代表；以抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)檢測(cè)方法，酶聯(lián)免疫吸附法(Enzymelinked1.1傳統(tǒng)培養(yǎng)法目前在我國檢測(cè)食品中金黃色葡萄球菌采用的是傳統(tǒng)檢測(cè)方法，主要是根據(jù)驟，所需時(shí)長為78h。如圖1-1所示。檢樣檢樣25g(mL樣品+225mL7.5%氯化鈉肉湯或10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯，均質(zhì)Baird-Parker平板，血平板36℃血平板18h~24hBaird-Parker平板18h~24h或45~48h涂片染色觀察溶血BHI肉湯和營養(yǎng)瓊脂小斜面血漿凝固實(shí)驗(yàn)報(bào)告第一步，先后在75%的氯化鈉肉湯培養(yǎng)基、血瓊脂平板Baird-Parker平板上接種待測(cè)樣品。第二步，挑取疑似金黃色葡萄球菌的菌落進(jìn)行染色然后鏡檢。第三步，進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)以及其他生化試驗(yàn)。第四步，用標(biāo)準(zhǔn)陽性和菌株作對(duì)照組，全程大約需5-8d。定量檢測(cè)方法：在10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯上接種稀釋好的三個(gè)梯度的稀釋液，每個(gè)梯度平行做3管，培養(yǎng)一段時(shí)間后轉(zhuǎn)接到Baird-Parker平板上繼續(xù)培養(yǎng)，然后對(duì)典型菌落進(jìn)行確認(rèn)，通過查MPN表對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行定量檢測(cè)I23JI21-23]。以上傳統(tǒng)培養(yǎng)法雖然準(zhǔn)確度較高，最低檢出限可達(dá)到零，但是步驟繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長，隨著食品工業(yè)的發(fā)展，以及對(duì)食品安全的重視，傳統(tǒng)檢測(cè)方法已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足食品檢測(cè)的需要，迫切需要靈敏度更高、特異性更強(qiáng)簡便快捷的食品安全檢測(cè)技術(shù)和方法。1.2免疫學(xué)檢測(cè)方法免疫學(xué)方法是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)原理發(fā)展起來的檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。但是該類方法也有一定的局限性，比如免疫學(xué)方法檢測(cè)的靈敏度和特異性易受抗體特異性、抗體吸附能力以及基質(zhì)背景干擾等因素的影響，不能滿足種類繁多、組分復(fù)雜和目標(biāo)菌含量低的食品樣品的檢測(cè)要求。(1)酶聯(lián)免疫技術(shù)酶聯(lián)免疫技術(shù)(Enzyme-linkedImmunosorbentAssay,ELISA)是免疫分析技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的方法。其基本原理是保持抗原(或抗體)原有的免疫活性并將其吸附于固相載體上，再加入酶標(biāo)記進(jìn)行免疫酶染色，底物顯色后，分析有色產(chǎn)物的量即可確定樣品中待測(cè)物質(zhì)的含量，由于酶的催化效率很高，這就間接的放大了反應(yīng)結(jié)果從而提高反應(yīng)的敏感度[23I24-26]。ELISA技術(shù)在食品分析中的應(yīng)用有很多，比如檢測(cè)食品中的營養(yǎng)物質(zhì)、微生物、農(nóng)藥殘留以及重金屬污染等。目前，ELISA技術(shù)在金黃色葡萄球菌的檢測(cè)中主要是應(yīng)用于檢測(cè)其分泌的腸毒素。雖然ELISA技術(shù)以其靈敏度高、特異性強(qiáng)而著稱，但是也存在一些缺陷，由于在該技術(shù)中所用的抗原、抗體以及標(biāo)記物等生物制劑的穩(wěn)定性不夠強(qiáng)，容易在相同的檢樣中產(chǎn)生差別，同時(shí)，由于聯(lián)免疫試劑的儲(chǔ)存時(shí)間，存貯環(huán)境的條件不同也容易在檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)差異。同時(shí)，酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)由于試劑的特異性，可能對(duì)結(jié)構(gòu)相似的化合物產(chǎn)生交叉反應(yīng)，也不能同時(shí)應(yīng)用于多種組分的檢測(cè)。(2)免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)(Immunecolloidalgoldtechnique,GICT)是一種免疫標(biāo)記技術(shù)，以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體。膠體金可通過靜電作用與抗體非共價(jià)結(jié)合，形成膠體金示蹤標(biāo)志物，通過抗原-抗體反應(yīng)與目標(biāo)抗原相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)病原生物的檢測(cè)。杜玉萍127]等人利用膠體金免疫層析技術(shù)建立了膠體金免疫層析試紙法，利用該方法檢測(cè)金黃色葡萄球菌可在60min內(nèi)完成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示靈敏度為1×10?cfu/mL。劉晶1281等人利用膠體金免疫層析技術(shù)研發(fā)出方便攜帶的免疫層析測(cè)試卡檢測(cè)金黃色葡萄球菌的腸毒素α和β,檢測(cè)靈敏度分別為10ng/mL和1ng/mL,整個(gè)檢測(cè)過程在10min內(nèi)完成，可以滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。膠體金技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)時(shí)間短、成本低廉、無需復(fù)雜儀器。但利用該方法檢測(cè)食源性病原菌靈敏度較低，所制備的多克隆抗體特異性無法保證，容易發(fā)生交叉反應(yīng)。(3)免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)也叫做熒光抗體法(Immunofluorescencetechnique),已知抗原/抗體采用熒光標(biāo)記物標(biāo)記，然后通過標(biāo)記抗原/抗體與待檢樣品中的抗體/抗原發(fā)生特異性的結(jié)合，使得待檢樣品同時(shí)也被熒光物質(zhì)標(biāo)記，然后利用特殊的熒光儀器判定熒光位置及強(qiáng)度從而達(dá)到定位或者定量檢測(cè)的目的。免疫熒光技術(shù)主要包括兩種方法：直接法和間接法。直接法是將熒光物質(zhì)與已知抗原/抗體來結(jié)合測(cè)定未知樣品。間接法是通過已知抗原/抗體與待檢樣品發(fā)生特異性結(jié)合后，經(jīng)過洗滌，再向結(jié)合物中加入被熒光標(biāo)記的二抗，通過測(cè)定已知的一抗的含量間接測(cè)定未知樣品中待檢成分的含量。早在1981年，朱廣發(fā)29等人經(jīng)過三年的研究采用免疫熒光抗體技術(shù)實(shí)現(xiàn)了金黃色葡萄球菌的檢測(cè)性同位素等標(biāo)記抗原/抗體，然后將這些標(biāo)記了的抗原/抗體加入到抗原/抗體的特異性反應(yīng)體系中與相應(yīng)的抗體/抗原發(fā)生特異性結(jié)合，通過檢測(cè)這些標(biāo)記物的存在及含量來達(dá)到對(duì)檢測(cè)樣品中的微量被物質(zhì)進(jìn)行定性或定量檢測(cè)的目的。Khan30]等將免疫熒光技術(shù)與研人員將免疫熒光技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合發(fā)明了抗體-直接表面濾膜熒光技術(shù)、微菌落免疫(4)免疫磁性微球技術(shù) (ImmunomagneticBeads,IMB),是表面結(jié)合有單克隆抗體的磁性微球。免疫磁性微球技術(shù)者進(jìn)行PCR檢驗(yàn)。和酶聯(lián)免疫吸附相結(jié)合的方式，在3h以檢測(cè)最低限度為10?cfu/ml的牛奶樣品。劉細(xì)霞32]利用金黃色葡萄球菌所特有的SPA(金黃色葡萄球菌A蛋白)可與IgG(免疫球蛋白G)的Fc進(jìn)行免疫印記分析來檢測(cè)金黃色葡萄球菌，檢測(cè)限達(dá)到100cfu/ml。雖然免疫磁性微球技術(shù)1.3生物學(xué)檢測(cè)方法形成了以核酸分子雜交技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)等(1)核酸分子雜交技術(shù)技術(shù)。我國從1986年開始相繼展開了核酸探針技術(shù)的研究工作。目前已成功應(yīng)用該技術(shù)檢放射性同位素標(biāo)記，生物素標(biāo)記等),然后根據(jù)核苷酸分子間的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，通過原色葡萄球菌特異性的DNA探針與經(jīng)過增菌處理的待檢樣品中的金黃色葡萄球菌的rRNA序列進(jìn)行雜交，生成RNA:DNA雜交體，然后利用熒光發(fā)光儀在450mm處讀取其吸收峰，當(dāng)色葡萄球菌的檢出最低限為10cfu/mL,增菌以后食品中的金黃色葡萄球菌鑒定時(shí)間僅需半樣進(jìn)行金黃色葡萄球菌的檢測(cè)，與核酸斑點(diǎn)雜交檢測(cè)結(jié)果的符合率達(dá)到100%,檢測(cè)準(zhǔn)確性較(2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR),是上世紀(jì)80年代RaryB.Mullis135]等人發(fā)明的體外酶促基因擴(kuò)增技術(shù)，應(yīng)用常養(yǎng)法具有特異性強(qiáng)、簡單快速、靈敏度高的特點(diǎn)。PCR技術(shù)通過提取目的DNA,然后進(jìn)行低溫退火適溫延伸的反復(fù)循環(huán)，使目的DNA的數(shù)量呈現(xiàn)幾何級(jí)數(shù)的增長，達(dá)到迅速擴(kuò)增目的DNA的效果。然后再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、染色，擴(kuò)增的目的DN射下可見，根據(jù)不同的DNA帶可以鑒定不同的DNA用這種方法可以進(jìn)行DNA序列分析，色葡萄球菌，結(jié)果顯示了100%的特異性，隨著目標(biāo)DNA洗滌次數(shù)的增加，靈敏度也從53%增加到90%。但是常規(guī)PCR具有易受食品復(fù)雜基質(zhì)以及環(huán)境影響、靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)致多重PCR(multiplexPCR)技術(shù)是在常規(guī)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新技術(shù)，近年來越路和乳制甜品樣品中分離出金黃色葡萄球菌和腸毒素。但是多重PCR技術(shù)對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求非常高，在食品微生物的檢測(cè)中，多重PCR引物與非靶點(diǎn)序列結(jié)合容易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)物學(xué)檢測(cè)中，與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)極大地改善和簡化了核酸定量檢測(cè)，所花費(fèi)時(shí)間更短，檢測(cè)效率更高，交污染風(fēng)險(xiǎn)比如PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長、發(fā)射光譜重疊、假陰性結(jié)果增加等。本研究將使用普通PCR技然而，目前該技術(shù)多處于研究階段，且檢測(cè)費(fèi)用昂貴，不利于推廣。近幾年，基因芯片技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展，它是一項(xiàng)基于基因表達(dá)和基因功能研究的革命性技術(shù)，綜合了分子生物學(xué)、半導(dǎo)體微電子、激光、化學(xué)染料等領(lǐng)域的最新科學(xué)技術(shù)，把生命科學(xué)與信息科學(xué)聯(lián)系在了一起，是當(dāng)今前沿科學(xué)的研究熱點(diǎn)41-42]。該技術(shù)可以有效的鑒別微生物和轉(zhuǎn)基因成分，為現(xiàn)代社會(huì)檢測(cè)人們所關(guān)注的食品安全問題提供了一個(gè)新方向。目前基因芯片主要應(yīng)用在檢測(cè)食品原料和食品成分方面，對(duì)監(jiān)督食品的衛(wèi)生、安全和食品質(zhì)量有著深刻的作用[43-44]。但要想要更廣泛的應(yīng)用基因芯片技術(shù)，還需要解決如何建立標(biāo)準(zhǔn)化程序、降低檢測(cè)費(fèi)用、簡化樣品制作和標(biāo)記操作、進(jìn)一步提檢測(cè)特異性等問題。電阻抗法是近年發(fā)展起來的一項(xiàng)生物學(xué)技術(shù)。其原理培養(yǎng)基中的碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類等大分子電惰性物質(zhì)，隨著細(xì)菌的生長被代謝成乳酸鹽、醋酸鹽等小分子電活性物質(zhì)，[45]。這些小分子電活性物質(zhì)可以增加培養(yǎng)基導(dǎo)電性，使培養(yǎng)基的電阻發(fā)生變化，通過檢測(cè)培養(yǎng)基電阻變化情況，就可以判定細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長繁殖特性，即可以檢測(cè)出相應(yīng)的細(xì)菌[1]TongS,DavisJS,EichenbergerE,etaPathophysiology,ClinicalManifestations,andManagement[J].ClinicalMicrobioReviews,2015,28(3):603-661.[5]QuiteriaJ,DCid,SanzR,etal.InfluenceofageofthedonorsheepoStaphylococcusaureussubspeciesanaerobiusandResearchinVeterinaryScience,1996,61(3萄球菌PCR-ELISA檢測(cè)技術(shù)建立[J].食品工業(yè)科技，2016,[8]A,JindaiFan,etal.PreliminarytreatmentofbovinemastitiscausedbyStaphylococcuswithtrx-SA1,recombinantendolysinofS.aureusbacteriophageIME-SA1Microbiology,2016,191:65-71.[9]MoriY,NagamineK,TomitaN,etal.Detectionofloop-mediatedisothermalreactionbyturbidityderivedfrommagnesiumpyrophosphateformation.[J].BioResCommun,2001,289(1):150-154.[10]劉邦慧.金黃色葡萄球菌Rsp調(diào)控毒力基因表達(dá)的分子機(jī)制[D].中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)，2020.[11]汪慧春.面包蝦中金黃色葡萄球菌生長預(yù)測(cè)模型的建立[D].廣東海洋大學(xué)，2015.[12]李天銘.AraC家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白R(shí)sp對(duì)金黃色葡萄球菌毒力的調(diào)節(jié)及機(jī)制[D].復(fù)旦大[13]顏文光.不同來源金黃色葡萄球菌的腸毒素基因分布與SCCmec,spa及MLST分型研究包裝與食品機(jī)械，2012,3005:40-43.[16]UmedaK,NakamuraH,YamamotoK,etal.MolecularandepidemiologofstaphylococcalfoodborneoutbreakofStaphylococcusaureuselugeneswithoutproductionofclassicalenterotoxins.[fFoodMicrobiology,2017,256:30-35.theGradyMemorialHospitalexperiencewithmethicillin-resistantSaureusbacteremia.[J].AmericanHeartJournal,2004,147(3):536-539.[18]王林會(huì).基于莢膜及外毒素的免疫策略防治金黃色葡萄球菌感染效果研究[D].大連理工[19]TiradoC,S