JJF(吉)118—2023吉林省市場監(jiān)督管理廳發(fā)布熒光定量PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范I （II） （1） （1） （1） （3） （4） （5） （5） （12） （12） （13） （16） （17） （20）和JJF1059.1-2012《測量不確定度評定與表示》共同構(gòu)成支撐本校準(zhǔn)規(guī)范制定工作的基礎(chǔ)1173-2010《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀》、GB/T42753-1熒光定量PCR儀校準(zhǔn)規(guī)范于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理定量或定性分析靶核GB/T42753-2022實時熒光定量PCR儀性能評凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本規(guī)范；凡是不注日期的引用文件，其3.1聚合酶鏈反應(yīng)polymerasec基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)原理，通過溫度變化循環(huán)程序進(jìn)行靶核酸儀器孔位平均溫度達(dá)到設(shè)定值(偏差±0.5℃以內(nèi)）且保持該溫度的一段時間。[GB/T3.5溫度示值誤差temperatureindic23.6溫度均勻度temperatur儀器恒溫階段屮，各孔位之間的溫度一致性。[GB/3.7溫度波動度temperatu儀器恒溫階段屮，孔位的溫度變化幅度。[GB/3.8溫度最大過沖量temperaturemaxim均熱塊溫度升高或降低至設(shè)定值過程中，所有采樣測量孔溫度超出（高于或低于）設(shè)定3.9平均升溫速率mean3.10平均降溫速率meanc3.12熒光強度精密度precisionoffluorescenceintensity對多個檢測孔在同一熒光條件下重復(fù)熒光強度檢測每個PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值吋所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)。[GB/T42753-20均熱塊不同測量孔在同一熒光條件下，閾值3.15熔解溫度melttemperatu3.19通道峰值強度一致性channelpeakheightconsistenc33.20線性靈敏系數(shù)linearsensitivityfactor,LSF3.21熔解溫度比ratioofmelttemperature,RTm度不均勻直接相關(guān)；RTm>1.20：相同產(chǎn)品熔共同導(dǎo)致的；RTm<0.80：相同產(chǎn)品熔解溫度不同，差異是與光學(xué)、光學(xué)檢測系統(tǒng)及分析軟件直接相關(guān)。3.22樣本示值誤差errorofsample’sindication測得的DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度對數(shù)值與標(biāo)稱濃度的對數(shù)值的誤差。針與模板基因混合后，完成高溫變性、低溫復(fù)性和適溫延伸的熱循環(huán)對的探針被切斷，熒光染料游離于反應(yīng)體系中，在特定光激發(fā)下熒光染環(huán)次數(shù)的增加，被擴(kuò)增的目的基因片段呈指數(shù)規(guī)律增長，通過實時檢品載臺、軟件控制系統(tǒng)、溫度控制模塊、熒光檢測模塊、均熱塊檢測孔組成，詳細(xì)結(jié)構(gòu)如圖477F8432F個6293651一光源2——濾光片3—準(zhǔn)直器4—光導(dǎo)束5—樣品6—均熱塊檢測孔7一溫度傳感器8—加熱制冷供電9—光開關(guān)陣列10—光敏器11—電控裝置12—通訊接口13—計算機(jī)5計量特性5.1實時熒光定量PCR儀計量性能指標(biāo)如表1所示。序號備注1溫度示值誤差溫度項目2溫度均勻度3溫度波動度4567閾值循環(huán)數(shù)示值誤差物理項目8閾值循環(huán)數(shù)均勻度9閾值循環(huán)數(shù)精密度熔解溫度飄移熔解溫度比化學(xué)項目注：1、以上所有指標(biāo)不適用于合格性判別，僅供參考。JJF1527-2015附錄A、B中的要求。56.1.1溫度15～30）℃;相對濕度：不大于80%；6.1.2其它：符合儀器額定供電電壓和頻率；電源電壓波動不超出±22V，交流頻率的變化溫度與光學(xué)校準(zhǔn)裝置集成了溫度傳感器和發(fā)射光發(fā)生器兩部分。其溫度測量范圍為（0~120）℃,最大允許誤差為±0.1℃,采樣時間間隔不超過0.5s；發(fā)射光發(fā)生器的波長范圍為校準(zhǔn)光學(xué)系統(tǒng)項目時，可根據(jù)客戶要求與實際情況選擇光學(xué)系統(tǒng)物理校準(zhǔn)方法或光學(xué)系如圖2所示，均熱塊孔數(shù)為其他數(shù)量時，可參照圖2布點。實時熒等于或大于96孔時，測量點為15個，布點圖如圖3所示，均將儀器及光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器各部件連接完好，在光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器下部的溫度傳6導(dǎo)熱油，以確保其與均熱塊測量孔接觸良好。將光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器分布于均熱塊測量孔中。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的準(zhǔn)備與配置參照J(rèn)JF1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》附錄A執(zhí)行。PCR反應(yīng)體系的配置參照J(rèn)JF1527-2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析儀校準(zhǔn)規(guī)范》附錄B執(zhí)行。圖212個光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器位置分布示意圖圖315個光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器位置分布示意圖7.2.2校準(zhǔn)過程溫度項目校準(zhǔn)時，典型的校準(zhǔn)設(shè)置程序如表2步驟4～11所示(其中平均升、降溫速率的測量數(shù)據(jù)分別來源于步驟4～5和步驟5～6;溫度示值誤差的測量數(shù)據(jù)來源于步驟5～11;溫度均勻度、溫度波動度、溫度最大過沖量的測量數(shù)據(jù)來源于步驟5～10)。光學(xué)系統(tǒng)采用物理校準(zhǔn)方法時，典型的校準(zhǔn)設(shè)置程序如表2步驟12～16所示(步驟12和步驟13之間設(shè)定程序循環(huán)32次)。光學(xué)系統(tǒng)采用生物化學(xué)校準(zhǔn)方法時，典型的校準(zhǔn)設(shè)置程序如表3所示。也可以根據(jù)被測實時熒光定量PCR儀說明書或客戶要求，參照表2或表3進(jìn)行設(shè)定，并說明具體參數(shù)校準(zhǔn)時所選取的溫度值。步驟設(shè)定溫度點持續(xù)時間(s)備注1預(yù)熱程序234準(zhǔn)程序56789序：在85℃/60℃之間循環(huán)32次，擴(kuò)增變性程序程7112134溫度達(dá)到設(shè)定溫度30s后開始記錄測量值，記錄5s，最少均勻記錄5組數(shù)據(jù)。 n nT——溫度示值誤差，℃; T Tn——溫度傳感器數(shù)量。溫度達(dá)到設(shè)定溫度30s后開始記錄測量值，記錄5s，最少均勻記錄5組數(shù)據(jù)。=Tmax?Tmin（2） 溫度達(dá)到設(shè)定溫度30s后開始記錄各點量值，記錄60s，最少均勻記錄10組Tf=max[(Tjmax?Tjmin)/2]（3）8Tjmax——測量點j溫度傳感器在m次測量中的最高溫度，℃;Tjmin——測量點j溫度傳感器在m次測量中的最低溫度，℃。=TTTTnT?TTah/n（5）ai——50℃溫度點第i個采樣測量孔的測量值，℃;bi——90℃溫度點第i個采樣測量儀器從90℃降溫至50℃時，平均降溫速率的計算按照公式（6）計算：nTT/n（6）9Cti=Ctqi?CtsCtu=Ctqmax?Ctqminnm2m100%100%m?1當(dāng)DNA循環(huán)擴(kuò)增從最大熒光強度100%減弱到20%時度一致性（CPHC）和線性靈敏系數(shù)(LSF)，分別由公式（10）、公式（11）計算：iB?CiiB ALSFi——線性靈敏系數(shù)。c)熔解溫度漂移和熔解溫度比TmiminmaxminTmi——第i個采樣測量孔熔解溫度漂移，TTRTm——熔解溫度比；TTTT cs（14）c——樣本示值誤差，copies/μL cc——儀器測量平均值，copies/μLs——標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)稱值，copies/μLn nnCti——系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的第i個擴(kuò)增Ct值； lnc——系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度對數(shù)a)標(biāo)題：如“校準(zhǔn)證書”；），設(shè)定溫度點(℃)平均值(℃)實測最高溫度(℃)實測最低溫度(℃)溫度示值誤差(℃)不確定度(℃)溫度均勻度(℃)Tmax-Tmin溫度波動度(℃)三、溫度最大過沖量、平均升溫速率和平均設(shè)定溫度點(℃)最低或最高測量值(℃)溫度最大過沖量(℃)平均升溫速率(℃/s）平均降溫速率(℃/s）四、閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）示值誤差、均勻度、精密度（光學(xué)系統(tǒng)物理項目）TTmiAiiAi-Bii-CiCPHCLSFRTm光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器分布位置1U2設(shè)定溫度點(℃)溫度示值誤差(℃)溫度均勻度(℃)溫度波動度(℃)溫度最大過沖量(℃)平均升溫速率(℃/s）平均降溫速率(℃/s）熔解溫度漂移(℃)與溫度控制模塊接觸良好。按照儀器說明書或用戶要求或推薦使用的溫度TiTTa)測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u1；b)溫度傳感器分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u1；c)溫度傳感器準(zhǔn)確度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u2。C.4.1重復(fù)性測量引入的不確定度分量u1mn(ykj?yj)2spspm(n?1)ykj——第j個測量點第k次的測量值，℃; yj——第j個測量點測量值的平均值，℃;不同測量點溫度傳感器測量結(jié)果(℃)123456789sp=0.0313℃C.4.2溫度傳感器分辨力引入的不確定度u1'溫度傳感器的分辨力為0.01℃,分散區(qū)間半寬為0.005℃,按均勻分布計算，由于重復(fù)測量引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u1大于分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度C.4.3溫度傳感器準(zhǔn)確度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u2；溫度傳感器的最大允許誤差±0.1℃,按均勻分布計算，則：C.5合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度ucuc 模塊中，并確保與溫度控制模塊接觸良好。按照儀器說明書或用戶要Cti=Ctqi?Ctsa)測量重復(fù)性引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u1；b)光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器分辨力引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u1'；c)光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器準(zhǔn)確度引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u2；D.4.1重復(fù)性測量引入的不確定度分量u1對同一臺設(shè)備，在相同的測量條件下，使用光學(xué)標(biāo)準(zhǔn)器按照推薦123456789儀mn(ykj?yj)2pm(n?1)pm(n?1)ykj——第j個測