實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)定一、總則

細(xì)胞培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究的重要技術(shù)手段，為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，必須嚴(yán)格遵守規(guī)范的操作流程。本規(guī)定旨在明確細(xì)胞培養(yǎng)的基本原則、操作步驟、質(zhì)量控制及安全防護(hù)要求，適用于所有涉及細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)操作人員。

二、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備與設(shè)備要求

（一）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境

1.實(shí)驗(yàn)室應(yīng)位于安靜、潔凈的環(huán)境中，避免強(qiáng)光直射和振動(dòng)干擾。

2.空氣潔凈度應(yīng)達(dá)到ISO5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，空氣流速為30-50L/min，溫濕度控制在22±2℃、50±10%。

3.實(shí)驗(yàn)臺(tái)面需使用防腐蝕、易清潔的材料，定期消毒（如使用70%乙醇或0.1%次氯酸鈉溶液）。

（二）設(shè)備要求

1.超凈工作臺(tái)：需定期檢測(cè)紫外燈強(qiáng)度（≥30μW/cm2）和風(fēng)速，使用前用70%乙醇擦拭臺(tái)面。

2.CO?培養(yǎng)箱：溫度控制在37±0.5℃，CO?濃度維持在5±0.5%，定期校準(zhǔn)pH值（使用pH7.0緩沖液）。

3.生物安全柜：操作前需進(jìn)行泄漏測(cè)試，使用后用70%乙醇噴灑表面并關(guān)閉紫外燈30分鐘。

三、細(xì)胞培養(yǎng)基本操作流程

（一）細(xì)胞準(zhǔn)備

1.培養(yǎng)基配制：

(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基（如DMEM/F12）：添加10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（penicillin/streptomycin）、1%L-谷氨酰胺。

(2)根據(jù)需求添加細(xì)胞因子（如EGF、FGF），濃度參考說(shuō)明書（通常10-100ng/mL）。

2.細(xì)胞復(fù)蘇：

(1)用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，37℃水浴3-5分鐘。

(2)加入培養(yǎng)基終止消化，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)（如細(xì)胞密度達(dá)1×10?/mL）。

（二）細(xì)胞接種與傳代

1.接種步驟：

(1)用75%酒精擦拭培養(yǎng)瓶，紫外燈照射30分鐘。

(2)加入含細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.傳代操作：

(1)用胰蛋白酶消化舊細(xì)胞，棄上清后加入培養(yǎng)基重懸。

(2)按1:3或1:4比例接種，確保接種密度不超過(guò)80%。

（三）日常維護(hù)

1.每日觀察細(xì)胞狀態(tài)，記錄生長(zhǎng)情況（如貼壁率、形態(tài)變化）。

2.培養(yǎng)基更換：每2-3天更換1/2培養(yǎng)基，傳代前需棄舊培養(yǎng)基。

四、質(zhì)量控制與安全防護(hù)

（一）質(zhì)量控制

1.細(xì)胞污染檢測(cè)：定期使用相差顯微鏡檢查支原體、酵母菌污染。

2.培養(yǎng)基檢測(cè)：使用無(wú)菌測(cè)試（如培養(yǎng)皿法）檢測(cè)細(xì)菌污染，pH值每日檢測(cè)。

（二）安全防護(hù)

1.操作規(guī)范：

(1)佩戴無(wú)菌手套，避免接觸皮膚和衣物。

(2)使用移液器時(shí)避免氣泡，吸頭一次性使用。

2.廢棄物處理：培養(yǎng)基、細(xì)胞殘?jiān)杞?jīng)高壓滅菌（121℃、15分鐘）后丟棄。

五、記錄與保存

（一）實(shí)驗(yàn)記錄

1.記錄每次操作的關(guān)鍵參數(shù)（如培養(yǎng)基批號(hào)、細(xì)胞passages）。

2.細(xì)胞凍存管需標(biāo)注日期、細(xì)胞類型及凍存濃度（如-80℃保存）。

（二）細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

1.凍存步驟：

(1)細(xì)胞重懸后加入凍存液（含10%DMSO和基礎(chǔ)培養(yǎng)基）。

(2)線性降溫至-80℃，24小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)移至液氮罐。

2.復(fù)蘇步驟：

(1)快速解凍（37℃水浴1分鐘），立即加入預(yù)溫培養(yǎng)基。

(2)1小時(shí)內(nèi)接種，復(fù)蘇率應(yīng)≥80%。

六、附則

1.本規(guī)定由實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人監(jiān)督執(zhí)行，每年更新一次。

2.人員需通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培訓(xùn)（考核合格后方可操作）。

**一、總則**

細(xì)胞培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究中的基礎(chǔ)且核心的技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于生理、病理、藥理及生物技術(shù)等多個(gè)領(lǐng)域的研究。其目的是在體外模擬或研究特定細(xì)胞的行為、反應(yīng)及其與外界環(huán)境的相互作用。為了確保細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性、可靠性、可重復(fù)性，并最大限度地減少實(shí)驗(yàn)誤差和污染風(fēng)險(xiǎn)，保障實(shí)驗(yàn)人員的安全，特制定本操作規(guī)定。本規(guī)定涵蓋了從實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求、設(shè)備使用、細(xì)胞準(zhǔn)備、接種傳代、日常維護(hù)、質(zhì)量控制、安全防護(hù)到記錄保存等細(xì)胞培養(yǎng)全流程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，所有參與細(xì)胞培養(yǎng)工作的相關(guān)人員均需嚴(yán)格遵守。

本規(guī)定的制定基于公認(rèn)的細(xì)胞培養(yǎng)原理和技術(shù)規(guī)范，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況，旨在建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化的操作體系。通過(guò)嚴(yán)格執(zhí)行本規(guī)定，可以優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件，提高細(xì)胞生長(zhǎng)質(zhì)量，確保研究數(shù)據(jù)的真實(shí)有效，并為不同實(shí)驗(yàn)間的結(jié)果比較奠定基礎(chǔ)。

**二、實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備與設(shè)備要求**

（一）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境

1.**物理布局與潔凈度：**

*細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)與潛在的污染源（如動(dòng)物房、病理室）物理隔離，減少交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。

*實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)設(shè)計(jì)為單向流潔凈工作區(qū)，即氣流從清潔區(qū)流向污染區(qū)，避免污濁空氣回流。

*實(shí)驗(yàn)室空氣潔凈度應(yīng)達(dá)到或優(yōu)于ISO5級(jí)（百級(jí)）標(biāo)準(zhǔn)，空氣換氣次數(shù)應(yīng)≥15次/小時(shí)，工作區(qū)域的空氣流速維持在30-50L/min，以有效控制懸浮顆粒物濃度。

*實(shí)驗(yàn)室溫濕度應(yīng)嚴(yán)格控制，溫度維持在22±2℃，相對(duì)濕度控制在50±10%，以維持細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定性。

*實(shí)驗(yàn)臺(tái)面應(yīng)使用無(wú)縫隙、易清潔、耐腐蝕的材料（如環(huán)氧樹脂板），便于徹底消毒。

2.**環(huán)境監(jiān)測(cè)與維護(hù)：**

*定期（建議每月）對(duì)實(shí)驗(yàn)室空氣潔凈度進(jìn)行粒子計(jì)數(shù)檢測(cè)，確保懸浮顆粒物（≥0.5μm）濃度低于ISO5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)限值（通?！?5,000個(gè)/m3）。

*定期（建議每半年）檢測(cè)并記錄超凈工作臺(tái)、CO?培養(yǎng)箱等關(guān)鍵設(shè)備的運(yùn)行參數(shù)，如風(fēng)速、溫度、CO?濃度、濕度等。

*紫外燈應(yīng)定期（建議每周）開啟30分鐘進(jìn)行空氣消毒，使用前需檢查其輸出強(qiáng)度是否符合要求（≥30μW/cm2）。

*保持實(shí)驗(yàn)室整潔有序，物品擺放整齊，地面、墻角無(wú)積塵。

（二）設(shè)備要求與操作

1.**超凈工作臺(tái)：**

***類型選擇：**根據(jù)操作需求選擇層流超凈工作臺(tái)（垂直流或水平流）。主要用于無(wú)菌操作，如細(xì)胞接種、分板、凍存管處理等。

***使用前準(zhǔn)備：**

*開啟紫外燈照射30分鐘進(jìn)行空間消毒，操作前關(guān)閉紫外燈。

*開啟工作臺(tái)，等待指示燈顯示正常，讓內(nèi)循環(huán)風(fēng)穩(wěn)定（通常需要15-30分鐘）。

*用70%乙醇徹底擦拭工作臺(tái)面、前窗、后窗及兩側(cè)門，特別是操作區(qū)域。

***操作規(guī)范：**

*操作人員需洗手消毒，穿戴潔凈工作服、口罩和手套。

*身體避免正對(duì)工作臺(tái)面呼吸或說(shuō)話，減少氣流擾動(dòng)。

*保持操作臺(tái)面整潔，物品輕拿輕放。

*非必要不開啟工作臺(tái)頂蓋，以維持潔凈環(huán)境。

***使用后處理：**

*操作完成后，用70%乙醇再次擦拭工作臺(tái)面。

*關(guān)閉紫外燈（如需）。

*根據(jù)設(shè)備說(shuō)明關(guān)閉工作臺(tái)電源和風(fēng)機(jī)。

2.**CO?培養(yǎng)箱：**

***功能要求：**用于為貼壁細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，包括恒溫、恒濕和精確的CO?濃度控制。

***使用前準(zhǔn)備與校準(zhǔn)：**

*檢查培養(yǎng)箱內(nèi)部是否清潔干燥，放置濕盤以維持內(nèi)部濕度。

*設(shè)定培養(yǎng)溫度為37±0.5℃，CO?濃度為5±0.5%。

*使用校準(zhǔn)合格的pH計(jì)（使用pH7.0緩沖液）和CO?傳感器校準(zhǔn)儀，定期（建議每月）校準(zhǔn)CO?濃度，確保讀數(shù)準(zhǔn)確。

***操作規(guī)范：**

*將細(xì)胞培養(yǎng)瓶/皿平穩(wěn)放入培養(yǎng)箱內(nèi)，避免劇烈晃動(dòng)。

*定期檢查培養(yǎng)箱溫度和CO?濃度是否穩(wěn)定在設(shè)定范圍內(nèi)。

*避免在培養(yǎng)箱內(nèi)放置過(guò)多物品，確?？諝饬魍?。

*定期清潔培養(yǎng)箱內(nèi)壁和冷凝水收集盤，防止霉菌滋生。

***使用后處理：**關(guān)閉培養(yǎng)箱電源。

3.**生物安全柜：**

***類型選擇：**主要用于處理具有潛在生物危害的細(xì)胞或操作，提供更高的安全防護(hù)級(jí)別。根據(jù)需要選擇I級(jí)或II級(jí)生物安全柜。

***泄漏測(cè)試：**每次使用前必須進(jìn)行泄漏測(cè)試（如使用發(fā)泡劑測(cè)試），確保柜內(nèi)密封良好。

***操作前準(zhǔn)備：**

*開啟紫外燈照射30分鐘消毒，操作前關(guān)閉紫外燈。

*檢查前窗玻璃密封條是否完好。

*用70%乙醇擦拭工作臺(tái)面和操作區(qū)域。

***操作規(guī)范：**

*佩戴手套，穿實(shí)驗(yàn)服。

*所有物品需放置在操作臺(tái)面上。

*避免在柜內(nèi)進(jìn)行加樣等可能產(chǎn)生氣溶膠的操作。

*保持柜內(nèi)相對(duì)整潔，物品擺放有序。

***使用后處理：**

*操作完成后，用70%乙醇噴灑表面消毒。

*關(guān)閉紫外燈。

*按照設(shè)備說(shuō)明關(guān)閉生物安全柜。

4.**其他輔助設(shè)備：**

***細(xì)胞計(jì)數(shù)板/儀：**用于計(jì)數(shù)細(xì)胞密度和評(píng)估細(xì)胞活力。需定期用蒸餾水或酒精清潔，并校準(zhǔn)計(jì)數(shù)誤差。

***移液器：**確保移液器功能正常，吸頭選擇與操作體積匹配。使用后立即更換新吸頭，并按照要求清洗或消毒。

***離心機(jī)：**用于細(xì)胞收集、培養(yǎng)基澄清等。使用前檢查轉(zhuǎn)子是否平衡，運(yùn)行參數(shù)是否正確。

***冰箱/超低溫冰箱：**用于儲(chǔ)存細(xì)胞、試劑和培養(yǎng)基。定期檢查溫度記錄，確保穩(wěn)定在-20℃或-80℃。-80℃冰箱應(yīng)定期除霜維護(hù)。

**三、細(xì)胞培養(yǎng)基本操作流程**

（一）細(xì)胞準(zhǔn)備

1.**培養(yǎng)基配制：**

***基礎(chǔ)培養(yǎng)基選擇：**根據(jù)細(xì)胞類型選擇合適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，如DMEM、MEM、RPMI1640、F12等。

***添加必需成分：**

***血清（FBS）：**添加10%體積分?jǐn)?shù)的胎牛血清（FBS），作為細(xì)胞生長(zhǎng)因子和附著促進(jìn)劑。建議使用高質(zhì)量、經(jīng)過(guò)除熱原處理的FBS，并不同批次測(cè)試細(xì)胞生長(zhǎng)情況以選擇最合適的批次。

***雙抗（抗生素）：**添加1%體積分?jǐn)?shù)的青霉素（100U/mL）和鏈霉素（100μg/mL），用于抑制細(xì)菌污染。對(duì)于長(zhǎng)期培養(yǎng)或特定細(xì)胞類型，可考慮使用雙抗-free培養(yǎng)基。

***L-谷氨酰胺：**添加1%體積分?jǐn)?shù)（100mM）L-谷氨酰胺，它是細(xì)胞生長(zhǎng)必需的氨基酸。

***其他添加劑：**根據(jù)需要添加非必需氨基酸（如MEMα）、pH緩沖劑（如HEPES，用于維持pH穩(wěn)定）、基礎(chǔ)鹽溶液等。

***無(wú)菌過(guò)濾：**將配好的培養(yǎng)基使用0.22μm或0.3μm濾膜進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾除菌。

***分裝與儲(chǔ)存：**將過(guò)濾后的培養(yǎng)基分裝于無(wú)菌培養(yǎng)瓶或凍存管中，封口后置于4℃冰箱保存，一般可保存1-2周。凍存培養(yǎng)基應(yīng)保存在-20℃或-80℃。

2.**細(xì)胞復(fù)蘇：**

***解凍：**將凍存的細(xì)胞懸液（通常含10%DMSO和基礎(chǔ)培養(yǎng)基）置于37℃水浴箱中快速解凍（通常1-2分鐘），避免冰晶損傷細(xì)胞。解凍過(guò)程中需輕輕搖晃凍存管。

***終止DMSO：**解凍后立即加入預(yù)溫的含血清的培養(yǎng)基（約5-10mL），混勻，終止DMSO對(duì)細(xì)胞的毒性影響。DMSO濃度過(guò)高或存在時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)抑制細(xì)胞活力。

***細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力檢測(cè)：**

*將細(xì)胞懸液滴加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板（如hemocytometer）上，使用顯微鏡在顯微鏡計(jì)數(shù)器（Neubauerchamber）上計(jì)數(shù)。通常使用TrypanBlue染色法進(jìn)行細(xì)胞活力（死細(xì)胞）檢測(cè)，活細(xì)胞（藍(lán)色背景下的不著色細(xì)胞）與死細(xì)胞（全藍(lán)色）分開計(jì)數(shù)，計(jì)算活力百分比（通常要求>90%）。

*根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果和預(yù)期接種密度，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度。例如，若計(jì)數(shù)結(jié)果顯示細(xì)胞密度為1×10?/mL，需要接種1×10?/mL，則需將細(xì)胞懸液稀釋10倍。

***接種：**將調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液接種到預(yù)先準(zhǔn)備好的培養(yǎng)瓶/皿中，確保接種密度適宜（通常初代培養(yǎng)或低密度傳代時(shí)為1×103-1×10?cells/cm2，具體依細(xì)胞類型而定），并加入適量培養(yǎng)基。

（二）細(xì)胞接種與傳代

1.**接種步驟（直接接種或傳代后接種）：**

***培養(yǎng)瓶/皿準(zhǔn)備：**選擇合適的培養(yǎng)容器（如T25培養(yǎng)瓶、6孔板、24孔板等），用75%乙醇徹底擦拭表面，然后在超凈工作臺(tái)內(nèi)或生物安全柜中打開，準(zhǔn)備進(jìn)行無(wú)菌操作。

***培養(yǎng)基準(zhǔn)備：**確保接種時(shí)培養(yǎng)瓶/皿中已加入適量預(yù)溫（37℃）的含血清培養(yǎng)基，液面高度適中，避免氣泡。

***細(xì)胞稀釋與計(jì)數(shù)：**若細(xì)胞密度過(guò)高，需用含血清的培養(yǎng)基進(jìn)行適當(dāng)稀釋至適宜接種濃度。

***無(wú)菌接種操作（在超凈工作臺(tái)或生物安全柜內(nèi)）：**

*用酒精燈火焰或紫外燈消毒操作者的雙手（若有必要）。

*戴無(wú)菌手套，輕柔吸棄舊培養(yǎng)基（注意避免產(chǎn)生氣泡和細(xì)胞流失）。

*加入新鮮培養(yǎng)基（約1-2mL，輕輕沖洗去除殘留舊培養(yǎng)基）后棄去。

*加入含細(xì)胞懸液（或稀釋后的細(xì)胞懸液）的培養(yǎng)基，輕柔晃動(dòng)培養(yǎng)瓶/皿使細(xì)胞均勻分布。

*蓋上蓋子，將培養(yǎng)瓶/皿移出潔凈區(qū)域。

***放置培養(yǎng)箱：**將接種好的細(xì)胞置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.**傳代操作（Passaging）：**

***判斷傳代時(shí)機(jī)：**細(xì)胞生長(zhǎng)至接近匯合度（通常80%-90%，即接近鋪滿培養(yǎng)皿表面）時(shí)，應(yīng)進(jìn)行傳代，以避免細(xì)胞過(guò)度擁擠影響生長(zhǎng)和接觸抑制。也可根據(jù)細(xì)胞形態(tài)變化（如變圓、聚集）判斷。

***消化細(xì)胞：**

*用移液器吸棄舊培養(yǎng)基。

*加入適量的胰蛋白酶-EDTA溶液（如0.25%胰蛋白酶，0.1%EDTA，pH7.4）或僅含EDTA的溶液，通常3-5mL/瓶（T25）。滴加時(shí)避免沖擊細(xì)胞團(tuán)。

*將培養(yǎng)瓶/皿置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中，輕柔晃動(dòng)或用吸管輕輕吹打幫助細(xì)胞detachment，消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞類型和密度調(diào)整（通常5-15分鐘，期間可在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，避免過(guò)度消化）。

***監(jiān)測(cè)消化程度：**細(xì)胞變圓、彼此分離是理想狀態(tài)。可用培養(yǎng)基終止消化（加入1-2mL含血清的培養(yǎng)基）。

***收集細(xì)胞：**

*吸棄消化液，加入適量含血清的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

*使用細(xì)胞刮刀（細(xì)胞刮）或移液器輕輕吹打，將細(xì)胞從瓶壁上刮下，制成單細(xì)胞懸液。

***細(xì)胞計(jì)數(shù)與調(diào)整：**使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板或細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞密度，并根據(jù)需要調(diào)整細(xì)胞濃度進(jìn)行下一次接種（如按1:3或1:4的比例稀釋）。

***記錄：**記錄傳代日期、細(xì)胞類型、原始細(xì)胞數(shù)、傳代后接種數(shù)、培養(yǎng)基批號(hào)等信息。

（三）日常維護(hù)

1.**每日觀察：**

*每天固定時(shí)間（如上午）檢查培養(yǎng)箱內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

***觀察內(nèi)容：**

*細(xì)胞貼壁情況：是否大部分細(xì)胞已貼壁？有無(wú)漂浮細(xì)胞？

*細(xì)胞形態(tài)：與該細(xì)胞類型典型的形態(tài)是否一致？有無(wú)異常變化（如變圓、拉長(zhǎng)、聚集、出現(xiàn)空泡、出血點(diǎn)等）？

*培養(yǎng)基顏色：有無(wú)變黃（酸性）、變紅（堿性）或渾濁？

*污染跡象：有無(wú)霉菌、細(xì)菌菌落、藻類等可見(jiàn)污染？

*培養(yǎng)瓶狀態(tài)：有無(wú)裂痕、漏液？

***記錄：**詳細(xì)記錄觀察結(jié)果，包括匯合度、形態(tài)描述、培養(yǎng)基狀態(tài)等。發(fā)現(xiàn)異常及時(shí)處理。

2.**培養(yǎng)基更換：**

***更換頻率：**一般每2-3天更換一次培養(yǎng)基，以保證培養(yǎng)基成分的穩(wěn)定和細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。對(duì)于某些快速生長(zhǎng)的細(xì)胞或特定實(shí)驗(yàn)需求，可能需要更頻繁更換。

***更換量：**通常更換培養(yǎng)基的1/2或2/3，對(duì)于高密度培養(yǎng)或貼壁細(xì)胞，可更換1/10-1/4。確保更換后培養(yǎng)基液面高度適宜。

***操作步驟（無(wú)菌操作）：**

*在超凈工作臺(tái)或生物安全柜內(nèi)操作。

*戴無(wú)菌手套。

*小心吸棄舊培養(yǎng)基，注意避免吸走貼壁細(xì)胞。

*加入等量或按比例計(jì)算的新鮮、預(yù)溫培養(yǎng)基。

*輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶/皿，使培養(yǎng)基均勻分布。

*蓋上蓋子。

3.**CO?濃度與pH監(jiān)測(cè)：**

*雖然CO?培養(yǎng)箱可維持設(shè)定濃度，但建議定期（如每周）使用pH試紙或pH計(jì)測(cè)量培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)少量培養(yǎng)基的pH值，確保在6.5-7.5的適宜范圍內(nèi)。pH偏離會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)。

*若pH持續(xù)偏離，需檢查培養(yǎng)箱CO?傳感器是否需要校準(zhǔn)，或檢查培養(yǎng)基配制是否正確。

**四、質(zhì)量控制與安全防護(hù)**

（一）質(zhì)量控制

1.**細(xì)胞污染檢測(cè)：**

***細(xì)菌污染：**

***肉眼觀察：**每日觀察培養(yǎng)基顏色變化（渾濁、沉淀、氣泡）、有無(wú)顆粒物或云霧狀物。

***顯微鏡檢查：**在相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)基中的微生物形態(tài)（細(xì)菌通常為快速移動(dòng)的個(gè)體，酵母菌為圓形或卵圓形，霉菌為絲狀）。

***培養(yǎng)法：**取少量可疑培養(yǎng)基或細(xì)胞上清，接種于合適的固體培養(yǎng)基（如TSA、MAC）上，37℃培養(yǎng)24-48小時(shí)，觀察是否有菌落生長(zhǎng)。

***支原體污染：**

***形態(tài)學(xué)觀察：**在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞是否呈現(xiàn)多核、細(xì)胞融合、拉長(zhǎng)絲狀等特征。

***PCR檢測(cè)：**使用支原體特異性PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，這是最靈敏和準(zhǔn)確的方法。

***動(dòng)物接種：**將細(xì)胞上清注入易感動(dòng)物（如地鼠、倉(cāng)鼠）腹腔或皮下，觀察是否感染。

***染色法：**如H&E染色、DAPI染色等，但靈敏度較低。

***酵母菌/霉菌污染：**通常通過(guò)顯微鏡觀察和培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)。注意與細(xì)胞自發(fā)死亡或凋亡區(qū)分。

***處理措施：**一旦發(fā)現(xiàn)污染，應(yīng)立即隔離污染細(xì)胞，嘗試使用有效消毒劑（如0.1%次氯酸鈉、70%乙醇）處理（需驗(yàn)證對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性），若無(wú)效則廢棄該細(xì)胞系。污染源（如培養(yǎng)基、試劑、設(shè)備）也需徹底檢查和消毒。

2.**培養(yǎng)基檢測(cè)：**

***無(wú)菌測(cè)試：**每批培養(yǎng)基配制后，取少量進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)（固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)48-72小時(shí)，液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)7天），確認(rèn)無(wú)微生物生長(zhǎng)。

***pH檢測(cè)：**使用校準(zhǔn)合格的pH計(jì)，在配制完成后和加入細(xì)胞前檢測(cè)培養(yǎng)基的pH值，確保在適宜范圍（通常7.2-7.4）。

***內(nèi)毒素檢測(cè)：**對(duì)于注射用或長(zhǎng)期培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基，建議進(jìn)行內(nèi)毒素（LAL）測(cè)試，確保其含量低于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)，避免引起細(xì)胞毒性或免疫反應(yīng)。

***無(wú)菌過(guò)濾驗(yàn)證：**定期對(duì)使用的0.22μm濾膜進(jìn)行無(wú)菌挑戰(zhàn)測(cè)試，確保其過(guò)濾性能穩(wěn)定。

3.**細(xì)胞活力與計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性：**

*定期使用臺(tái)盼藍(lán)染色法或其他活死細(xì)胞染料（如MTT、CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞活力，確保細(xì)胞在操作過(guò)程中及培養(yǎng)過(guò)程中保持較高活力（通常>90%）。

*使用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞計(jì)數(shù)板和顯微鏡進(jìn)行手動(dòng)計(jì)數(shù)，或使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，并定期進(jìn)行校準(zhǔn)，確保計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

（二）安全防護(hù)

1.**個(gè)人防護(hù)裝備（PPE）：**

***基本要求：**所有進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的人員必須穿戴潔凈工作服、佩戴口罩（能阻擋飛沫和氣溶膠）、佩戴無(wú)菌手套。

***特殊操作：**進(jìn)行高風(fēng)險(xiǎn)操作（如處理潛在污染細(xì)胞、使用生物安全柜進(jìn)行氣溶膠產(chǎn)生操作）時(shí)，應(yīng)考慮佩戴護(hù)目鏡或面屏，必要時(shí)穿戴防護(hù)面罩和防護(hù)服。

***手套更換：**操作前后、手套破損或污染時(shí)必須立即更換無(wú)菌手套。手套脫下后應(yīng)按規(guī)定進(jìn)行處置，不得帶出實(shí)驗(yàn)室。

2.**無(wú)菌操作規(guī)范：**

***工作臺(tái)面：**保持工作臺(tái)面清潔干燥，操作前用70%乙醇擦拭。

***避免污染源：**操作時(shí)避免觸摸工作臺(tái)面、培養(yǎng)瓶非無(wú)菌區(qū)域、門把手、燈開關(guān)等。避免在非無(wú)菌區(qū)域（如地面、外面）放置無(wú)菌物品。

***容器處理：**打開培養(yǎng)瓶/皿蓋時(shí)，蓋子內(nèi)側(cè)朝上或朝向自身，避免接觸外部環(huán)境。移液管吸頭不得接觸任何非無(wú)菌表面。

***氣流方向：**在超凈工作臺(tái)或生物安全柜內(nèi)操作時(shí)，盡量靠近入口端，避免在中間或出口端操作，以維持正面氣流保護(hù)。

***移液器使用：**吸液和排液時(shí)避免產(chǎn)生氣泡，吸頭輕柔插入液面以下，排液時(shí)速度適中，避免液體飛濺。使用一次性吸頭，杜絕共用。

3.**廢棄物處理：**

***分類收集：**將實(shí)驗(yàn)廢棄物分為無(wú)害類（如廢棄培養(yǎng)基、吸頭）、潛在污染類（如細(xì)胞培養(yǎng)殘?jiān)㈦x心管）、銳器類（如細(xì)胞刮刀、針頭，需放入銳器盒）。

***培養(yǎng)基與細(xì)胞殘?jiān)?*必須經(jīng)高壓滅菌（121℃、15分鐘）后，方可按實(shí)驗(yàn)室規(guī)定進(jìn)行廢棄處理（如倒入專用垃圾桶）。

***污染廢棄物：**如確認(rèn)存在生物污染，需使用有效消毒劑（如10%甲醛、70%乙醇）浸泡過(guò)夜或根據(jù)消毒劑說(shuō)明處理，然后滅菌，再進(jìn)行廢棄處理。

***銳器：**立即放入符合標(biāo)準(zhǔn)的銳器盒中，待滿后交由專業(yè)機(jī)構(gòu)處理。

***化學(xué)廢棄物：**按照實(shí)驗(yàn)室化學(xué)品安全規(guī)定進(jìn)行處理。

***手套與PPE：**脫下后直接放入指定的醫(yī)療廢物袋中，定期收集處理。

**五、記錄與保存**

（一）實(shí)驗(yàn)記錄

1.**詳細(xì)記錄：**每次細(xì)胞培養(yǎng)操作均需在實(shí)驗(yàn)記錄本或電子實(shí)驗(yàn)記錄系統(tǒng)（ELN）中詳細(xì)記錄，包括：

*日期與時(shí)間。

*操作者姓名與ID。

*細(xì)胞類型、來(lái)源、passages（傳代次數(shù)）。

*培養(yǎng)基名稱、批號(hào)、配制日期、添加成分及終濃度。

*所用設(shè)備（超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱等）編號(hào)及狀態(tài)。

*操作步驟（如消化時(shí)間、接種密度）。

*觀察結(jié)果（細(xì)胞形態(tài)、匯合度、培養(yǎng)基狀態(tài)、污染跡象等）。

*處理措施（如更換培養(yǎng)基頻率、污染處理）。

*細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力數(shù)據(jù)。

*異常情況及備注。

2.**規(guī)范書寫：**記錄應(yīng)清晰、準(zhǔn)確、及時(shí)、不可涂改（如需修改，應(yīng)劃線簽名注明）。關(guān)鍵數(shù)據(jù)（如培養(yǎng)基批號(hào)、細(xì)胞passages）應(yīng)醒目標(biāo)注。

（二）細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

1.**細(xì)胞凍存：**

***凍存液配制：**按標(biāo)準(zhǔn)方法配制含10%DMSO和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的凍存液?？商砑悠渌Ｗo(hù)劑（如蔗糖），但需驗(yàn)證其對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性。

***細(xì)胞濃度：**凍存時(shí)細(xì)胞濃度通常較高（如1×10?-1×10?cells/mL）。

***凍存管準(zhǔn)備：**使用無(wú)菌凍存管，標(biāo)簽清晰注明細(xì)胞類型、凍存日期、passages、凍存者姓名。

***分裝與標(biāo)記：**將細(xì)胞懸液加入凍存管，輕輕混勻，確保DMSO分布均勻。用封口膜或管蓋密封。

***凍存過(guò)程（推薦分步冷凍法）：**

*將標(biāo)記好的凍存管放入4℃冰箱放置30-60分鐘。

*然后轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱過(guò)夜。