醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇與傳代操作規(guī)程

依據(jù)《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》《醫(yī)療器械監(jiān)督管理條例》《醫(yī)療

器械注冊與備案管理辦法》《醫(yī)療器械生產(chǎn)監(jiān)督管理辦法》編制

1.目的

1.1規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC/CMCC/NIM溯源)的復(fù)蘇、傳代、純度驗

證、儲存操作，確保菌株活性、純度符合要求；

1.2防止菌株污染、變異或失活，保障微生物檢測(無菌檢查、限

度檢查、消毒效果驗證)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可重復(fù)性；

1.3符合GMP、ISO11133:2021及YY/T0962-2014等法規(guī)要求，

確保操作可追溯、可復(fù)核。

2.范圍

2.1適用菌株：本規(guī)程適用于企業(yè)微生物檢測用所有標(biāo)準(zhǔn)菌株，包

括但不限于：

·細(xì)菌：大腸埃希菌(ATCC25922/CMCC44102)、金黃色葡萄球

菌(ATCC6538/CMCC26003)、枯草芽孢桿菌黑色變種(ATCC

9372/CMCC63501)等；

·真菌：白色念珠菌(ATCC10231/CMCC98001)、黑曲霉(ATCC

16404/CMCC3.5808)等；

·其他：按檢測需求引入的NIM溯源標(biāo)準(zhǔn)菌株。

2.2適用場景：菌株首次復(fù)蘇、定期傳代、應(yīng)急備用菌株制備、儲

第1頁共13頁

醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇與傳代操作規(guī)程1

存條件變更后的復(fù)蘇驗證。

3.職責(zé)

3.1微生物檢驗工程師：

·嚴(yán)格按本規(guī)程執(zhí)行菌株復(fù)蘇、傳代、接種操作；

·負(fù)責(zé)復(fù)蘇/傳代過程的質(zhì)量控制(純度、活性驗證);

·及時、準(zhǔn)確填寫操作記錄，確保符合ALCOA+原則；

·發(fā)現(xiàn)異常(污染、菌株失活)立即啟動偏差處理。

3.2質(zhì)量負(fù)責(zé)人：

·審核菌株復(fù)蘇/傳代記錄及質(zhì)量控制結(jié)果；

·批準(zhǔn)菌株用于檢測或儲存；

·監(jiān)督本規(guī)程的執(zhí)行合規(guī)性。

3.3設(shè)備部：

·保障生物安全柜、培養(yǎng)箱、冰箱等設(shè)備正常運行及校準(zhǔn)；

·定期維護(hù)實驗室環(huán)境(溫濕度、潔凈度)。

3.4試劑管理員：

·提供經(jīng)適用性驗證合格的培養(yǎng)基、稀釋液、無菌耗材；

·確保試劑在有效期內(nèi)使用。

4.法規(guī)依據(jù)與術(shù)語定義

4.1法規(guī)依據(jù)：

第2頁共13頁

醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇與傳代操作規(guī)程2

·2025版《醫(yī)療器械生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》及附錄；

·ISO11133:2021《微生物學(xué)用于微生物檢測的標(biāo)準(zhǔn)樣品和質(zhì)量

控制樣品要求和指南》;

·YY/T0962-2014《醫(yī)療器械總有機(jī)碳測定方法》;

·GB19489-2008《實驗室生物安全通用要求》;

·《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理辦法》(國家市場監(jiān)管總局2019年第42

號)。

4.2術(shù)語定義：

·復(fù)蘇：將冷凍干燥或低溫保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株恢復(fù)活性并培養(yǎng)至對數(shù)

生長期的過程；

·傳代：將復(fù)蘇后或培養(yǎng)成熟的菌株轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基，保持菌株

活性與純度的操作；

·傳代次數(shù)：自原始菌株復(fù)蘇后開始計數(shù)，一般不超過5代(避

免菌株變異);

·純培養(yǎng)：單一菌株在無菌條件下培養(yǎng)，無其他雜菌污染。

5.操作前準(zhǔn)備

5.1環(huán)境與設(shè)備準(zhǔn)備

準(zhǔn)備項目要求驗證方法

實驗室環(huán)境BSL-2實驗室，溫濕度20-26℃記錄環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)，

/40-60%RH,萬級潔凈度，沉降查看沉降菌檢測報告

菌≤1CFU/皿(30min)

第3頁共13頁

醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇與傳代操作規(guī)程3

生物安全柜ClassII型，運行正常，操作前檢查設(shè)備運行狀態(tài)，

紫外線消毒30min,風(fēng)速0.38-核對校準(zhǔn)證書(有效

0.51m/s期內(nèi))

培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)箱(35-37℃/25-記錄培養(yǎng)箱溫度，查

28℃),溫度波動≤±0.5℃;真看溫度校準(zhǔn)報告

菌培養(yǎng)需帶濕度控制(70-80%)

儲存設(shè)備-80℃超低溫冰箱(長期儲存)、核對冰箱溫度日志，

2-8℃冷藏冰箱(短期儲存),溫確保符合儲存要求

度記錄完整

5.2試劑與耗材準(zhǔn)備

物品名稱要求驗證方法

培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB)、胰查看培養(yǎng)基適用性驗

酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、沙氏證報告，核對批號、

葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)等，經(jīng)適有效期

用性驗證合格(促生長率≥90%)

稀釋液無菌生理鹽水(0.9%NaCl)或磷酸查看無菌檢查報告，

鹽緩沖液(PBS),無菌性驗證合格確保無雜菌污染

無菌耗材培養(yǎng)皿(φ90mm)、移液管檢查耗材包裝完整

(1mL/10mL,A級)、離心管性，核對滅菌批號、

(1.5mL)、接種環(huán)(一次性/可有效期

滅菌)等，無菌包裝完好

輔助試劑革蘭氏染色液、生化鑒定卡(VITEK核對試劑批號、有效

2Compact)、麥?zhǔn)媳葷峁艿?，在有期，查看儲存條件是

效期內(nèi)否符合要求

5.3菌株準(zhǔn)備

準(zhǔn)備項目要求操作步驟

第4頁共13頁

醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇與傳代操作規(guī)程4

菌株信息原始菌株：冷凍干燥管/甘油核查溯源證書編號、批

確認(rèn)管，具備有效溯源證書號、儲存條件，記錄菌

(ATCC/CMCC/NIM),批號與實物株名稱、編號、復(fù)蘇次

一致數(shù)

菌株解凍室溫下緩慢解凍(避免劇烈震解凍后立即操作，避免

(冷凍干蕩),或按供應(yīng)商推薦方法解凍長時間暴露在室溫環(huán)境

燥管)

菌株解凍37℃水浴快速解凍(1-2min),解凍后迅速轉(zhuǎn)移至生物

(甘油解凍后立即接種(避免反復(fù)凍安全柜，禁止室溫放置

管)融)超過30min

6.核心操作流程

6.1標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇操作(冷凍干燥管)

步驟編操作內(nèi)容操作要求與注記錄要點

號意事項

6.1.11.生物安全柜內(nèi)，用無菌移液管一移液管避免記錄稀釋

復(fù)水吸取0.5-1.0mL無菌稀釋液(生觸碰管壁，防液類型、

理鹽水/TSB);2.緩慢注入冷止污染；一禁體積，復(fù)

凍干燥管，輕輕旋轉(zhuǎn)混合，靜置止劇烈震蕩，水時間

5-10min(使菌株充分溶解)避免菌株受損

6.1.21.用無菌移液管吸取復(fù)水后的菌-接種過程嚴(yán)記錄接種

接種培懸液，接種至含10mLTSB培養(yǎng)格無菌操作，量、培養(yǎng)

養(yǎng)基的試管中(接種量0.1-避免雜菌污溫度、培

0.2mL);2.細(xì)菌：35-37℃振蕩染；一振蕩培養(yǎng)時間、

培養(yǎng)(150rpm)18-24h;真菌：養(yǎng)確保菌株充培養(yǎng)方式

25-28℃靜置培養(yǎng)48-72h分接觸培養(yǎng)基

6.1.31.取培養(yǎng)后的菌液，用無菌生理一稀釋過程嚴(yán)記錄稀釋

初步純鹽水梯度稀釋至10-10-;2.取格按無菌操倍數(shù)、涂

化0.1mL稀釋液，均勻涂布于作，避免交叉

第5頁共13頁

醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇與傳代操作規(guī)程5

TSA/SDA平板；3.細(xì)菌：35-污染；一涂布布量、培

37℃培養(yǎng)18-24h;真菌：25-均勻，確保菌養(yǎng)條件

28℃培養(yǎng)48-72h落分離清晰

6.1.41.觀察平板菌落形態(tài)，挑取3-單菌落需形記錄菌落

單菌落個形態(tài)一致的單菌落；2.分別接態(tài)均一、無雜形態(tài)(顏

挑取種至新的TSA/SDA平板(劃線接菌菌落；-劃色、大

種),進(jìn)行純培養(yǎng)線接種采用四小、邊

區(qū)劃線法，確緣、隆起

保純化效果度),是

否有雜菌

6.2標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇操作(甘油管)

步驟編操作內(nèi)容操作要求與注意事記錄要點

號項

6.2.11.生物安全柜內(nèi)，用-甘油濃度過高會記錄接種方

直接接無菌接種環(huán)挑取少量甘抑制菌株生長，接式(平板/

種油菌(避免帶出過多甘種后可離心液體),是

油);2.劃線接種至(5000rpm,5min)否去除甘油

TSA/SDA平板，或接種去除甘油；一接種

至10mLTSB培養(yǎng)基試環(huán)滅菌后冷卻使

管用，避免燙傷菌株

6.2.21.平板培養(yǎng)：細(xì)菌-觀察培養(yǎng)物狀記錄培養(yǎng)時

純培養(yǎng)35-37℃/18-24h,真菌態(tài)，細(xì)菌液體培養(yǎng)間、培養(yǎng)物

25-28℃/48-72h;2.應(yīng)渾濁，真菌液體狀態(tài)(渾濁

液體培養(yǎng)：細(xì)菌35-培養(yǎng)應(yīng)形成菌絲體度、菌落形

37℃振蕩培養(yǎng)18-或孢子懸液態(tài))

24h,真菌25-28℃靜

置培養(yǎng)48-72h

6.2.3同6.1.4步驟，挑取記錄菌落形態(tài)，確

單菌落單菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，確認(rèn)無雜菌污染

分離保菌株純度

第6頁共13頁

醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇與傳代操作規(guī)程6

6.3標(biāo)準(zhǔn)菌株傳代操作

步驟操作內(nèi)容操作要求與注意記錄要點

編號事項

6.3.11.確認(rèn)待傳代菌株：純培養(yǎng)物一傳代次數(shù)超過記錄待傳

傳代(無雜菌、形態(tài)一致),傳代次5代的菌株禁止代菌株名

前準(zhǔn)數(shù)≤4代；2.準(zhǔn)備新鮮培養(yǎng)基用于檢測，需重稱、傳代

備(TSA/TSB/SDA),滅菌后冷卻至新復(fù)蘇原始菌次數(shù)、培

45-50℃(平板制備)或室溫(液株；-平板制備養(yǎng)基類型

體培養(yǎng)基)后倒置凝固，避

免冷凝水滴落

6.3.2方法1:平板劃線傳代1.無菌接-劃線接種確保記錄接種

接種種環(huán)挑取單菌落；2.按四區(qū)劃線每區(qū)菌落逐漸稀方法、接

操作法接種至新鮮TSA/SDA平板；3.釋，最終形成單種量、培

細(xì)菌35-37℃培養(yǎng)18-24h,真菌菌落；一液體傳養(yǎng)條件

25-28℃培養(yǎng)48-72h;方法2:代接種量不宜過

液體傳代1.用無菌移液管吸取多，避免營養(yǎng)競

0.1-0.2mL菌液，接種至10mL爭

新鮮TSB培養(yǎng)基；2.細(xì)菌振蕩

培養(yǎng)，真菌靜置培養(yǎng)

6.3.31.觀察菌落形態(tài)：與標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)一-若發(fā)現(xiàn)形態(tài)異記錄菌落

傳代致(如大腸埃希菌為圓形、光?；螂s菌污染，形態(tài)、染

后質(zhì)滑、乳白色菌落);2.純度驗立即啟動偏差處色結(jié)果、

量控證：革蘭氏染色鏡檢，無雜菌理；一活性驗證活性狀

制(細(xì)菌為單一革蘭氏陽性/陰可采用比濁法態(tài)，是否

性，真菌為單一菌絲體/孢(麥?zhǔn)媳葷峁?合格

子);3.活性驗證：液體培養(yǎng)物粗略判定

應(yīng)渾濁，平板培養(yǎng)菌落計數(shù)符合

預(yù)期(10?~108CFU/mL)

6.4菌株儲存操作

第7頁共13頁

醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇與傳代操作規(guī)程7

儲存類型操作內(nèi)容操作要求與注記錄要點

意事項

短期儲存1.平板儲存：純培養(yǎng)后的-平板儲存避記錄儲存

(2-TSA/SDA平板，用封口膜密免堆疊過厚，方式、儲

8℃,1封，倒置儲存于2-8℃冰箱；防止菌落受存溫度、

個月內(nèi))2.液體儲存：TSB培養(yǎng)物中加壓；-液體儲分裝量、

入20%無菌甘油(終濃度存需標(biāo)注甘油儲存起始

10%),分裝至無菌離心管，密終濃度，避免日期

封后冷藏凍融

長期儲存1.制備菌懸液：挑取單菌落接-甘油需無記錄菌懸

(-種至TSB培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對數(shù)菌、無雜質(zhì)，液濃度、

80℃,1-生長期(18-24h);2.離心收避免抑制菌株甘油終濃

2年)集菌體：5000rpm,5min,棄上生長；-凍存度、分裝

清，用無菌生理鹽水重懸；3.管密封嚴(yán)密，管數(shù)、凍

加入無菌甘油(終濃度15-防止液氮進(jìn)入存日期、

20%),輕輕混勻；4.分裝至或泄漏；一避解凍次數(shù)

無菌凍存管(每管0.5mL),免反復(fù)凍融，

標(biāo)注信息后放入-80℃冰箱每次使用后剩

(可先置于-20℃冷凍2h,余菌株丟棄

再轉(zhuǎn)移至-80℃)

備用菌株原始菌株復(fù)蘇后，制備3-5份一備用菌株與記錄備用

儲存?zhèn)溆脙龃婀?，單獨存放，?biāo)注常規(guī)使用菌株菌株數(shù)

“備用”字樣分區(qū)儲存；一量、儲存

定期(每6個位置、復(fù)

月)復(fù)核備用核日期及

菌株活性結(jié)果

7.質(zhì)量控制要求

7.1復(fù)蘇/傳代質(zhì)量控制

控制項目控制標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法不合格處理

第8頁共13頁

醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇與傳代操作規(guī)程8

純度驗證1.平板菌落形態(tài)均1.肉眼觀察菌立即啟動偏差處

一，無雜菌菌落；2.落形態(tài)；2.革理(DR-MICRO-

革蘭氏染色鏡檢為單一蘭氏染色鏡STD-2028-

菌體形態(tài)；3.生化鑒檢；3.生化鑒002),廢棄該批

定(VITEK2)匹配度定卡檢測次菌株，重新復(fù)

≥99%蘇原始菌株

活性驗證1.液體培養(yǎng)物：細(xì)菌1.觀察培養(yǎng)物若活性不足，延

18-24h渾濁生長，真狀態(tài)；2.麥?zhǔn)祥L培養(yǎng)時間(細(xì)

菌48-72h形成菌絲比濁法或平板菌≤36h,真菌≤

體；2.平板培養(yǎng)：菌計數(shù)法測定濃96h);仍不合格

落計數(shù)10?108CFU/mL度則重新復(fù)蘇

(比濁法：0.5-1.0麥

氏單位)

穩(wěn)定性驗傳代后菌株與原始菌株對比生化鑒定若特性不一致，

證的生化特性、抗菌敏感結(jié)果、抗菌藥停止使用該菌

性一致敏試驗結(jié)果株，重新復(fù)蘇原

(如適用)始菌株并驗證

7.2儲存質(zhì)量控制

控制項目控制標(biāo)準(zhǔn)檢驗頻率操作要求

短期儲存菌株活性保持≥每15天抽查挑取少量菌株接種至

(2-8℃)90%,無雜菌污染1次新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)后

驗證純度與活性

長期儲存菌株活性保持≥每6個月復(fù)核解凍1支備用菌株，

(-80℃)80%,無雜菌污染1次復(fù)蘇后進(jìn)行純度、活

性、生化特性驗證

儲存環(huán)境2-8℃冰箱溫度每日記錄2次溫度異常時立即啟動

監(jiān)控2-8℃,-80℃冰溫度應(yīng)急預(yù)案，轉(zhuǎn)移菌株

箱溫度≤-70℃,至備用冰箱，排查設(shè)

波動≤±5℃?zhèn)涔收?/p>

第9頁共13頁

醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇與傳代操作規(guī)程9

8.風(fēng)險控制與偏差處理

8.1主要風(fēng)險及控制措施

潛在風(fēng)險風(fēng)險等級(嚴(yán)重度控制措施

×發(fā)生概率)

菌株污染高風(fēng)險(4×2)1.操作前生物安全柜紫外線消毒

30min,操作過程嚴(yán)格無菌；2.培養(yǎng)

基、稀釋液、耗材使用前核查無菌性；

3.操作人員穿戴無菌服、手套、口

罩，避免人為污染

菌株失活中風(fēng)險(3×2)1.嚴(yán)格按供應(yīng)商推薦條件復(fù)蘇、儲

存，避免反復(fù)凍融；2.傳代次數(shù)不超

過5代，定期復(fù)核菌株活性；3.備用

菌株單獨儲存，確保應(yīng)急使用

菌株變異中風(fēng)險(3×1)1.傳代過程避免過度培養(yǎng)(細(xì)菌≤

24h,真菌≤72h);2.定期對比傳代

菌株與原始菌株的生化特性；3.長期

儲存采用甘油凍存法，減少變異概率

操作失誤低風(fēng)險(2×2)1.操作前核對菌株名稱、編號、培養(yǎng)

(如接種基類型；2.關(guān)鍵步驟雙人復(fù)核(如接

錯誤)種量、培養(yǎng)條件);3.操作人員經(jīng)培

訓(xùn)考核合格后方可上崗

8.2偏差處理流程

1.偏差識別：復(fù)蘇/傳代過程中發(fā)現(xiàn)菌株污染、失活、形態(tài)異

常、傳代次數(shù)超標(biāo)等不符合控制標(biāo)準(zhǔn)的情況；

2.偏差上報：發(fā)現(xiàn)偏差后24小時內(nèi)填寫《偏差處理報告》(DR-

第10頁共13頁

醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)蘇與傳代操作規(guī)程10

MICRO-STD-2028-002),上報質(zhì)量負(fù)責(zé)人；

3.根本原因分析：采用5Why分析法，排查風(fēng)險來源(如操作污

染、培養(yǎng)基不合格、設(shè)備故障等);

4.糾正措施：如廢棄不合格菌株、重新復(fù)蘇原始菌株、更換培養(yǎng)基

/耗材、維修設(shè)備等；

5.效果驗證：實施糾正措施后，重新進(jìn)行菌株復(fù)蘇/傳代，驗證

質(zhì)量控制指標(biāo)是否合格；

6.記錄歸檔：偏差處理完成后，將報告及驗證記錄歸檔至質(zhì)量部檔

案庫，保存期限≥5年。

9.記錄與歸檔

9.1必備記錄表格

記錄名稱編號填寫要求保存期限

《標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)REC-MIC-記錄菌株信息、復(fù)蘇步驟、≥5年

蘇記錄表》009-01培養(yǎng)條件、質(zhì)量控制結(jié)果，

操作人員簽字確認(rèn)

《標(biāo)準(zhǔn)菌株傳REC-MIC-記錄傳代次數(shù)、接種方法、≥5年

代記錄表》009-02培養(yǎng)條件、純度/活性驗證

結(jié)果，雙人復(fù)核簽字

≥5年

《標(biāo)準(zhǔn)菌株儲REC-MIC-記錄儲存方式、溫度、分裝

存記錄表》009-03量、解凍次數(shù)、復(fù)核結(jié)果，(至菌株

管理員簽字