)合格標(biāo)準(zhǔn)廢棄標(biāo)準(zhǔn)原精活力≥80%≥70%<70%精子畸形率≤10%≤15%>15%凍后活力≥45%≥35%<35%（GB4143）種公牛精液品質(zhì)檢查記錄種公牛精液品質(zhì)檢查記錄見(jiàn)表B.2表B.2種公牛精液品質(zhì)檢查記錄表采精日期種公牛號(hào)采精員精液量顏色氣味pH精子活率精子密度（億 ）畸形精子率（）總精子數(shù)億稀釋后總量稀釋液量頭份數(shù)檢驗(yàn)員備注種公牛冷凍精液稀釋液使用記錄種公牛冷凍精液稀釋液記錄見(jiàn)表B.3表B.3種公牛冷凍精液稀釋液使用記錄表使用日期精液來(lái)源稀釋液型號(hào)批次原始精液量稀釋液使用量稀釋比例稀釋后總量稀釋后精子活力（）儲(chǔ)存條件用途操作人員備注附錄C（資料性）種公牛精液冷凍程序C.1種公牛精液冷凍程序種公牛精液冷凍程序見(jiàn)表C.1。表C.1精液梯度冷凍程序表冷凍階段起始溫度目標(biāo)溫度降溫速率（℃/min）持續(xù)時(shí)間（min）團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)參考要求室溫平衡溫度需穩(wěn)定在4±平衡階段（20-4℃1-230-600.5℃，平衡時(shí)間不低于25℃）30min。預(yù)冷凍1段4℃-10℃2-35-8降溫速率波動(dòng)