第一章基因工程的概述與歷史發(fā)展第二章目的基因的獲取與PCR技術(shù)第三章基因表達(dá)載體的構(gòu)建與功能第四章基因載體的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)第五章基因工程產(chǎn)品的篩選與鑒定第六章基因工程的發(fā)展趨勢(shì)與未來(lái)展望01第一章基因工程的概述與歷史發(fā)展第1頁(yè)基因工程的誕生背景1953年DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)沃森和克里克的研究奠定了分子生物學(xué)的理論基礎(chǔ)1958年細(xì)菌質(zhì)粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)科恩和赫爾利的實(shí)驗(yàn)首次實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌間的基因轉(zhuǎn)移20世紀(jì)70年代的基因工程革命斯坦利·科恩和赫伯特·博耶等人開創(chuàng)了DNA重組技術(shù)1972年SV40病毒與λ噬菌體的重組首次實(shí)現(xiàn)了外源基因的整合表達(dá)，標(biāo)志著基因工程的誕生1973年抗氨芐青霉素基因的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)博耶團(tuán)隊(duì)將基因插入大腸桿菌，成為世界上第一株轉(zhuǎn)基因生物基因工程的應(yīng)用擴(kuò)展在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域迅速推廣，改變了人類生活第2頁(yè)基因工程的基本概念基因工程的定義通過(guò)人工手段重組不同生物的遺傳物質(zhì)，獲得新的遺傳性狀或功能核心工具限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、運(yùn)載體和轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)限制性內(nèi)切酶識(shí)別并切割特定DNA序列，如EcoRI識(shí)別GAATTC序列DNA連接酶連接DNA片段，如T4DNA連接酶運(yùn)載體如質(zhì)粒、噬菌體，用于攜帶目的基因轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)將外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，如CaCl?法轉(zhuǎn)化大腸桿菌第3頁(yè)基因工程的四大基本操作步驟獲取目的基因通過(guò)PCR擴(kuò)增或酶切克隆等方法獲取目標(biāo)基因構(gòu)建基因表達(dá)載體將目的基因插入質(zhì)粒或病毒載體，構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞將載體導(dǎo)入細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞篩選重組體通過(guò)抗性篩選或分子檢測(cè)等方法篩選成功轉(zhuǎn)化細(xì)胞PCR擴(kuò)增法通過(guò)特異性引物和熱循環(huán)技術(shù)快速擴(kuò)增目標(biāo)片段酶切克隆法利用限制性內(nèi)切酶和載體將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞第4頁(yè)基因工程的應(yīng)用領(lǐng)域與倫理爭(zhēng)議醫(yī)學(xué)領(lǐng)域基因治療和藥物生產(chǎn)，如乙肝疫苗和重組胰島素農(nóng)業(yè)領(lǐng)域抗蟲作物和轉(zhuǎn)基因水稻，提高作物產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值基因治療的倫理爭(zhēng)議如SCID基因治療案例引發(fā)的兒童權(quán)利問(wèn)題轉(zhuǎn)基因食品的安全性如Starlink玉米事件導(dǎo)致的市場(chǎng)恐慌基因?qū)＠墓叫詥?wèn)題少數(shù)企業(yè)壟斷技術(shù)，發(fā)展中國(guó)家難以獲得支持基因編輯的倫理挑戰(zhàn)如人類生殖系編輯可能帶來(lái)的不可逆后果02第二章目的基因的獲取與PCR技術(shù)第5頁(yè)目的基因獲取的傳統(tǒng)方法酶切克隆法通過(guò)限制性內(nèi)切酶切割DNA，構(gòu)建基因文庫(kù)化學(xué)合成法利用DNA合成儀人工合成寡核苷酸片段基因組測(cè)序法通過(guò)鳥槍法測(cè)序獲取基因序列信息基因芯片法通過(guò)雜交技術(shù)篩選目標(biāo)基因限制性內(nèi)切酶的局限性如單一酶切位點(diǎn)可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合DNA合成技術(shù)的成本問(wèn)題早期合成大片段基因成本高昂，限制了應(yīng)用第6頁(yè)P(yáng)CR技術(shù)的原理與操作流程PCR技術(shù)的原理通過(guò)模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程，體外擴(kuò)增特定片段變性步驟95℃高溫使DNA雙鏈解開，為擴(kuò)增做準(zhǔn)備退火步驟55℃左右使引物與模板結(jié)合，確定擴(kuò)增區(qū)域延伸步驟72℃下Taq聚合酶合成新鏈，完成擴(kuò)增PCR操作流程包括模板DNA、引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系和循環(huán)條件PCR技術(shù)的應(yīng)用如基因檢測(cè)、疾病診斷和轉(zhuǎn)基因技術(shù)第7頁(yè)P(yáng)CR技術(shù)的優(yōu)化與高級(jí)應(yīng)用梯度PCR通過(guò)不同退火溫度優(yōu)化擴(kuò)增效率長(zhǎng)片段PCR通過(guò)優(yōu)化Taq酶和緩沖液條件擴(kuò)增長(zhǎng)片段基因數(shù)字PCR通過(guò)絕對(duì)定量技術(shù)檢測(cè)稀有突變實(shí)時(shí)熒光定量PCR通過(guò)SYBRGreen染料實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增進(jìn)程巢式PCR通過(guò)二次擴(kuò)增提高檢測(cè)靈敏度多重PCR同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)片段第8頁(yè)P(yáng)CR技術(shù)的倫理與安全挑戰(zhàn)刑偵應(yīng)用如DNA指紋技術(shù)在犯罪偵查中的應(yīng)用基因檢測(cè)的倫理爭(zhēng)議如非意愿基因檢測(cè)引發(fā)的隱私問(wèn)題生物恐怖主義的威脅如通過(guò)PCR快速檢測(cè)生物武器實(shí)驗(yàn)室污染的風(fēng)險(xiǎn)如PCR產(chǎn)物可能污染環(huán)境基因編輯的脫靶效應(yīng)如CRISPR-Cas9可能產(chǎn)生非預(yù)期突變PCR技術(shù)的質(zhì)量控制如使用內(nèi)對(duì)照和陰性對(duì)照防止假陽(yáng)性03第三章基因表達(dá)載體的構(gòu)建與功能第9頁(yè)基因表達(dá)載體的基本組成復(fù)制起點(diǎn)（OriginofReplication）確保載體在宿主中自主復(fù)制抗性基因如氨芐青霉素抗性基因，用于篩選轉(zhuǎn)化成功細(xì)胞啟動(dòng)子（Promoter）調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，如SV40早期啟動(dòng)子終止子（Terminator）確保轉(zhuǎn)錄終止，如T7終止子多克隆位點(diǎn)（MultipleCloningSite）提供多個(gè)限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)，便于基因插入選擇標(biāo)記如抗生素抗性基因，用于篩選陽(yáng)性克隆第10頁(yè)常用基因表達(dá)載體的類型與特點(diǎn)原核表達(dá)載體如pET系列和pUC系列，適用于大腸桿菌表達(dá)真核表達(dá)載體如pCMV5和pEGFP-C1，適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)植物表達(dá)載體如pBI和pCAMBIA，適用于植物細(xì)胞表達(dá)病毒載體如腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒，適用于真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒載體的特點(diǎn)如復(fù)制能力、抗性標(biāo)記和多克隆位點(diǎn)病毒載體的特點(diǎn)如高轉(zhuǎn)染效率和宿主細(xì)胞特異性第11頁(yè)基因表達(dá)載體的構(gòu)建步驟與驗(yàn)證方法酶切消化使用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒和目的基因連接反應(yīng)使用DNA連接酶連接DNA片段轉(zhuǎn)化與篩選將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，通過(guò)抗性篩選陽(yáng)性克隆PCR驗(yàn)證通過(guò)PCR檢測(cè)插入片段的大小和方向測(cè)序驗(yàn)證通過(guò)測(cè)序確認(rèn)插入基因的序列正確性功能驗(yàn)證通過(guò)表達(dá)檢測(cè)蛋白功能是否正常第12頁(yè)基因表達(dá)載體的優(yōu)化策略增強(qiáng)子使用如CMV啟動(dòng)子和SV40增強(qiáng)子，提高表達(dá)效率標(biāo)簽融合如His標(biāo)簽和GST標(biāo)簽，便于蛋白純化和檢測(cè)密碼子優(yōu)化根據(jù)宿主細(xì)胞偏好密碼子優(yōu)化基因序列核糖體結(jié)合位點(diǎn)優(yōu)化如Shine-Dalgarno序列，提高翻譯效率核輸出信號(hào)優(yōu)化如SP6啟動(dòng)子，提高mRNA穩(wěn)定性多拷貝表達(dá)盒如使用多個(gè)啟動(dòng)子提高表達(dá)量04第四章基因載體的轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)第13頁(yè)原核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)化方法熱激法通過(guò)42℃短暫處理提高細(xì)胞壁通透性電穿孔法通過(guò)高壓電場(chǎng)形成細(xì)胞膜孔隙化學(xué)轉(zhuǎn)化法使用化學(xué)物質(zhì)如鈣離子處理細(xì)胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化通過(guò)酶解去除細(xì)胞壁，提高轉(zhuǎn)化效率熱激法的操作步驟包括細(xì)胞準(zhǔn)備、轉(zhuǎn)化和篩選電穿孔法的應(yīng)用場(chǎng)景適用于難轉(zhuǎn)化細(xì)胞和大規(guī)模轉(zhuǎn)化第14頁(yè)真核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)化學(xué)轉(zhuǎn)染如脂質(zhì)體法和磷酸鈣法，通過(guò)化學(xué)物質(zhì)幫助DNA進(jìn)入細(xì)胞物理轉(zhuǎn)染如基因槍法和超聲波法，通過(guò)物理方法幫助DNA進(jìn)入細(xì)胞生物轉(zhuǎn)染如病毒載體轉(zhuǎn)染，通過(guò)病毒感染將DNA導(dǎo)入細(xì)胞脂質(zhì)體法的原理通過(guò)陽(yáng)離子脂質(zhì)體包裹DNA，形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物磷酸鈣法的原理通過(guò)磷酸鈣沉淀DNA，形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞基因槍法的應(yīng)用場(chǎng)景適用于植物細(xì)胞和難轉(zhuǎn)染細(xì)胞第15頁(yè)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒載體通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA轉(zhuǎn)化為DNA，實(shí)現(xiàn)基因整合腺相關(guān)病毒載體通過(guò)病毒感染將DNA導(dǎo)入細(xì)胞腺病毒載體通過(guò)病毒感染將DNA導(dǎo)入細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的應(yīng)用場(chǎng)景適用于長(zhǎng)期表達(dá)和基因治療腺相關(guān)病毒載體的特點(diǎn)無(wú)致病性，可感染分裂和非分裂細(xì)胞腺病毒載體的特點(diǎn)轉(zhuǎn)染效率高，但存在免疫原性第16頁(yè)轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)染效率的評(píng)估方法報(bào)告基因系統(tǒng)如β-半乳糖苷酶和熒光素酶，用于檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率定量PCR通過(guò)熒光信號(hào)定量檢測(cè)基因拷貝數(shù)Southern雜交通過(guò)放射性探針檢測(cè)DNA片段流式細(xì)胞術(shù)通過(guò)熒光標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物顯微鏡觀察通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率基因測(cè)序通過(guò)測(cè)序檢測(cè)基因整合位點(diǎn)05第五章基因工程產(chǎn)品的篩選與鑒定第17頁(yè)轉(zhuǎn)化體的篩選方法抗性篩選通過(guò)抗生素抗性基因篩選陽(yáng)性克隆顏色篩選如藍(lán)白斑篩選，通過(guò)酶切圖譜檢測(cè)插入片段PCR檢測(cè)通過(guò)特異性引物檢測(cè)插入基因的存在Southern雜交通過(guò)放射性探針檢測(cè)DNA片段酶切圖譜分析通過(guò)限制性內(nèi)切酶檢測(cè)插入片段的大小和方向測(cè)序驗(yàn)證通過(guò)測(cè)序確認(rèn)插入基因的序列正確性第18頁(yè)基因表達(dá)產(chǎn)物的鑒定技術(shù)酶活性測(cè)定通過(guò)底物反應(yīng)檢測(cè)酶的活性免疫印跡通過(guò)抗體檢測(cè)蛋白的存在質(zhì)譜分析通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)蛋白的分子量核磁共振波譜通過(guò)核磁共振檢測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)熒光光譜通過(guò)熒光標(biāo)記檢測(cè)蛋白的存在免疫熒光通過(guò)熒光標(biāo)記檢測(cè)蛋白的存在第19頁(yè)基因工程產(chǎn)品的生物信息學(xué)鑒定序列比對(duì)通過(guò)BLAST比對(duì)檢測(cè)基因相似性基因注釋通過(guò)基因數(shù)據(jù)庫(kù)注釋基因功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過(guò)同源建模預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)通過(guò)生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)功能位點(diǎn)代謝通路分析通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析基因代謝通路蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)相互作用第20頁(yè)基因工程產(chǎn)品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)無(wú)菌檢測(cè)通過(guò)培養(yǎng)法檢測(cè)微生物污染內(nèi)毒素檢測(cè)通過(guò)LAL檢測(cè)內(nèi)毒素含量溶血素檢測(cè)通過(guò)溶血素檢測(cè)細(xì)胞毒性細(xì)胞因子檢測(cè)通過(guò)ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子釋放DNA序列分析通過(guò)測(cè)序檢測(cè)基因序列正確性蛋白質(zhì)純度檢測(cè)通過(guò)SDS檢測(cè)蛋白質(zhì)純度06第六章基因工程的發(fā)展趨勢(shì)與未來(lái)展望第21頁(yè)基因編輯技術(shù)的革命性突破CRISPR-Cas9的原理通過(guò)向?qū)NA和Cas9酶切割特定DNA序列CRISPR技術(shù)的應(yīng)用如基因治療、基因編輯和合成生物學(xué)CRISPR技術(shù)的局限性如脫靶效應(yīng)和倫理爭(zhēng)議CRISPR技術(shù)的優(yōu)化如開發(fā)高精度Cas9酶和優(yōu)化gRNA設(shè)計(jì)CRISPR技術(shù)的倫理挑戰(zhàn)如人類生殖系編輯的倫理爭(zhēng)議CRISPR技術(shù)的監(jiān)管趨勢(shì)如國(guó)際組織和政府機(jī)構(gòu)的監(jiān)管第22頁(yè)基因合成技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展基因合成技術(shù)的原理通過(guò)化學(xué)方法合成DNA片段基因合成技術(shù)的應(yīng)用如合成人工基因組基因合成技術(shù)的成本問(wèn)題基因合成技術(shù)的成本逐漸降低基因合成技術(shù)的應(yīng)用場(chǎng)景如合成治療性蛋白基因合成技術(shù)的倫理挑戰(zhàn)如基因合成技術(shù)的倫理爭(zhēng)議基因合成技術(shù)的監(jiān)管趨勢(shì)如基因合成技術(shù)的監(jiān)管第23頁(yè)基因治療產(chǎn)品的商業(yè)化進(jìn)程基因治療產(chǎn)品的市場(chǎng)增長(zhǎng)基因治療產(chǎn)品的市場(chǎng)規(guī)模逐漸擴(kuò)大基因治療產(chǎn)品的應(yīng)用場(chǎng)景如治療遺傳性疾病基因治療產(chǎn)品的倫理挑戰(zhàn)如基因治療的倫理爭(zhēng)議