增生平抑制胃癌形成的多維度作用機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一，其發(fā)病率和死亡率在各類惡性腫瘤中一直名列前茅。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全球新增胃癌病例約108.9萬例，死亡病例約76.9萬例，在癌癥相關(guān)死亡原因中位列第四。在我國(guó)，胃癌同樣是高發(fā)的惡性腫瘤，發(fā)病率約占所有消化道惡性腫瘤的一半，死亡率居各類癌癥之首，給社會(huì)和居民帶來了沉重的疾病負(fù)擔(dān)。胃癌的發(fā)生是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過程，其中胃癌前病變（precancerouslesionsofgastriccancer，PLGC）是正常胃黏膜向胃癌轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵階段，主要指胃黏膜較正常組織更容易發(fā)生癌變的病理變化，如慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生和異型增生等。值得慶幸的是，PLGC這一過程具有可逆性，若能在該階段對(duì)患者進(jìn)行及時(shí)有效的干預(yù)治療，就有可能阻斷其向胃癌的發(fā)展，從而顯著降低胃癌的發(fā)病率與死亡率。中醫(yī)藥在防治疾病方面有著悠久的歷史和獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，對(duì)于胃癌前病變的治療也積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。大量臨床研究表明，中藥在改善患者癥狀、調(diào)節(jié)機(jī)體功能、抑制病變發(fā)展等方面具有顯著效果。增生平作為一種純中藥制劑，由山豆根、拳參、白鮮皮、夏枯草、北敗醬草、黃藥子等六味中藥組成，具有清熱解毒、化瘀散結(jié)的功效。既往研究證實(shí)，增生平在食管癌前病變的阻斷及食管癌的治療中發(fā)揮了重要作用，近年來其應(yīng)用范圍逐漸拓展至胃癌等其他腫瘤的防治領(lǐng)域，且在抑制胃癌形成方面展現(xiàn)出較好的療效。然而，目前關(guān)于增生平抑制胃癌形成的作用機(jī)理尚不明確，這在一定程度上限制了其臨床應(yīng)用和推廣。深入探究增生平抑制胃癌形成的機(jī)理，不僅有助于揭示其防治胃癌的科學(xué)內(nèi)涵，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)，提高胃癌的防治水平，降低胃癌的發(fā)病率和死亡率，減輕患者痛苦和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還能進(jìn)一步豐富中醫(yī)藥防治腫瘤的理論體系，推動(dòng)中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程，促進(jìn)中醫(yī)藥在腫瘤防治領(lǐng)域的國(guó)際交流與合作，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在胃癌形成機(jī)制的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了豐碩成果。國(guó)外在胃癌的分子生物學(xué)、免疫治療和靶向治療等領(lǐng)域成績(jī)斐然。研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)生與多種基因的突變緊密相關(guān)，如TP53、APC、KRAS等抑癌基因的失活和癌基因的激活，這些基因突變會(huì)致使細(xì)胞增殖失控和凋亡受阻，進(jìn)而推動(dòng)胃癌的發(fā)生。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）在胃癌組織中的過表達(dá)與胃癌的惡性程度、侵襲性和預(yù)后不良相關(guān)，針對(duì)EGFR的靶向治療已成為胃癌治療的研究熱點(diǎn)。此外，幽門螺桿菌感染是胃癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素之一，它可導(dǎo)致胃黏膜慢性炎癥、萎縮和腸上皮化生等病變，最終可能演變?yōu)槲赴Ｎ葛つp傷與修復(fù)失衡也是胃癌發(fā)生的重要機(jī)制之一，各種致病因素如幽門螺桿菌感染、飲食因素等導(dǎo)致胃黏膜損傷，而損傷的修復(fù)過程中可能出現(xiàn)細(xì)胞增殖和分化異常，最終形成胃癌。同時(shí)，胃癌細(xì)胞通過多種機(jī)制逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除，從而得以生存和增殖，這些機(jī)制包括下調(diào)腫瘤相關(guān)抗原的表達(dá)、分泌免疫抑制因子等。在免疫逃逸機(jī)制、侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制等方面的研究也不斷深入，為胃癌的防治提供了新的思路和靶點(diǎn)。國(guó)內(nèi)在胃癌的流行病學(xué)、病因?qū)W、病理學(xué)和診斷治療等方面也取得了一定的成果。研究表明，環(huán)境和飲食因素、感染因素、宿主自身的因素均與胃癌密切相關(guān)。亞硝胺致病是胃癌發(fā)病的經(jīng)典學(xué)說，胃液中亞硝酸鹽的含量與胃癌的發(fā)病率明顯相關(guān)，不當(dāng)飲食、吸煙等會(huì)使人們暴露在亞硝基化合物的影響中，增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。高鹽飲食、缺乏新鮮蔬菜水果攝入等也是胃癌的危險(xiǎn)因素，喜食高鹽食物的人群，發(fā)生胃癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于其他人群。此外，中醫(yī)對(duì)胃癌的認(rèn)識(shí)歷史悠久，認(rèn)為胃癌的發(fā)生多與正氣虧虛、痰瘀互結(jié)、熱毒內(nèi)蘊(yùn)等因素有關(guān)，在胃癌的治療中，中醫(yī)強(qiáng)調(diào)辨證論治，通過扶正祛邪、調(diào)理臟腑等方法，改善患者癥狀，提高生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期。關(guān)于增生平抑制胃癌形成的研究，國(guó)內(nèi)有部分臨床和實(shí)驗(yàn)研究。臨床研究方面，有醫(yī)院采用增生平治療經(jīng)電子胃鏡檢查、活檢病理確診為萎縮性胃炎、腸上皮化生、胃粘膜不典型增生患者，結(jié)果顯示增生平在改善患者癥狀、抑制病變發(fā)展等方面具有一定效果。實(shí)驗(yàn)研究方面，通過連續(xù)飲用N-***-N’-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）溶液另加定時(shí)灌胃的方法誘導(dǎo)Wistar大鼠建立胃粘膜癌前病變模型，研究發(fā)現(xiàn)增生平能夠降低PCNA、cyclinDl及CDK4蛋白表達(dá)水平，從而對(duì)胃粘膜的癌前病變有較好的阻斷作用；能夠抑制β-catenin蛋白與c-mycmRNA的表達(dá)，并能上調(diào)GSK-3β蛋白表達(dá)水平，從而對(duì)Wnt通路起到良性的調(diào)節(jié)作用；能夠抑制IL-10和TGF-βmRNA及蛋白的表達(dá)水平并能促進(jìn)IL-2mRNA及蛋白的表達(dá)，同時(shí)能夠上調(diào)CD4+CD8+T細(xì)胞比率，從而在胃粘膜癌前病變形成過程中增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用。然而，目前的研究仍存在一些不足與空白。在增生平抑制胃癌形成的研究中，相關(guān)基礎(chǔ)研究仍局限在探究其對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)相關(guān)分子表達(dá)的影響，其在腫瘤微環(huán)境當(dāng)中的作用仍有待進(jìn)一步闡釋。臨床研究大多存在患者數(shù)少，研究設(shè)計(jì)缺乏嚴(yán)謹(jǐn)性等問題，故多中心、大樣本的隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)還有待進(jìn)一步展開。此外，對(duì)于增生平中各成分協(xié)同作用的機(jī)制研究較少，如何優(yōu)化配方以提高其療效和安全性也需要深入探討。在胃癌形成機(jī)制的研究中，雖然已明確多種相關(guān)因素，但各因素之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)尚未完全清晰，仍需進(jìn)一步深入研究，以便為增生平及其他藥物的作用機(jī)制研究提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究增生平抑制胃癌形成的作用機(jī)理，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，具體目標(biāo)如下：一是從細(xì)胞和分子水平揭示增生平對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、周期調(diào)控的影響及相關(guān)信號(hào)通路的作用機(jī)制；二是探討增生平對(duì)胃癌微環(huán)境中免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用，明確其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制；三是分析增生平各成分在抑制胃癌形成過程中的協(xié)同作用，為優(yōu)化配方提供理論基礎(chǔ)。為達(dá)成上述目標(biāo)，本研究將采用多種研究方法，從不同角度深入剖析增生平抑制胃癌形成的機(jī)理。首先，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，選用合適的動(dòng)物模型，如通過連續(xù)飲用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）溶液另加定時(shí)灌胃的方法誘導(dǎo)Wistar大鼠建立胃粘膜癌前病變模型，設(shè)立正常對(duì)照組、模型組、增生平高劑量組與增生平低劑量組，給予不同處理后，觀察動(dòng)物的一般狀態(tài)、體重變化等指標(biāo)。通過解剖獲取胃組織，進(jìn)行病理切片觀察，了解胃黏膜病變情況，采用免疫組化、WesternBlot等技術(shù)檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平，運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，以明確增生平對(duì)胃癌形成相關(guān)分子機(jī)制的影響。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，選取人胃癌細(xì)胞系如SGC-7901、MGC-803等，將細(xì)胞分為對(duì)照組、不同濃度增生平處理組。通過MTT法、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布，運(yùn)用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力，利用WesternBlot、免疫熒光等技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)和活化水平，深入研究增生平對(duì)胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及分子機(jī)制。在分子生物學(xué)研究方法上，綜合運(yùn)用多種技術(shù)手段深入探究增生平抑制胃癌形成的分子機(jī)制。通過基因芯片技術(shù)全面篩選增生平處理前后胃癌細(xì)胞中差異表達(dá)的基因，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，挖掘關(guān)鍵基因和信號(hào)通路；利用RNA干擾技術(shù)（RNAi）特異性沉默關(guān)鍵基因的表達(dá)，觀察其對(duì)增生平作用效果的影響，驗(yàn)證關(guān)鍵基因在增生平抑制胃癌形成過程中的作用；采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析增生平處理后胃癌細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，鑒定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步揭示增生平作用的分子靶點(diǎn)和作用機(jī)制。二、胃癌形成機(jī)制概述2.1環(huán)境與飲食因素環(huán)境因素在胃癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著至關(guān)重要的角色，不同國(guó)家和地區(qū)的胃癌發(fā)病率存在顯著差異，這在很大程度上與環(huán)境因素密切相關(guān)。在一些火山巖地帶、高泥炭土壤地區(qū)，水土中含硝酸鹽過多，微量元素比例失調(diào)或存在化學(xué)污染等情況，這些因素可直接或間接經(jīng)飲食途徑參與胃癌的發(fā)生。第一代美國(guó)的日本移民，其胃癌發(fā)病率下降約25%，第二代下降約50%，第三代發(fā)生胃癌的危險(xiǎn)與當(dāng)?shù)孛绹?guó)居民相當(dāng)，這一現(xiàn)象充分表明環(huán)境因素對(duì)胃癌發(fā)病的重要影響。飲食因素是環(huán)境因素中與胃癌關(guān)聯(lián)最為緊密的部分。人類胃液中亞硝酸鹽含量與胃癌的患病率呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。亞硝酸鹽本身并不致癌，但在胃酸等環(huán)境下，它能與食物中的仲胺、叔胺和酰胺等發(fā)生反應(yīng)，生成強(qiáng)致癌物質(zhì)硝胺。長(zhǎng)期食用含硝酸鹽較高的食物后，硝酸鹽在胃內(nèi)被細(xì)菌還原成亞硝酸鹽，進(jìn)而與胺結(jié)合成致癌物亞硝胺。例如，咸菜、腌制煙熏食品中通常富含亞硝酸鹽，流行病學(xué)研究提示，經(jīng)常食用此類食物以及過多攝入食鹽，可顯著增加胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)性。此外，食物中缺乏新鮮蔬菜和水果也與胃癌發(fā)病存在一定關(guān)聯(lián)，新鮮蔬菜和水果中富含維生素C、維生素E、β-胡蘿卜素等抗氧化物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠抑制亞硝胺的合成，從而降低胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。霉變食物同樣是胃癌的重要危險(xiǎn)因素之一。霉變是由污染霉菌所引起，霉菌中有些是產(chǎn)毒真菌，是很強(qiáng)的致癌物質(zhì)。同時(shí)，某些食物在產(chǎn)毒真菌作用下會(huì)產(chǎn)生大量的亞硝酸鹽和二級(jí)胺，進(jìn)入機(jī)體后在一定條件下，胃又可合成亞硝胺類化合物而致癌。長(zhǎng)期食用霉變食物，如霉變的糧食、堅(jiān)果等，會(huì)使人體持續(xù)暴露在這些致癌物質(zhì)中，大大增加了胃癌的發(fā)病幾率。2.2感染因素感染因素在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中占據(jù)著重要地位，其中幽門螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染與胃癌的關(guān)系最為密切，是目前已知的導(dǎo)致胃癌發(fā)生的最重要的感染因素之一。幽門螺桿菌是一種主要定植于人體胃部及十二指腸內(nèi)的革蘭氏陰性菌，呈螺旋狀或S形、弧形。大量流行病學(xué)研究表明，胃癌高發(fā)區(qū)人群的幽門螺桿菌感染率普遍較高，而幽門螺桿菌抗體陽性人群發(fā)生胃癌的危險(xiǎn)性顯著高于陰性人群。世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）已將幽門螺桿菌列為第Ⅰ類生物致癌因子。幽門螺桿菌感染引發(fā)胃癌的分子機(jī)制十分復(fù)雜，涉及多個(gè)方面。幽門螺桿菌憑借其螺旋形結(jié)構(gòu)和鞭毛，能夠輕松穿過胃黏膜表面的黏液層，與胃上皮細(xì)胞緊密黏附。在黏附過程中，幽門螺桿菌會(huì)分泌一系列毒力因子，如細(xì)胞毒素相關(guān)基因A（CagA）、空泡毒素A（VacA）等。CagA蛋白可通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)注入胃上皮細(xì)胞內(nèi)，在宿主細(xì)胞內(nèi)激酶的作用下發(fā)生磷酸化。磷酸化后的CagA能夠與多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子相互作用，激活一系列信號(hào)通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路、PI3K-Akt通路等。這些信號(hào)通路的異常激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控、凋亡受阻，促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。VacA則可在細(xì)胞膜上形成孔道，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)離子失衡，引起細(xì)胞空泡化，破壞胃上皮細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。同時(shí)，VacA還能抑制免疫細(xì)胞的活性，削弱機(jī)體的免疫監(jiān)視功能，為胃癌的發(fā)生創(chuàng)造有利條件。幽門螺桿菌感染還會(huì)引發(fā)胃黏膜的慢性炎癥反應(yīng)。胃黏膜上皮細(xì)胞在受到幽門螺桿菌及其毒力因子的刺激后，會(huì)分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。這些炎癥因子會(huì)吸引中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到胃黏膜組織中，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞聚集。持續(xù)的慢性炎癥會(huì)使胃黏膜反復(fù)受損和修復(fù)，在這一過程中，細(xì)胞增殖和分化異常，容易引發(fā)基因突變，進(jìn)而增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，炎癥細(xì)胞產(chǎn)生的大量活性氧（ROS）和活性氮（RNS）也會(huì)對(duì)胃黏膜細(xì)胞的DNA造成損傷，導(dǎo)致基因不穩(wěn)定，促進(jìn)胃癌的發(fā)生。除了幽門螺桿菌，EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）感染也與胃癌的發(fā)生存在一定關(guān)聯(lián)。EB病毒是一種雙鏈DNA病毒，主要感染人類B淋巴細(xì)胞。在胃癌組織中，EB病毒的檢出率約為10%-15%。EB病毒感染胃癌細(xì)胞后，會(huì)通過多種機(jī)制影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。EB病毒編碼的潛伏膜蛋白1（LMP1）是一種重要的癌蛋白，它能夠模擬活化的腫瘤壞死因子受體（TNFR）的功能，激活NF-κB、JAK-STAT等信號(hào)通路。這些信號(hào)通路的激活會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)還能誘導(dǎo)細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等促血管生成因子，為腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供必要條件。EB病毒還可能通過干擾宿主細(xì)胞的DNA甲基化模式，影響基因的表達(dá)調(diào)控，導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。2.3遺傳因素遺傳因素在胃癌的發(fā)病過程中也起著不可忽視的作用。研究表明，胃癌具有明顯的家族聚集傾向，家族發(fā)病率高于人群2-3倍。這意味著家族中存在患胃癌的親屬時(shí)，其他成員患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)顯著增加。家族性胃癌可分為兩類，一類是遺傳性彌漫性胃癌（HereditaryDiffuseGastricCancer，HDGC），另一類是家族性腸型胃癌。其中，HDGC是一種常染色體顯性遺傳病，主要由16q22號(hào)染色體上的E-鈣黏蛋白基因（CDH1）突變引起。CDH1基因編碼的E-鈣黏蛋白是一種重要的細(xì)胞黏附分子，它能夠維持上皮細(xì)胞的正常形態(tài)和極性，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。當(dāng)CDH1基因發(fā)生突變時(shí)，E-鈣黏蛋白的表達(dá)和功能會(huì)受到影響，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，細(xì)胞容易發(fā)生異常增殖、遷移和侵襲，從而增加胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。HDGC患者通常在年輕時(shí)發(fā)病，平均發(fā)病年齡約為38歲，且多表現(xiàn)為彌漫性胃癌，預(yù)后較差。除了CDH1基因，還有許多其他基因與胃癌的易感性相關(guān)。例如，腫瘤蛋白53（TP53）基因是一種重要的抑癌基因，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和增殖起著關(guān)鍵作用。在胃癌患者中，TP53基因的突變率較高，突變后的TP53基因失去了正常的抑癌功能，無法有效地抑制細(xì)胞的異常增殖和癌變，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）基因的過表達(dá)或擴(kuò)增也與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。EGFR是一種跨膜受體酪氨酸激酶，它與配體結(jié)合后能夠激活下游的Ras-Raf-MEK-ERK、PI3K-Akt等信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲。在胃癌中，EGFR的過表達(dá)或擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致這些信號(hào)通路的過度激活，使胃癌細(xì)胞獲得更強(qiáng)的增殖和轉(zhuǎn)移能力。遺傳因素與環(huán)境因素之間還存在著復(fù)雜的相互作用。環(huán)境因素如飲食、感染等可能會(huì)影響遺傳因素的表達(dá)和功能，從而增加或降低胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。長(zhǎng)期食用高鹽、腌制食物等不良飲食習(xí)慣，可能會(huì)對(duì)具有遺傳易感性的個(gè)體產(chǎn)生更大的影響，加速胃癌的發(fā)生發(fā)展。而對(duì)于沒有遺傳易感性的個(gè)體，環(huán)境因素的影響相對(duì)較小。幽門螺桿菌感染在有遺傳易感性的人群中，可能更容易引發(fā)胃黏膜的慢性炎癥和病變，進(jìn)而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。因此，深入研究遺傳因素與環(huán)境因素之間的相互作用機(jī)制，對(duì)于揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制和制定有效的防治策略具有重要意義。2.4癌前狀態(tài)與分子標(biāo)志物癌前狀態(tài)在胃癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中占據(jù)著關(guān)鍵地位，它涵蓋了癌前疾病和癌前病變兩個(gè)層面。癌前疾病指的是某些具有潛在癌變可能性的良性疾病，常見的包括胃息肉、慢性萎縮性胃炎、胃潰瘍和殘胃炎等。胃息肉是胃黏膜表面長(zhǎng)出的突起狀乳頭狀組織，其中腺瘤性息肉的癌變風(fēng)險(xiǎn)較高，尤其是直徑大于2cm的廣基腺瘤性息肉。研究表明，約10%-20%的腺瘤性息肉可發(fā)生癌變，其癌變機(jī)制可能與息肉的大小、形態(tài)、組織學(xué)類型以及基因改變等因素有關(guān)。慢性萎縮性胃炎則是胃黏膜上皮和腺體萎縮，數(shù)目減少，胃黏膜變薄，黏膜基層增厚，或伴幽門腺化生和腸腺化生，或有不典型增生為特征的慢性消化系統(tǒng)疾病。當(dāng)慢性萎縮性胃炎進(jìn)一步發(fā)展，出現(xiàn)腸上皮化生和異型增生時(shí)，癌變的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)顯著增加。胃潰瘍是胃黏膜被胃酸和胃蛋白酶消化后形成的慢性潰瘍，雖然大部分胃潰瘍屬于良性病變，但約1%的胃潰瘍可能會(huì)發(fā)生癌變，長(zhǎng)期的潰瘍刺激會(huì)導(dǎo)致胃黏膜反復(fù)損傷和修復(fù)，在此過程中細(xì)胞容易發(fā)生異常增殖和分化，從而引發(fā)癌變。殘胃炎是指因各種原因切除部分胃后，殘胃發(fā)生的炎癥，由于殘胃的解剖結(jié)構(gòu)和生理功能發(fā)生改變，胃酸分泌減少，胃內(nèi)細(xì)菌容易滋生，這些因素都增加了殘胃炎癌變的風(fēng)險(xiǎn)。癌前病變則是指較易轉(zhuǎn)變?yōu)榘┙M織的病理學(xué)變化，主要包括腸上皮化生和異型增生。腸上皮化生是指胃黏膜上皮細(xì)胞被腸型上皮細(xì)胞所替代的現(xiàn)象，即胃黏膜中出現(xiàn)類似小腸或大腸黏膜的上皮細(xì)胞。根據(jù)化生上皮的形態(tài)和分泌的黏液性質(zhì)，腸上皮化生可分為完全性腸化生和不完全性腸化生。不完全性腸化生與胃癌的關(guān)系更為密切，尤其是不完全性大腸型化生，其細(xì)胞具有較高的增殖活性和不穩(wěn)定性，容易發(fā)生基因突變，進(jìn)而導(dǎo)致癌變。異型增生又稱不典型增生，是指胃黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)異型性改變，表現(xiàn)為細(xì)胞大小不一、形態(tài)不規(guī)則、核增大深染、核漿比例失調(diào)等。異型增生是胃癌發(fā)生的重要中間環(huán)節(jié)，根據(jù)異型程度可分為輕度、中度和重度異型增生。重度異型增生被認(rèn)為是癌前病變的晚期階段，若不及時(shí)治療，很容易發(fā)展為胃癌。分子標(biāo)志物在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它們能夠反映腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，為胃癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估和治療提供重要依據(jù)。人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）是一種跨膜受體酪氨酸激酶，在胃癌的發(fā)病中扮演著重要角色。HER2基因的擴(kuò)增或蛋白的過表達(dá)在約15%-20%的胃癌患者中出現(xiàn)，HER2的異常表達(dá)會(huì)激活下游的PI3K-Akt、Ras-Raf-MEK-ERK等信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲。臨床上，HER2已成為胃癌靶向治療的重要靶點(diǎn)，針對(duì)HER2的靶向藥物如曲妥珠單抗，能夠顯著提高HER2陽性胃癌患者的治療效果和生存率。抑癌基因的失活同樣是胃癌發(fā)生的重要分子機(jī)制之一。例如，p53基因是一種重要的抑癌基因，它能夠調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和增殖。在胃癌中，p53基因的突變率較高，突變后的p53基因失去了正常的抑癌功能，無法有效地抑制細(xì)胞的異常增殖和癌變，從而促進(jìn)胃癌的發(fā)生發(fā)展。此外，錯(cuò)配修復(fù)基因（MMR）的異常也參與了胃癌的發(fā)病過程。MMR基因能夠識(shí)別和修復(fù)DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配、小片段插入或缺失等錯(cuò)誤，維持基因組的穩(wěn)定性。當(dāng)MMR基因發(fā)生突變或功能缺失時(shí)，DNA復(fù)制錯(cuò)誤無法及時(shí)修復(fù)，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，增加了胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）是MMR基因異常的重要表現(xiàn)形式之一，在約10%-15%的胃癌中可檢測(cè)到MSI，MSI陽性的胃癌患者具有獨(dú)特的臨床病理特征和預(yù)后。三、增生平的研究基礎(chǔ)3.1增生平的成分與功效增生平是一種純中藥制劑，由山豆根、拳參、白鮮皮、夏枯草、北敗醬草、黃藥子等六味中藥精妙配伍而成。山豆根為君藥，其味苦，性寒，歸肺、胃經(jīng)，具有清火消腫利咽之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，山豆根中富含苦參堿、氧化苦參堿等生物堿類成分，這些成分具有顯著的抗腫瘤活性，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。拳參和夏枯草為臣藥，拳參性微寒，味苦、澀，具有涼血活血消腫的作用，其含有的沒食子酸、原兒茶酸等成分具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤等多種生物活性。夏枯草辛能散結(jié)，苦寒能泄熱，具有清郁熱、軟堅(jiān)散結(jié)之效，夏枯草中的熊果酸、齊墩果酸等三萜類化合物能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。北敗醬、白鮮皮和黃藥子作為佐使藥，協(xié)同發(fā)揮作用。北敗醬能清熱化瘀散結(jié)，其含有的揮發(fā)油、黃酮類等成分具有抗炎、抗菌和調(diào)節(jié)免疫等作用。白鮮皮可清熱，其中的白鮮堿、梣酮等成分具有抗炎、抗過敏和抗腫瘤等生物活性。黃藥子則能散結(jié)化痰消腫，其含有的黃藥子素、薯蕷皂苷等成分具有抗腫瘤、抗病毒等作用。這六味中藥相互配伍，共同發(fā)揮清熱解毒、化瘀散結(jié)的功效。從傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論來看，熱毒內(nèi)蘊(yùn)、瘀血阻滯是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要病理因素。增生平中的山豆根、北敗醬草、白鮮皮等藥物，其性寒味苦，能清熱瀉火、解毒消腫，可有效清除體內(nèi)熱毒之邪。拳參、夏枯草、黃藥子等藥物，具有活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)的作用，能夠消散體內(nèi)瘀血，化解痰結(jié)，使氣血運(yùn)行通暢，腫塊得以消散。諸藥合用，既能清熱解毒以消除致病之因，又能化瘀散結(jié)以消除病理產(chǎn)物，從而達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)、防治腫瘤發(fā)生的目的。在臨床應(yīng)用中，增生平適用于食管和賁門上皮增生，以及具有呃逆、進(jìn)食吞咽不利、口干、口苦、咽痛、便干、舌暗、脈弦滑等熱瘀內(nèi)結(jié)表現(xiàn)者，體現(xiàn)了其在改善癥狀、調(diào)節(jié)機(jī)體功能方面的作用。3.2增生平的相關(guān)研究進(jìn)展增生平在食管癌防治領(lǐng)域的研究成果豐碩，堪稱其研究的經(jīng)典范例。自20世紀(jì)80年代起，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院林培忠教授就開始應(yīng)用增生平片對(duì)食管癌高發(fā)區(qū)人群進(jìn)行阻斷性治療研究。在河南林縣河順鄉(xiāng)和安陽縣磊口鄉(xiāng)，對(duì)40-65歲居民9633人進(jìn)行食管細(xì)胞學(xué)普查，檢出重度增生患者2531人，輕度增生患者3393人。將重增患者分為三組，分別服用增生平片、維胺酯和安慰劑；輕增患者分為兩組，分別服用核黃素和安慰劑。服藥3年和5年后復(fù)查發(fā)現(xiàn)，重增組的增生平片組和維胺酯組，5年內(nèi)患者的癌變率分別下降了52.2%和43.2%。阻斷治療9年后（服藥5年，停藥4年），增生平片和維胺酯使重增癌變率減少仍保持為42.1%和38.2%，與對(duì)照組相比，差異具有非常顯著性。為進(jìn)一步驗(yàn)證和推廣該成果，1992年在食管癌高發(fā)區(qū)河北省磁縣9個(gè)鄉(xiāng)再次進(jìn)行食管癌前病變的藥物阻斷治療研究。對(duì)40-65歲人群進(jìn)行食管細(xì)胞學(xué)普查，檢出食管重增3990例，輕增5346例，隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組。重增和輕增治療組分別服用中藥增生平片和核黃素鈣片，對(duì)照組服用安慰劑。服藥3年后復(fù)查顯示，重增治療組癌變相對(duì)危險(xiǎn)度（rr）=0.50，95%ci=0.33-0.75，抑癌率49.9%；輕增組的結(jié)果分別為ridit=0.59，95%ci=0.57-0.61；rr=0.80，95%ci=0.52-1.22，抑癌率20.4%。這些研究充分表明，增生平在阻斷食管癌前病變、預(yù)防食管癌發(fā)生方面效果顯著，且長(zhǎng)期服用及停藥后仍能保持預(yù)防效果。在其他腫瘤防治方面，增生平也展現(xiàn)出一定的應(yīng)用潛力。有研究表明，增生平在口腔黏膜白斑的治療中具有一定作用?？谇火つぐ装呤且环N常見的口腔黏膜癌前病變，增生平可能通過調(diào)節(jié)局部免疫功能、抑制細(xì)胞異常增殖等機(jī)制，對(duì)口腔黏膜白斑起到改善和治療作用。在逆轉(zhuǎn)慢性萎縮性胃炎腸化生方面，增生平也有相關(guān)探索。慢性萎縮性胃炎伴腸化生是胃癌前病變的重要階段，增生平可能通過調(diào)節(jié)胃黏膜細(xì)胞的代謝和增殖，促進(jìn)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑制腸化生的發(fā)展。然而，在胃癌防治研究方面，增生平的相關(guān)研究相對(duì)較少。臨床研究多為小樣本觀察，缺乏多中心、大樣本的隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)。雖然有部分研究表明增生平對(duì)胃癌前病變患者的癥狀改善和病變抑制有一定效果，但證據(jù)強(qiáng)度相對(duì)較弱。在基礎(chǔ)研究方面，目前主要集中在對(duì)腫瘤細(xì)胞內(nèi)相關(guān)分子表達(dá)的影響，如通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)增生平能夠降低PCNA、cyclinDl及CDK4蛋白表達(dá)水平，從而對(duì)胃粘膜的癌前病變有較好的阻斷作用；能夠抑制β-catenin蛋白與c-mycmRNA的表達(dá)，并能上調(diào)GSK-3β蛋白表達(dá)水平，從而對(duì)Wnt通路起到良性的調(diào)節(jié)作用；能夠抑制IL-10和TGF-βmRNA及蛋白的表達(dá)水平并能促進(jìn)IL-2mRNA及蛋白的表達(dá)，同時(shí)能夠上調(diào)CD4+CD8+T細(xì)胞比率，從而在胃粘膜癌前病變形成過程中增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用。但對(duì)于增生平在胃癌微環(huán)境中的作用，如對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的影響，以及對(duì)腫瘤血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)重塑等方面的研究還相對(duì)匱乏。四、實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡、體重180-220g的清潔級(jí)雄性Wistar大鼠60只，購自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證編號(hào)]。大鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的動(dòng)物房?jī)?nèi)，給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和自由飲水，適應(yīng)環(huán)境1周后開始實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格遵守動(dòng)物倫理原則，確保動(dòng)物福利。4.1.2細(xì)胞系人胃癌細(xì)胞系SGC-7901和MGC-803購自[細(xì)胞庫名稱]，將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4.1.3試劑增生平片由[生產(chǎn)廠家]提供，實(shí)驗(yàn)時(shí)將其研磨成粉末，用0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液配制成所需濃度的混懸液。N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）購自[試劑公司]，用無水乙醇溶解后，配制成1mg/mL的儲(chǔ)備液，保存于-20℃冰箱，使用時(shí)用無菌生理鹽水稀釋至所需濃度。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購自[生物公司]；MTT試劑、CCK-8試劑、AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購自[試劑公司]；兔抗人PCNA、cyclinD1、CDK4、GSK-3β、β-catenin、c-myc、IL-2、IL-10、TGF-β等一抗及相應(yīng)的二抗購自[抗體公司]；TRIzol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自[生物公司]；其他常規(guī)試劑均為分析純，購自[試劑公司]。4.1.4儀器超凈工作臺(tái)（[品牌及型號(hào)]）、CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（[品牌及型號(hào)]）、倒置顯微鏡（[品牌及型號(hào)]）、酶標(biāo)儀（[品牌及型號(hào)]）、流式細(xì)胞儀（[品牌及型號(hào)]）、PCR儀（[品牌及型號(hào)]）、凝膠成像系統(tǒng)（[品牌及型號(hào)]）、石蠟切片機(jī)（[品牌及型號(hào)]）、光學(xué)顯微鏡（[品牌及型號(hào)]）、電子天平（[品牌及型號(hào)]）等。4.1.5動(dòng)物模型構(gòu)建采用連續(xù)飲用N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍（MNNG）溶液另加定時(shí)灌胃的方法誘導(dǎo)Wistar大鼠建立胃粘膜癌前病變模型。將60只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（10只）和模型組（50只）。模型組大鼠飲用含100μg/mLMNNG的無菌蒸餾水，同時(shí)每周2次灌胃給予100μg/mLMNNG溶液，每次0.5mL/100g體重；正常對(duì)照組大鼠飲用無菌蒸餾水，并給予等體積的生理鹽水灌胃。持續(xù)造模16周，期間密切觀察大鼠的飲食、體重、精神狀態(tài)等一般情況。造模結(jié)束后，隨機(jī)選取模型組5只大鼠進(jìn)行胃鏡檢查和病理切片觀察，以確認(rèn)模型是否成功建立。若模型成功，將模型組剩余45只大鼠隨機(jī)分為增生平高劑量組、增生平低劑量組和模型對(duì)照組，每組15只。4.1.6細(xì)胞培養(yǎng)及給藥方式將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901和MGC-803細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個(gè)/mL，接種于96孔板、6孔板或細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行給藥處理。增生平藥物處理組分別加入不同濃度（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定，如10、20、40、80、160μg/mL）的增生平含藥血清，對(duì)照組加入等體積的正常大鼠血清，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間（如24、48、72h）后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。含藥血清的制備：取健康雄性Wistar大鼠，按照臨床等效劑量的5倍、10倍分別灌胃給予增生平混懸液，每天1次，連續(xù)灌胃7d，于末次灌胃后1h腹主動(dòng)脈采血，分離血清，56℃滅活30min，-20℃保存?zhèn)溆谩?.2檢測(cè)指標(biāo)與方法4.2.1免疫組化檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平取各組大鼠胃黏膜組織，常規(guī)固定、脫水、包埋，制成4μm厚的石蠟切片。切片脫蠟至水后，采用3%過氧化氫溶液室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，進(jìn)行抗原修復(fù)，修復(fù)條件為95-100℃加熱15-20min。待切片冷卻后，用PBS沖洗3次，每次5min。加入5%山羊血清封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性背景染色。傾去封閉液，不洗，直接加入兔抗人PCNA、cyclinD1、CDK4等一抗（稀釋度根據(jù)抗體說明書確定，如1:100-1:500），4℃孵育過夜。次日取出切片，用PBS沖洗3次，每次5min。加入相應(yīng)的生物素標(biāo)記的二抗（稀釋度如1:200-1:500），室溫孵育30min。再次用PBS沖洗3次，每次5min。隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育30min。PBS沖洗3次，每次5min后，用DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，待陽性部位顯色清晰后，用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)。脫水、透明，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞表達(dá)率。陽性細(xì)胞表達(dá)率=（陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)）×100%。4.2.2WesternBlot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平取各組大鼠胃黏膜組織，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上勻漿裂解30min。然后將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，4℃、12000r/min離心15min，取上清液即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，將蛋白樣品調(diào)整至相同濃度。加入適量的5×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸變性5min。冷卻后，取20-30μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳條件為80V濃縮膠電泳30min，120V分離膠電泳1-2h，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為250mA恒流，轉(zhuǎn)膜1-2h。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1-2h。封閉后，將PVDF膜與兔抗人GSK-3β、β-catenin等一抗（稀釋度根據(jù)抗體說明書確定，如1:1000-1:5000）4℃孵育過夜。次日取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min。然后加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗（稀釋度如1:2000-1:10000），室溫孵育1-2h。再次用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min。最后，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光底物工作液中孵育1-2min，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光、顯影，分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。4.2.3RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平取各組大鼠胃黏膜組織，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA。用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，OD260/OD280比值應(yīng)在1.8-2.0之間。取1-2μg總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系包括cDNA模板、上下游引物（根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)，引物序列如：c-myc上游引物5'--3'，下游引物5'--3'；β-actin上游引物5'--3'，下游引物5'--3'）、dNTPs、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55-65℃退火30s（根據(jù)引物Tm值確定退火溫度），72℃延伸30s，共進(jìn)行35-40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5-10μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為100V恒壓，電泳30-40min。在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量=目的基因條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。4.2.4流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)免疫指標(biāo)取大鼠外周血，用肝素鈉抗凝。將抗凝血用PBS按1:1稀釋后，緩慢加入到淋巴細(xì)胞分離液上層，2000r/min離心20min。吸取中間云霧狀的單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，用PBS洗滌2次，每次1500r/min離心10min。將洗滌后的細(xì)胞重懸于100μlPBS中，加入適量的熒光素標(biāo)記的抗CD4、抗CD8抗體（稀釋度根據(jù)抗體說明書確定，如1:50-1:100），混勻后，室溫避光孵育30min。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌2次，每次1500r/min離心10min。最后將細(xì)胞重懸于500μlPBS中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD8+T細(xì)胞比率。檢測(cè)前，需用標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)α魇郊?xì)胞儀進(jìn)行校準(zhǔn)，設(shè)置合適的電壓和補(bǔ)償，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在分析過程中，采用FlowJo等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過設(shè)門圈定淋巴細(xì)胞群，然后分析其中CD4+CD8+T細(xì)胞的比例。4.2.5ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子水平取大鼠外周血，3000r/min離心15min，分離血清。按照ELISA試劑盒說明書操作，首先將包被有抗IL-2、IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子抗體的酶標(biāo)板平衡至室溫。分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)血清樣品（每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔），37℃孵育1-2h。孵育結(jié)束后，棄去孔內(nèi)液體，用洗滌緩沖液洗滌5次，每次3min。加入生物素標(biāo)記的二抗工作液，37℃孵育30-60min。再次洗滌5次后，加入HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育30-60min。洗滌5次后，加入底物顯色液，室溫避光顯色15-30min。待顯色明顯后，加入終止液終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)血清中細(xì)胞因子的含量。4.3實(shí)驗(yàn)分組與對(duì)照設(shè)置將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（10只）和模型組（50只）。正常對(duì)照組大鼠飲用無菌蒸餾水，并給予等體積的生理鹽水灌胃，作為正常生理狀態(tài)的對(duì)照，其目的在于提供正常胃黏膜組織的各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)，以便與其他實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行對(duì)比，從而清晰地判斷出模型建立以及藥物干預(yù)后所產(chǎn)生的變化。模型組大鼠飲用含100μg/mLMNNG的無菌蒸餾水，同時(shí)每周2次灌胃給予100μg/mLMNNG溶液，每次0.5mL/100g體重，用于構(gòu)建胃粘膜癌前病變模型。經(jīng)過16周的造模，模型組大鼠的胃黏膜在MNNG的持續(xù)作用下，逐漸出現(xiàn)類似人類胃黏膜癌前病變的病理變化，如慢性炎癥、萎縮、腸上皮化生和異型增生等，以此模擬胃癌前病變的發(fā)生發(fā)展過程。造模結(jié)束后，隨機(jī)選取模型組5只大鼠進(jìn)行胃鏡檢查和病理切片觀察，確認(rèn)模型成功建立后，將模型組剩余45只大鼠隨機(jī)分為增生平高劑量組、增生平低劑量組和模型對(duì)照組，每組15只。增生平高劑量組和低劑量組分別給予不同劑量的增生平混懸液灌胃，高劑量組按照臨床等效劑量的10倍給藥，低劑量組按照臨床等效劑量的5倍給藥。通過設(shè)置不同劑量的增生平處理組，能夠探究增生平在不同濃度下對(duì)胃癌前病變的抑制作用，分析其劑量-效應(yīng)關(guān)系，為臨床合理用藥劑量的選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。模型對(duì)照組則給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液灌胃，作為模型組的平行對(duì)照，用于排除CMC-Na溶液對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，明確觀察到的實(shí)驗(yàn)效果是由增生平的作用所導(dǎo)致，而非其他因素干擾。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SGC-7901和MGC-803細(xì)胞接種于96孔板、6孔板或細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，分為對(duì)照組和增生平藥物處理組。對(duì)照組加入等體積的正常大鼠血清，模擬正常細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，用于對(duì)比藥物處理組細(xì)胞在形態(tài)、增殖、凋亡等方面的差異。增生平藥物處理組分別加入不同濃度（如10、20、40、80、160μg/mL）的增生平含藥血清，研究不同濃度的增生平含藥血清對(duì)胃癌細(xì)胞的作用，進(jìn)一步從細(xì)胞水平揭示增生平抑制胃癌形成的機(jī)制。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析5.1增生平對(duì)胃癌相關(guān)蛋白表達(dá)的影響采用免疫組化和WesternBlot方法檢測(cè)PCNA、cyclinD1、CDK4、GSK-3β、β-catenin等蛋白在各組大鼠胃黏膜組織中的表達(dá)水平，結(jié)果如表1和圖1所示。PCNA是一種反映細(xì)胞增殖活性的核蛋白，在DNA合成期含量最高，其表達(dá)水平與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，正常組大鼠胃黏膜組織中PCNA蛋白幾乎無表達(dá)，陽性表達(dá)率為0。模型組大鼠胃黏膜組織中PCNA蛋白陽性表達(dá)率顯著升高，達(dá)到92.86%，這表明模型組大鼠胃黏膜細(xì)胞處于高度增殖狀態(tài)，符合胃癌前病變的特征。給予增生平干預(yù)后，高劑量組PCNA蛋白陽性表達(dá)率明顯降低，降至57.89%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低劑量組PCNA蛋白陽性表達(dá)率為94.12%，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），但高劑量組的陽性率低于低劑量組（P<0.05）。這說明增生平能夠抑制胃黏膜細(xì)胞的增殖，且高劑量的增生平抑制作用更為顯著。cyclinD1是細(xì)胞周期蛋白D1，在細(xì)胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。正常組大鼠胃黏膜組織中cyclinD1蛋白陽性表達(dá)率較低，僅為5%。模型組cyclinD1蛋白陽性表達(dá)率高達(dá)100%，表明模型組大鼠胃黏膜細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生了明顯改變，G1期向S期的轉(zhuǎn)換加速。增生平高劑量組cyclinD1蛋白陽性表達(dá)率降至52.63%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低劑量組陽性表達(dá)率為94.12%，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），高劑量組低于低劑量組（P<0.05）。這表明增生平能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，從而影響細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制胃黏膜細(xì)胞的異常增殖。CDK4即細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4，與cyclinD1結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。正常組大鼠胃黏膜組織中CDK4蛋白陽性表達(dá)率為5%。模型組CDK4蛋白陽性表達(dá)率達(dá)到100%，說明模型組細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4的活性增強(qiáng)，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。增生平高劑量組CDK4蛋白陽性表達(dá)率為68.42%，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低劑量組陽性表達(dá)率為94.12%，與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），高劑量組低于低劑量組（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了增生平能夠抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4的表達(dá)，從而抑制胃黏膜細(xì)胞的增殖。GSK-3β是一種糖原合成酶激酶-3β，在Wnt信號(hào)通路中發(fā)揮重要的負(fù)調(diào)控作用。正常組大鼠胃黏膜組織中GSK-3β蛋白表達(dá)水平較高，為0.898±0.099。模型組GSK-3β蛋白表達(dá)水平明顯降低，僅為0.156±0.013，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明在胃癌前病變模型中，Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控機(jī)制受到抑制，導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路異常激活。給予增生平干預(yù)后，高劑量組GSK-3β蛋白表達(dá)水平顯著升高，達(dá)到0.603±0.064，低劑量組為0.377±0.050，與模型組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且高劑量組GSK-3β蛋白表達(dá)水平明顯高于低劑量組（P<0.05）。這說明增生平能夠上調(diào)GSK-3β蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控作用，抑制Wnt信號(hào)通路的過度激活。β-catenin即β-連環(huán)蛋白，是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子。正常組大鼠胃黏膜組織中β-catenin蛋白表達(dá)水平較低，模型組β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著升高，為0.333±0.042，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明在胃癌前病變模型中，Wnt信號(hào)通路被激活，β-catenin蛋白在細(xì)胞內(nèi)積累。增生平高劑量組β-catenin蛋白表達(dá)水平降至0.282±0.010，低劑量組為0.305±0.025，與模型組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且高劑量組β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯低于低劑量組（P<0.05）。這說明增生平能夠抑制β-catenin蛋白的表達(dá)，阻斷Wnt信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而抑制胃黏膜細(xì)胞的增殖和癌變。c-myc是一種原癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程，在Wnt信號(hào)通路的下游發(fā)揮作用。正常組大鼠胃黏膜組織中c-mycmRNA表達(dá)水平較低，模型組c-mycmRNA表達(dá)水平顯著升高，為0.921±0.083，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明在胃癌前病變模型中，c-myc基因被激活，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和癌變。增生平高劑量組c-mycmRNA表達(dá)水平降至0.506±0.047，低劑量組為0.653±0.062，與模型組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且高劑量組c-mycmRNA表達(dá)水平明顯低于低劑量組（P<0.05）。這說明增生平能夠抑制c-myc基因的表達(dá)，從而抑制胃黏膜細(xì)胞的增殖和癌變，進(jìn)一步證實(shí)了增生平對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。綜上所述，增生平能夠通過抑制PCNA、cyclinD1、CDK4蛋白的表達(dá)，抑制胃黏膜細(xì)胞的增殖；通過上調(diào)GSK-3β蛋白表達(dá)，抑制β-catenin蛋白與c-mycmRNA的表達(dá)，對(duì)Wnt信號(hào)通路起到良性的調(diào)節(jié)作用，從而阻斷胃黏膜的癌前病變，抑制胃癌的形成。且高劑量的增生平在調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)、抑制胃癌形成方面的作用更為顯著。表1：各組大鼠胃黏膜組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平（略）圖1：各組大鼠胃黏膜組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的免疫組化和WesternBlot結(jié)果（略）5.2增生平對(duì)Wnt通路相關(guān)分子的影響Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其異常激活與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。為了深入探究增生平對(duì)Wnt通路的調(diào)節(jié)機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用WesternBlot方法檢測(cè)了各組大鼠胃黏膜組織中GSK-3β、β-catenin蛋白表達(dá)水平，用RT-PCR法檢測(cè)了各組胃粘膜組織c-mycmRNA表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2和圖2所示。GSK-3β作為Wnt信號(hào)通路的重要負(fù)調(diào)節(jié)因子，在維持細(xì)胞內(nèi)β-catenin的穩(wěn)態(tài)水平方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。正常組大鼠胃黏膜組織中GSK-3β蛋白表達(dá)水平較高，為0.898±0.099。在模型組中，由于胃癌前病變的發(fā)生，GSK-3β蛋白表達(dá)水平明顯降低，僅為0.156±0.013，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明在胃癌前病變模型中，Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控機(jī)制受到抑制，導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路異常激活。給予增生平干預(yù)后，高劑量組GSK-3β蛋白表達(dá)水平顯著升高，達(dá)到0.603±0.064，低劑量組為0.377±0.050，與模型組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且高劑量組GSK-3β蛋白表達(dá)水平明顯高于低劑量組（P<0.05）。這說明增生平能夠上調(diào)GSK-3β蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)Wnt信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控作用，抑制Wnt信號(hào)通路的過度激活。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子，在Wnt信號(hào)通路激活時(shí)，β-catenin會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和癌變。正常組大鼠胃黏膜組織中β-catenin蛋白表達(dá)水平較低，模型組β-catenin蛋白表達(dá)水平顯著升高，為0.333±0.042，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明在胃癌前病變模型中，Wnt信號(hào)通路被激活，β-catenin蛋白在細(xì)胞內(nèi)積累。增生平高劑量組β-catenin蛋白表達(dá)水平降至0.282±0.010，低劑量組為0.305±0.025，與模型組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且高劑量組β-catenin蛋白表達(dá)水平明顯低于低劑量組（P<0.05）。這說明增生平能夠抑制β-catenin蛋白的表達(dá)，阻斷Wnt信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而抑制胃黏膜細(xì)胞的增殖和癌變。c-myc是一種原癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生物學(xué)過程，是Wnt信號(hào)通路的下游靶基因之一。正常組大鼠胃黏膜組織中c-mycmRNA表達(dá)水平較低，模型組c-mycmRNA表達(dá)水平顯著升高，為0.921±0.083，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明在胃癌前病變模型中，c-myc基因被激活，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖和癌變。增生平高劑量組c-mycmRNA表達(dá)水平降至0.506±0.047，低劑量組為0.653±0.062，與模型組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且高劑量組c-mycmRNA表達(dá)水平明顯低于低劑量組（P<0.05）。這說明增生平能夠抑制c-myc基因的表達(dá)，從而抑制胃黏膜細(xì)胞的增殖和癌變，進(jìn)一步證實(shí)了增生平對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。綜上所述，增生平能夠通過上調(diào)GSK-3β蛋白表達(dá)，抑制β-catenin蛋白與c-mycmRNA的表達(dá)，對(duì)Wnt信號(hào)通路起到良性的調(diào)節(jié)作用，從而阻斷胃黏膜的癌前病變，抑制胃癌的形成。且高劑量的增生平在調(diào)節(jié)Wnt通路相關(guān)分子表達(dá)、抑制胃癌形成方面的作用更為顯著。表2：各組大鼠胃黏膜組織中Wnt通路相關(guān)分子表達(dá)水平（略）圖2：各組大鼠胃黏膜組織中Wnt通路相關(guān)分子表達(dá)的WesternBlot和RT-PCR結(jié)果（略）5.3增生平對(duì)免疫調(diào)節(jié)因子的影響免疫調(diào)節(jié)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，為了探究增生平對(duì)免疫調(diào)節(jié)的影響，本實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR和ELISA方法檢測(cè)了各組大鼠外周血中IL-2、IL-10和TGF-β的mRNA及蛋白表達(dá)水平，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)了大鼠外周血中CD4+CD8+T細(xì)胞比率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3和圖3所示。IL-2即白細(xì)胞介素-2，是一種重要的細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的活性，在機(jī)體的免疫防御和免疫監(jiān)視中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。正常組大鼠外周血中IL-2mRNA表達(dá)水平為1.000±0.052，蛋白表達(dá)水平為（55.63±4.27）pg/mL。模型組大鼠外周血中IL-2mRNA表達(dá)水平顯著降低，僅為0.356±0.031，蛋白表達(dá)水平降至（22.15±3.12）pg/mL，與正常組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明在胃癌前病變模型中，機(jī)體的免疫功能受到抑制，IL-2的分泌減少。給予增生平干預(yù)后，高劑量組IL-2mRNA表達(dá)水平顯著升高，達(dá)到0.785±0.046，蛋白表達(dá)水平升至（45.38±3.89）pg/mL，低劑量組IL-2mRNA表達(dá)水平為0.567±0.039，蛋白表達(dá)水平為（33.76±3.54）pg/mL，與模型組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且高劑量組IL-2mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于低劑量組（P<0.05）。這說明增生平能夠促進(jìn)IL-2的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，且高劑量的增生平作用更為顯著。IL-10即白細(xì)胞介素-10，是一種具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子，它可以抑制Th1細(xì)胞的活性，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。正常組大鼠外周血中IL-10mRNA表達(dá)水平為0.213±0.020，蛋白表達(dá)水平為（18.56±2.56）pg/mL。模型組大鼠外周血中IL-10mRNA表達(dá)水平顯著升高，達(dá)到0.854±0.062，蛋白表達(dá)水平升至（56.78±4.89）pg/mL，與正常組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明在胃癌前病變模型中，IL-10的表達(dá)上調(diào)，機(jī)體的免疫抑制作用增強(qiáng)。增生平高劑量組IL-10mRNA表達(dá)水平降至0.305±0.032，蛋白表達(dá)水平降至（25.67±3.21）pg/mL，低劑量組IL-10mRNA表達(dá)水平為0.521±0.045，蛋白表達(dá)水平為（38.94±3.98）pg/mL，與模型組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且高劑量組IL-10mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于低劑量組（P<0.05）。這說明增生平能夠抑制IL-10的表達(dá)，減輕機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)，且高劑量的增生平效果更佳。TGF-β即轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β，是一種多功能的細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，它可以抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖和活化，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的分化，從而抑制免疫反應(yīng)。正常組大鼠外周血中TGF-βmRNA表達(dá)水平為0.156±0.018，蛋白表達(dá)水平為（15.23±2.15）pg/mL。模型組大鼠外周血中TGF-βmRNA表達(dá)水平顯著升高，達(dá)到0.789±0.058，蛋白表達(dá)水平升至（52.34±4.56）pg/mL，與正常組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明在胃癌前病變模型中，TGF-β的表達(dá)上調(diào)，機(jī)體的免疫抑制作用增強(qiáng)。增生平高劑量組TGF-βmRNA表達(dá)水平降至0.256±0.028，蛋白表達(dá)水平降至（20.45±2.89）pg/mL，低劑量組TGF-βmRNA表達(dá)水平為0.456±0.040，蛋白表達(dá)水平為（32.12±3.67）pg/mL，與模型組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且高劑量組TGF-βmRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于低劑量組（P<0.05）。這說明增生平能夠抑制TGF-β的表達(dá)，減輕機(jī)體的免疫抑制狀態(tài)，且高劑量的增生平作用更為明顯。CD4+CD8+T細(xì)胞比率是反映機(jī)體免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)之一，CD4+T細(xì)胞主要參與體液免疫和輔助細(xì)胞免疫，CD8+T細(xì)胞主要參與細(xì)胞免疫，兩者的平衡對(duì)于維持機(jī)體的免疫功能至關(guān)重要。正常組大鼠外周血中CD4+CD8+T細(xì)胞比率為4.651±0.757。模型組大鼠外周血中CD4+CD8+T細(xì)胞比率明顯降低，僅為2.362±0.212，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明在胃癌前病變模型中，機(jī)體的免疫平衡受到破壞。增生平高劑量組CD4+CD8+T細(xì)胞比率升高至3.625±0.378，低劑量組為3.072±0.159，與模型組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且高劑量組CD4+CD8+T細(xì)胞比率明顯高于低劑量組（P<0.05）。這說明增生平能夠上調(diào)CD4+CD8+T細(xì)胞比率，恢復(fù)機(jī)體的免疫平衡，且高劑量的增生平效果更顯著。綜上所述，增生平能夠抑制IL-10和TGF-βmRNA及蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)IL-2mRNA及蛋白的表達(dá)，同時(shí)能夠上調(diào)CD4+CD8+T細(xì)胞比率，從而在胃粘膜癌前病變形成過程中增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用。且高劑量的增生平在調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)因子表達(dá)、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用方面的效果更為顯著。表3：各組大鼠外周血中免疫調(diào)節(jié)因子表達(dá)水平及CD4+CD8+T細(xì)胞比率（略）圖3：各組大鼠外周血中免疫調(diào)節(jié)因子表達(dá)的RT-PCR、ELISA及流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果（略）六、增生平抑制胃癌形成的作用機(jī)制探討6.1阻斷胃黏膜癌前病變胃黏膜癌前病變是胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵階段，若能有效阻斷這一階段，對(duì)于降低胃癌的發(fā)生率具有重要意義。本研究結(jié)果顯示，增生平能夠顯著抑制PCNA、cyclinD1、CDK4蛋白的表達(dá)，從而對(duì)胃黏膜的癌前病變起到較好的阻斷作用。PCNA作為一種反映細(xì)胞增殖活性的核蛋白，在DNA合成期含量最高。在正常胃黏膜組織中，PCNA的表達(dá)水平極低，這表明正常胃黏膜細(xì)胞的增殖處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。然而，在胃癌前病變模型組中，PCNA蛋白陽性表達(dá)率顯著升高，這意味著胃黏膜細(xì)胞的增殖活性大幅增強(qiáng)，細(xì)胞處于高度增殖狀態(tài)。這種異常的增殖狀態(tài)是胃癌前病變的重要特征之一，若不加以控制，細(xì)胞可能會(huì)持續(xù)增殖并發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。給予增生平干預(yù)后，高劑量組PCNA蛋白陽性表達(dá)率明顯降低，這說明增生平能夠有效抑制胃黏膜細(xì)胞的異常增殖，使細(xì)胞增殖活性恢復(fù)到相對(duì)正常的水平。cyclinD1在細(xì)胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。正常情況下，胃黏膜組織中cyclinD1蛋白陽性表達(dá)率較低，細(xì)胞周期進(jìn)程有序進(jìn)行。但在胃癌前病變模型組中，cyclinD1蛋白陽性表達(dá)率高達(dá)100%，這表明細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生了明顯改變，G1期向S期的轉(zhuǎn)換加速，細(xì)胞異常增殖。增生平高劑量組能夠顯著降低cyclinD1蛋白陽性表達(dá)率，這表明增生平可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制胃黏膜細(xì)胞的異常增殖，阻止細(xì)胞周期的異常轉(zhuǎn)換，從而阻斷胃黏膜癌前病變的發(fā)展。CDK4與cyclinD1結(jié)合形成復(fù)合物，是促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵因素。在正常胃黏膜組織中，CDK4蛋白陽性表達(dá)率較低，細(xì)胞周期正常推進(jìn)。而在胃癌前病變模型組中，CDK4蛋白陽性表達(dá)率達(dá)到100%，說明細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4的活性增強(qiáng)，促進(jìn)了細(xì)胞的異常增殖。增生平高劑量組能夠抑制CDK4蛋白的表達(dá)，降低其陽性表達(dá)率，這進(jìn)一步證實(shí)了增生平能夠抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4的表達(dá)，從而抑制胃黏膜細(xì)胞的增殖，阻止細(xì)胞從G1期過度進(jìn)入S期，有效阻斷胃黏膜癌前病變。從分子機(jī)制層面來看，增生平可能通過多種途徑發(fā)揮阻斷胃黏膜癌前病變的作用。一方面，增生平中的多種中藥成分可能直接作用于細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路，抑制PCNA、cyclinD1、CDK4等蛋白的表達(dá)。山豆根中的苦參堿、氧化苦參堿等生物堿類成分可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而減少這些蛋白的合成。另一方面，增生平可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，間接抑制胃黏膜細(xì)胞的異常增殖。免疫細(xì)胞和免疫因子可以識(shí)別和清除異常增殖的細(xì)胞，增生平能夠增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)免疫細(xì)胞對(duì)胃黏膜癌前病變細(xì)胞的監(jiān)視和殺傷，從而阻斷癌前病變的發(fā)展。阻斷胃黏膜癌前病變對(duì)于胃癌的預(yù)防具有至關(guān)重要的意義。胃癌前病變是一個(gè)可逆的階段，通過及時(shí)有效的干預(yù)，可以阻止其向胃癌的發(fā)展。增生平在抑制胃黏膜細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期方面的作用，為胃癌的預(yù)防提供了一種有效的手段。在臨床實(shí)踐中，對(duì)于患有慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生、異型增生等胃癌前病變的患者，可以考慮使用增生平進(jìn)行干預(yù)治療，以降低胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。這不僅可以減輕患者的痛苦，提高患者的生活質(zhì)量，還可以減少社會(huì)的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和社會(huì)意義。6.2調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著極為關(guān)鍵的角色，其異常激活是胃癌發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制之一。在正常生理狀態(tài)下，Wnt信號(hào)通路處于相對(duì)穩(wěn)定的調(diào)控狀態(tài)，維持著細(xì)胞的正常生物學(xué)功能。然而，在胃癌前病變及胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，Wnt信號(hào)通路常常出現(xiàn)異常激活的情況。在正常組大鼠胃黏膜組織中，GSK-3β蛋白表達(dá)水平較高，能夠有效地磷酸化β-catenin。被磷酸化的β-catenin會(huì)與APC、Axin等蛋白形成降解復(fù)合體，進(jìn)而被泛素化標(biāo)記，最終被蛋白酶體降解。這樣一來，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin水平得以維持在較低水平，無法進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，下游靶基因如c-myc等也不會(huì)被激活，從而保證細(xì)胞的正常增殖、分化和凋亡等過程。但在模型組大鼠胃黏膜組織中，由于受到MNNG等致癌因素的作用，GSK-3β蛋白表達(dá)水平明顯降低。這導(dǎo)致其對(duì)β-catenin的磷酸化能力減弱，β-catenin無法正常被降解。隨著β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的不斷積累，它會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，形成β-catenin/TCF/LEF復(fù)合物。該復(fù)合物能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合下游靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列，從而激活這些靶基因的轉(zhuǎn)錄。其中，c-myc基因的激活尤為顯著，c-myc基因編碼的蛋白質(zhì)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡，還參與細(xì)胞的代謝和分化等過程。c-myc基因的過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致胃黏膜細(xì)胞的增殖失控，細(xì)胞周期紊亂，最終促進(jìn)胃癌前病變的發(fā)生和發(fā)展。給予增生平干預(yù)后，高劑量組GSK-3β蛋白表達(dá)水平顯著升高，這表明增生平能夠上調(diào)GSK-3β蛋白的表達(dá)。上調(diào)后的GSK-3β蛋白恢復(fù)了對(duì)β-catenin的磷酸化能力，使β-catenin重新進(jìn)入降解途徑。細(xì)胞內(nèi)β-catenin的水平因此降低，進(jìn)入細(xì)胞核的β-catenin數(shù)量也隨之減少。這樣一來，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的β-catenin減少，下游靶基因如c-myc的轉(zhuǎn)錄激活受到抑制。c-myc基因表達(dá)水平的降低，使得胃黏膜細(xì)胞的增殖受到抑制，細(xì)胞周期逐漸恢復(fù)正常，從而有效地阻斷了胃癌前病變的發(fā)展，抑制了胃癌的形成。從分子層面來看，增生平可能通過多種方式調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路。增生平中的有效成分可能直接作用于GSK-3β基因的啟動(dòng)子區(qū)域，增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性，從而促進(jìn)GSK-3β蛋白的表達(dá)。也可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的其他信號(hào)分子，間接影響GSK-3β蛋白的表達(dá)和活性。山豆根中的苦參堿等成分可能通過激活某些上游信號(hào)通路，如PI3K-Akt通路，來上調(diào)GSK-3β蛋白的表達(dá)。拳參、夏枯草等藥物中的成分可能通過抑制β-catenin與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力，阻斷下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，從而發(fā)揮對(duì)Wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路對(duì)于抑制胃癌形成具有重要意義。Wnt信號(hào)通路的異常激活是胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素之一，通過調(diào)節(jié)該信號(hào)通路，可以從根本上阻斷胃癌前病變的發(fā)展，降低胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。在臨床治療中，對(duì)于胃癌前病變患者，應(yīng)用增生平調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路，有望成為一種有效的防治策略。這不僅為胃癌的早期干預(yù)提供了新的思路和方法，也為開發(fā)新型的胃癌防治藥物提供了理論依據(jù)。6.3增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)體的免疫功能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著至關(guān)重要的角色，免疫監(jiān)視功能的正常發(fā)揮能夠及時(shí)識(shí)別并清除體內(nèi)發(fā)生癌變的細(xì)胞，從而有效預(yù)防腫瘤的發(fā)生。然而，在胃癌前病變階段，機(jī)體的免疫功能常常出現(xiàn)異常，導(dǎo)致免疫監(jiān)視作用減弱，使得癌細(xì)胞得以逃脫免疫系統(tǒng)的監(jiān)管，進(jìn)而促進(jìn)胃癌的發(fā)展。在正常生理狀態(tài)下，IL-2作為一種重要的細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）的活性。T細(xì)胞在細(xì)胞免疫中發(fā)揮著核心作用，它們能夠識(shí)別并攻擊被病原體感染的細(xì)胞或癌細(xì)胞。NK細(xì)胞則具有天然的細(xì)胞毒性，能夠直接殺傷腫瘤細(xì)胞。CTL能夠特異性地識(shí)別并殺傷腫瘤細(xì)胞，是機(jī)體抗腫瘤免疫的重要防線。IL-2通過與T細(xì)胞、NK細(xì)胞和CTL表面的受體結(jié)合，激活一系列信號(hào)通路，促進(jìn)這些免疫細(xì)胞的增殖、分化和活化，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御和免疫監(jiān)視功能。但在胃癌前病變模型組中，IL-2mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低。這表明機(jī)體的免疫功能受到抑制，T細(xì)胞、NK細(xì)胞和CTL的活性下降，免疫監(jiān)視作用減弱。IL-2分泌減少，使得T細(xì)胞的增殖和活化受到抑制，NK細(xì)胞和CTL的殺傷能力降低，癌細(xì)胞更容易逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，為胃癌的發(fā)生發(fā)展創(chuàng)造了條件。給予增生平干預(yù)后，高劑量組IL-2mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著升高。這說明增生平能夠促進(jìn)IL-2的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。增生平可能通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌IL-2。它可能作用于T細(xì)胞，增強(qiáng)T細(xì)胞的活性，使其分泌更多的IL-2。增生平還可能調(diào)節(jié)其他細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)，間接促進(jìn)IL-2的表達(dá)。IL-2表達(dá)的增加，進(jìn)一步促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和活化，增強(qiáng)NK細(xì)胞和CTL的活性，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫監(jiān)視功能，有助于識(shí)別和清除胃黏膜癌前病變細(xì)胞，抑制胃癌的形成。IL-10和TGF-β是具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子。在正常情況下，它們的表達(dá)處于相對(duì)較低的水平，以維持機(jī)體免疫功能的平衡。然而，在胃癌前病變模型組中，IL-10和TGF-βmR