不同分子量紅芪多糖結(jié)構(gòu)表征及體外抗氧化活性比較摘要：目的制備不同分子量紅芪多糖HG-2、HG-3、HG-4，對(duì)其初級(jí)結(jié)構(gòu)和分子量大小進(jìn)行測(cè)定并研究分離純化過(guò)程對(duì)紅芪多糖體外抗氧化活性的影響；比較紫外-可見(jiàn)分光光度法與酶標(biāo)儀兩種儀器測(cè)定結(jié)果，選擇出更加簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確、快捷的方法。方法采用水提醇沉、sevage、Sephadex系列凝膠洗脫等方法分離純化制備不同分子量的紅芪多糖；紅外測(cè)定其初級(jí)結(jié)構(gòu)，水相GPC測(cè)定分子量大小及分布情況；紫外-可見(jiàn)分光光度法和酶標(biāo)儀法測(cè)定紅芪多糖對(duì)DPPH自由基清除能力大小。結(jié)果經(jīng)Sephadex系列凝膠洗脫得到紅芪多糖HG-2、HG-3、HG-4，可能為β-吡喃型糖。紅芪多糖HG-2、HG-3、HG-4分子量分布圖均呈單一峰，其Mw分別為3.27E+04、2.89E+04、3.20E+04，Mw/Mn分別為8.83、6.79、5.89，分子量分布較寬。純化后的紅芪多糖較紅芪總多糖在較低濃度即可對(duì)DPPH自由基發(fā)揮作用，但總體清除能力降低。結(jié)論紅芪多糖HG-2、HG-3、HG-4是β-吡喃型糖，分子量不同，具有一定抗氧化能力的多糖；采用酶標(biāo)儀法去測(cè)定更簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快捷，可以為制備量少的樣品測(cè)定提供方法參考。關(guān)鍵詞：紅芪多糖；抗氧化；分子量；紅外紅芪為豆科植物多序巖黃芪（HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.）的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、生精養(yǎng)血等功效，臨床常用于治療氣虛等證[1]。紅芪含有多種的活性成分，其中紅芪多糖為主要有效成分之一?，F(xiàn)代藥理研究表明免疫反應(yīng)和腸粘膜氧化應(yīng)激損傷是UC的重要發(fā)病機(jī)制，紅芪多糖具有良好的抗炎、調(diào)節(jié)免疫、和抗氧化應(yīng)激等方面的作用[2-4]，因此預(yù)示在UC的治療上具有良好應(yīng)用前景。前期課題組研究發(fā)現(xiàn)紅芪水提取部位對(duì)UC具有良好的治療作用，分析其主要發(fā)揮作用的是總多糖[5]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)分離出來(lái)的紅芪多糖HG-2、HG-3、HG-4分子量及其分布情況進(jìn)行測(cè)定，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步研究，同時(shí)探究不同分子量紅芪多糖的體外抗氧化能力的大小及紅芪多糖體外抗氧化活性在分離純化過(guò)程中的變化，為后續(xù)研究不同分子量紅芪多糖對(duì)UC的作用奠定基礎(chǔ)，也為解釋多糖構(gòu)效關(guān)系，進(jìn)一步擴(kuò)大紅芪在臨床的應(yīng)用范圍作出貢獻(xiàn)。1儀器與材料儀器型號(hào)公司紅外光譜儀ALPHA-T布魯克儀器有限公司GPC-凝膠滲透色譜系統(tǒng)P230型Elite，Dalian紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-3300上海美普達(dá)儀器有限公司超聲波清洗器KQ-500D型昆山市超聲儀器有限公司酶標(biāo)儀IMARK美國(guó)伯樂(lè)公司電子分析天平上海實(shí)驗(yàn)器材有限公司試劑公司1,1-二苯基-2-苦基苯肼自由基\o"北京中生瑞泰科技有限公司"北京中生瑞泰科技有限公司乙醇天津市大茂化學(xué)試劑廠丙酮天津東方化工廠，分析純SephadexG-25、G-75、G-200北京索萊寶生物科技有限公司96微孔板上海晶抗生物工程有限公司中藥藥材紅芪于甘肅省隴西縣首陽(yáng)鎮(zhèn)采（購(gòu)），由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)楊扶德教授鑒定其為豆科植物多序巖黃芪（HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.）的干燥根。2研究方法與結(jié)果2.1不同分子量紅芪多糖的制備[6]稱取適量的紅芪，采用的方法為水提醇沉法，得紅芪總多糖，sevage法除蛋白，采用Sephadex系列G-25、G-75、G-100柱洗脫，苯酚-濃硫酸法檢測(cè)，合并主流峰，醇沉后分別得到紅芪多糖HG-2、HG-3、HG-4。2.2紅芪多糖HG-4的紅外光譜分析分別精密稱取紅芪多糖HG-2、HG-3、HG-4粉末，溴化鉀（KBr）適量，充分研磨均勻，壓片，測(cè)定得到IR譜圖。見(jiàn)圖1紅芪多糖HG-2的紅外光譜圖紅芪多糖HG-3的紅外光譜圖紅芪多糖HG-4的紅外光譜圖圖1紅芪多糖HG-2、HG-3、HG-4的紅外光譜圖結(jié)果:在3600～3200cm-1、3000～2800cm-1和1400～1200cm-1處均具有多糖的特征吸收峰。在3355cm-1有強(qiáng)吸收峰，可能是氫鍵-OH的伸縮振動(dòng)引起；在2934cm-1有吸收峰，可能是CH伸縮振動(dòng)引起；在1609cm-1～1420cm-1有吸收峰，可能是CH或OH的面內(nèi)伸縮振動(dòng)；在1024cm-1有β-吡喃糖環(huán)形成的特征吸收峰，在763.63cm-1處有吸收峰，可能是由吡喃型糖環(huán)形成的特征峰。綜上可知HG-2、HG-3、HG-4均滿足多糖的一般特征，并且存在β類型的苷鍵，可能為β-吡喃型糖。2.3紅芪多糖HG-4分子量2.3.1水相GPC條件儀器型號(hào)：P230型GPC-凝膠滲透色譜系統(tǒng)（Elite，Dalian）；色譜柱：PLaquagel-OHMIXED（7.5mml.D*30cm）（Agilent，US）；進(jìn)樣流速：1.0mL·min-1；柱溫：40℃；流動(dòng)相：0.1MNaNO3。制備供試品溶液的方法：分別準(zhǔn)確稱量紅芪多糖HG-2、HG-3、HG-4樣品6.0mg，量取3.0mL超純水將其溶解，過(guò)0.22m水相濾膜，備用。2.3.2不同分子量紅芪多糖的分子量測(cè)定以上述條件對(duì)紅芪多糖HG-4進(jìn)行水相GPC分析，得到紅芪多糖HG-2、HG-3、HG-4的重均分子量及分子量分布。結(jié)果：可知后紅芪多糖HG-2的重均分子量（Mw）是32700，分散系數(shù)為8.83；HG-3的Mw是28900，分散系數(shù)為6.79；HG-4的Mw為32000，分子量分散系數(shù)5.89。由此可知由葡聚糖凝膠G-25、G-75、G-100洗脫下來(lái)的紅芪多糖具有不同的分子量，且分布帶較寬，這可能與其單糖組成的糖鏈長(zhǎng)短不同有關(guān)，其分子量呈單一峰，表明其純度較高，這與課題組前期研究其相應(yīng)的單糖組成和純度鑒定結(jié)果相符合。樣品名稱分子量類型MnMwMzMw/MnHG-2平均分子量3.71E+033.27E+044.52E+058.83HG-34.25E+032.89E+043.44E+056.79HG-45.44E+033.20E+041.68E+055.89表4紅芪多糖HG-2、HG-3、HG-4的平均分子量紅芪多糖HG-2分子量分布圖紅芪多糖HG-3分子量分布圖紅芪多糖HG-4分子量分布圖（橫軸：分子量對(duì)數(shù)；縱軸：曲線上某一點(diǎn)縱軸值為每個(gè)分子量下樣品分子的含量多少相關(guān)的數(shù)值。）圖7紅芪多糖HG-2、HG-3、HG-4分子量分布圖2.4紅芪多糖體外抗氧化活性比較2.4.1紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定[7]脫蛋白紅芪多糖體外抗氧化測(cè)定：精密稱取脫蛋白紅芪多糖適量，蒸餾水配制成0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0、2.2、2.4mg/mL系列濃度梯度。精密吸取脫蛋白紅芪多糖溶液3mL，加入0.09mmol/LDPPH乙醇溶液1mL，充分混勻后室溫避光反應(yīng)30min，以EtOH作參比在520nm處測(cè)定吸光度A樣。取2mLDPPH與1mL無(wú)水乙醇混合液，以EtOH作參比在520nm處測(cè)定吸光度A對(duì)。取脫蛋白紅芪多糖溶液2mL與1mL乙醇溶液混勻，以EtOH作參比在520nm處測(cè)定吸光度A空。計(jì)算清除率（%）=1-（A樣-A空）/A對(duì)*100。結(jié)果知采用紫外-可見(jiàn)光分光光度法測(cè)得的脫蛋白紅芪多糖在2.4mg/mL時(shí)清除率是36.7%，在0.6-2.4mg/mL濃度范圍內(nèi)清除作用于質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。見(jiàn)圖1。圖1脫蛋白紅芪多糖測(cè)定結(jié)果方法學(xué)的考察精密度實(shí)驗(yàn)：精密稱取脫蛋白紅芪多糖適量，配制成1mL/mg多糖溶液，按照“”項(xiàng)下方法在520nm處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算結(jié)果的RSD值為0.38%，說(shuō)明所使用的儀器精密度良好。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：精密稱取脫蛋白紅芪多糖適量，配制成6份濃度為1mL/mg多糖溶液，按照“”項(xiàng)下方法在520nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算結(jié)果的RSD值為2.13%，說(shuō)明此實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。2.4.2酶標(biāo)儀法測(cè)定[8]不同分子量紅芪多糖體外抗氧化測(cè)定：采用96微孔板法測(cè)定不同分子量紅芪多糖對(duì)DPPH自由基清除能力即精密稱取適量的紅芪總多糖，蒸餾水充分溶解，配制成一定濃度梯度。精密吸取紅芪總多糖溶液3mL，加入0.09mmol/LDPPH乙醇溶液1mL，充分混勻后室溫避光反應(yīng)30min，移液槍吸取200uL于96微孔板在520nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算清除率，公式如下：清除率（%）=1-（A樣-A空）/A對(duì)*100（其中A樣：紅芪多糖溶液+DPPH-乙醇溶液測(cè)得的吸光度值；A空：紅芪多糖溶液+無(wú)水乙醇測(cè)得的吸光度值；A對(duì)：蒸餾水+DPPH-乙醇溶液測(cè)得的吸光度值。）脫蛋白紅芪多糖、紅芪多糖HG-2、HG-3、HG-4測(cè)定方法同上。結(jié)果見(jiàn)圖2-6。結(jié)果：采用酶標(biāo)儀法測(cè)得的脫蛋白多糖在0.6-2.4mg/mL范圍內(nèi)質(zhì)量與濃度呈正相關(guān)，最大清除率為38.4%，與UV-Vis測(cè)定結(jié)果相近。紅芪總多糖的質(zhì)量濃度在1-6mg/mL范圍內(nèi)清除率隨質(zhì)量濃度增大而遞增，在5mg/mL時(shí)清除率達(dá)到50%以上。而不同分子量紅芪多糖HG-2、HG-3、HG-4測(cè)定結(jié)果相近，在0.6-2.4mg/mL時(shí)，紅芪多糖HG-2最大清除率為44.5%，紅芪多糖HG-3最大清除率為40.9%，紅芪多糖HG-4最大清除率為46.2%。圖2紅芪總多糖測(cè)定結(jié)果圖3脫蛋白紅芪多糖測(cè)定結(jié)果圖4紅芪多糖HG-2測(cè)定結(jié)果圖5紅芪多糖HG-3測(cè)定結(jié)果圖6紅芪多糖HG-4測(cè)定結(jié)果方法學(xué)的考察精密度實(shí)驗(yàn)：精密稱取脫蛋白紅芪多糖適量，配制成1mL/mg多糖溶液，按照“”項(xiàng)下方法在520nm處測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算結(jié)果的RSD值為0.18%，說(shuō)明所使用的儀器精密度良好。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：精密稱取脫蛋白紅芪多糖適量，配制成6份濃度為1mL/mg多糖溶液，按照“”項(xiàng)下方法在520nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算結(jié)果的RSD值為1.62%，說(shuō)明此實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。3討論紅芪是甘肅道地藥材，具有多種化學(xué)成分和藥理作用，其中紅芪多糖是紅芪的主要活性部位，具有良好的抗氧化、免疫調(diào)節(jié)作用?，F(xiàn)代研究表明免疫反應(yīng)和腸粘膜氧化應(yīng)激損傷是UC的重要發(fā)病機(jī)制，預(yù)示紅芪多糖在UC的治療上可能具有一定治療作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)分離純化得到的紅芪多糖HG-2、HG-3、HG-4進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)其均具有多糖的特征吸收峰，存在β類型的苷鍵，有吡喃型糖環(huán)形成的特征峰，可能為β-吡喃型糖。而紅芪多糖HG-2、HG-3、HG-4分子量分布圖均呈單一峰且分子量分布較寬。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脫蛋白紅芪多糖與不同分子量紅芪多糖相較紅芪總多糖在低濃度下即可對(duì)DPPH自由基發(fā)揮作用，說(shuō)明其具有一定的抗氧化能力；但紅芪總多糖在5mg/mL時(shí)清除率可達(dá)50%以上，而純化后的脫蛋白紅芪多糖和不同分子量紅芪多糖清除率則均低于50%，說(shuō)明紅芪多糖可能在純化過(guò)程中抗氧化活性會(huì)下降，具體原因值得進(jìn)一步探討研究。目前體外抗氧化實(shí)驗(yàn)多采用UV-Vis測(cè)定，但其工作量大，操做過(guò)于繁瑣。而酶標(biāo)儀是酶聯(lián)免疫測(cè)定的常規(guī)儀器，在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用在不斷擴(kuò)大。本實(shí)驗(yàn)還比較了UV-Vis和酶標(biāo)儀法兩種抗氧化測(cè)定方法，研究發(fā)現(xiàn)酶標(biāo)儀法更簡(jiǎn)單，方便，快速，敏捷，且結(jié)果準(zhǔn)確可靠，而且樣品的需求量較少，這為制備量少的樣品測(cè)定提供方法參考。[1]中國(guó)藥典[S].2015年版.一部.425-1749.[2]黎笑蘭,張新廣,尹少萍.白芨多糖抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2020,40(02):224-228.[3]宋亞芳,裴麗霞,趙婷婷,孫建華.潰瘍性結(jié)腸炎免疫因素發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào),2019,32(04):432-436.[5]牛江濤,曹瑞,張澤國(guó),徐富菊,李越峰.紅芪多糖的提取分離及藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥房,2017,28(01):130-133.[6]燕玉奎,王志旺,郭玫,周尚儒,王君梅.