2025年臨床基因擴增試題及答案一、單項選擇題（每題2分，共30題，計60分）1.關于聚合酶鏈式反應（PCR）的基本步驟，正確的順序是：A.退火→變性→延伸B.變性→延伸→退火C.變性→退火→延伸D.延伸→變性→退火2.設計PCR引物時，以下哪項不符合原則？A.引物長度18-25bpB.引物GC含量40%-60%C.3’端避免連續(xù)3個G/CD.引物間互補序列超過5bp3.實時熒光定量PCR中，SYBRGreenI染料的作用是：A.特異性結合雙鏈DNAB.標記探針5’端熒光基團C.淬滅熒光信號D.識別靶序列單鏈區(qū)域4.臨床基因擴增實驗室設置內標的主要目的是：A.監(jiān)測擴增效率B.排除假陽性C.校準儀器誤差D.驗證試劑有效性5.實時熒光定量PCR中，“平臺期”出現(xiàn)的主要原因是：A.引物耗盡B.模板濃度過高C.Mg2?濃度不足D.熱啟動酶未激活6.以下哪種污染是臨床基因擴增實驗室最常見的交叉污染來源？A.樣本間核酸污染B.環(huán)境中氣溶膠污染C.試劑本身攜帶的污染D.儀器內部殘留污染7.采用絕對定量法檢測HBVDNA時，標準品的制備要求不包括：A.與靶序列同源性≥95%B.濃度需經(jīng)國際標準品溯源C.需包含內源性參照基因D.穩(wěn)定性需經(jīng)長期驗證8.逆轉錄PCR（RT-PCR）中，若選擇Oligo(dT)引物進行逆轉錄，最適用于：A.環(huán)狀RNAB.總mRNAC.長鏈非編碼RNAD.病毒單鏈RNA9.熔解曲線分析中，出現(xiàn)雙峰的可能原因是：A.引物二聚體形成B.模板濃度過低C.退火溫度過高D.Taq酶活性異常10.臨床基因擴增實驗室分區(qū)中，“擴增產(chǎn)物分析區(qū)”與“試劑準備區(qū)”之間的壓差應滿足：A.正壓≥5PaB.負壓≥5PaC.正壓≥10PaD.負壓≥10Pa11.檢測新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）時，選擇ORF1ab和N基因雙靶標設計的主要目的是：A.提高檢測靈敏度B.降低引物二聚體風險C.避免病毒變異導致的漏檢D.縮短擴增時間12.以下哪種情況會導致熒光定量PCR結果Ct值偏大？A.模板中存在PCR抑制物B.引物濃度過高C.退火溫度過低D.擴增循環(huán)數(shù)增加13.實驗室使用全自動核酸提取儀時，若同一批次樣本中陰性對照出現(xiàn)陽性結果，首先應排查：A.提取儀加樣針污染B.試劑配置錯誤C.樣本采集不規(guī)范D.擴增儀溫度偏差14.人乳頭瘤病毒（HPV）分型檢測中，采用多重PCR技術的關鍵是：A.優(yōu)化引物濃度比例B.增加擴增循環(huán)數(shù)C.提高變性溫度D.使用熱啟動酶15.結核分枝桿菌（MTB）核酸檢測中，若樣本為痰液，預處理時需加入NaOH的主要作用是：A.滅活病毒B.消化黏液成分C.裂解結核桿菌細胞壁D.中和酸性環(huán)境16.以下關于基因擴增實驗室質量控制的描述，錯誤的是：A.每批次檢測需包含陰性質控、陽性質控B.陽性質控濃度應接近檢測下限C.室內質控數(shù)據(jù)需保存至少2年D.儀器校準應使用計量認證的標準物質17.數(shù)字PCR（dPCR）與實時熒光定量PCR的主要區(qū)別是：A.無需標準曲線B.依賴Ct值計算C.可檢測低豐度突變D.對抑制物更敏感18.檢測血漿游離DNA（cfDNA）時，若樣本溶血，可能導致：A.cfDNA濃度假性升高B.擴增效率提高C.熔解曲線峰型變窄D.內標Ct值偏小19.基因擴增實驗室操作中，以下哪項符合生物安全要求？A.在擴增產(chǎn)物分析區(qū)進行樣本處理B.戴手套接觸公共物品后無需更換C.使用后槍頭直接丟棄于普通垃圾桶D.實驗結束后用10%次氯酸鈉擦拭臺面20.多重熒光PCR中，選擇不同熒光通道的原則是：A.熒光基團發(fā)射光譜無重疊B.熒光強度一致C.淬滅基團類型相同D.探針長度一致21.以下哪種物質可有效去除實驗室環(huán)境中的DNA污染？A.75%乙醇B.紫外線（254nm）照射C.去離子水D.生理鹽水22.檢測BRCA1基因突變時，若采用ARMS-PCR技術，其核心設計是：A.引物3’端與突變位點匹配B.探針標記不同熒光基團C.增加Mg2?濃度D.縮短退火時間23.實時熒光定量PCR結果判讀中，“灰區(qū)”樣本的處理原則是：A.直接判定為陽性B.重復檢測并結合臨床C.判定為陰性D.更換檢測平臺重新檢測24.實驗室使用的定量PCR儀，溫度均勻性的校準應至少：A.每月1次B.每季度1次C.每半年1次D.每年1次25.以下關于逆轉錄過程的描述，正確的是：A.逆轉錄酶具有5’→3’外切酶活性B.dNTP濃度過高會抑制逆轉錄C.RNA模板需經(jīng)95℃變性5分鐘D.Oligo(dT)引物適用于所有RNA模板26.檢測微小殘留病灶（MRD）時，基因擴增方法的關鍵要求是：A.高靈敏度B.高特異性C.快速檢測D.低成本27.基因擴增實驗室中，“一次污染”指的是：A.擴增產(chǎn)物對環(huán)境的污染B.樣本間交叉污染C.試劑本身攜帶的污染D.儀器殘留污染28.以下哪種情況會導致擴增曲線呈“平臺期不明顯”？A.模板濃度過高B.引物濃度過低C.擴增循環(huán)數(shù)不足D.熒光染料過量29.人源內參基因（如β-actin）在臨床檢測中的作用是：A.驗證樣本核酸提取效率B.提高檢測靈敏度C.區(qū)分感染類型D.縮短檢測時間30.基因擴增實驗室的“三不原則”不包括：A.不同區(qū)域物品不混用B.擴增后產(chǎn)物不返回前區(qū)C.未經(jīng)驗證的試劑不使用D.非實驗人員不進入二、多項選擇題（每題3分，共10題，計30分。每題至少2個正確選項，多選、少選、錯選均不得分）1.影響PCR特異性的因素包括：A.引物設計B.退火溫度C.dNTP濃度D.Taq酶濃度2.實時熒光定量PCR的應用場景包括：A.病原體載量監(jiān)測B.基因表達量分析C.單核苷酸多態(tài)性（SNP）分型D.大片段基因缺失檢測3.臨床基因擴增實驗室質量控制措施包括：A.定期校準儀器B.使用批次間質控品C.記錄溫濕度數(shù)據(jù)D.人員培訓與考核4.核酸提取過程中導致產(chǎn)率降低的可能原因有：A.樣本保存時間過長B.裂解液體積不足C.離心轉速不夠D.洗脫緩沖液pH不適5.熒光定量PCR結果假陽性的可能原因是：A.擴增產(chǎn)物污染B.引物二聚體形成C.樣本中存在同源序列D.內標Ct值異常6.實驗室處理污染事件的步驟包括：A.立即停止實驗B.標記污染區(qū)域C.使用DNA酶清除污染D.驗證清除效果7.多重PCR設計時需注意：A.引物間避免互補B.各靶標擴增效率一致C.熒光通道無重疊D.增加dNTP濃度8.以下關于內標的描述，正確的是：A.內標需與靶基因同時擴增B.內標可監(jiān)測抑制物存在C.內標濃度需高于靶基因D.內標序列應與靶基因無同源性9.檢測RNA病毒時，逆轉錄失敗的可能原因有：A.RNA模板降解B.逆轉錄酶失活C.引物與模板不匹配D.dNTP濃度過低10.基因擴增實驗室生物安全防護要求包括：A.穿實驗服、戴手套B.樣本處理在生物安全柜中進行C.廢棄標本高壓滅菌后處理D.實驗人員定期健康監(jiān)測三、案例分析題（共1題，計10分）某實驗室使用實時熒光定量PCR檢測HPV16型，同一批次檢測中出現(xiàn)以下情況：-陽性對照（已知HPV16陽性）Ct值為28（正常范圍25-30），熔解曲線單峰；-陰性對照（無核酸水）Ct值為38（儀器判讀閾值為40），熔解曲線無峰；-樣本A：Ct值為32，熔解曲線單峰；-樣本B：Ct值為35，熔解曲線出現(xiàn)雙峰（主峰82℃，次峰75℃）；-樣本C：無Ct值，熔解曲線無峰。問題：1.該批次檢測的內外部質量控制是否符合要求？說明理由。（3分）2.樣本A、B、C的結果應如何判讀？分析可能原因。（5分）3.針對樣本B的情況，實驗室應采取哪些驗證措施？（2分）答案及解析一、單項選擇題1.C（PCR基本步驟為變性（95℃解鏈）→退火（引物結合）→延伸（Taq酶合成DNA））2.D（引物間互補序列超過5bp易形成引物二聚體，需避免）3.A（SYBRGreenI特異性嵌入雙鏈DNA，發(fā)射熒光）4.A（內標用于監(jiān)測擴增過程中的抑制或效率問題）5.A（平臺期因引物、dNTP等消耗，擴增速率下降）6.B（氣溶膠污染是最常見的交叉污染來源）7.C（絕對定量標準品需溯源，但無需內源性參照）8.B（Oligo(dT)結合mRNA的polyA尾，適用于總mRNA逆轉錄）9.A（引物二聚體熔解溫度較低，與靶序列峰形成雙峰）10.B（擴增產(chǎn)物分析區(qū)為污染區(qū)，需保持負壓防止污染擴散）11.C（雙靶標設計可降低病毒變異導致的漏檢風險）12.A（抑制物會延緩擴增，導致Ct值偏大）13.A（全自動提取儀加樣針污染易導致陰性對照陽性）14.A（多重PCR需優(yōu)化引物濃度比例以平衡擴增效率）15.B（NaOH用于消化痰液中的黏液，提高核酸提取效率）16.B（陽性質控濃度應覆蓋檢測范圍，而非僅接近下限）17.A（dPCR通過計數(shù)微滴實現(xiàn)絕對定量，無需標準曲線）18.A（溶血釋放的基因組DNA會導致cfDNA濃度假性升高）19.D（10%次氯酸鈉可有效滅活核酸，符合生物安全要求）20.A（熒光通道選擇需避免發(fā)射光譜重疊，防止信號干擾）21.B（254nm紫外線可破壞DNA結構，去除污染）22.A（ARMS-PCR通過引物3’端與突變位點匹配實現(xiàn)特異性擴增）23.B（灰區(qū)樣本需重復檢測并結合臨床綜合判斷）24.C（定量PCR儀溫度均勻性校準每半年至少1次）25.B（dNTP濃度過高會抑制逆轉錄酶活性）26.A（MRD檢測需高靈敏度以識別低豐度腫瘤細胞）27.C（“一次污染”指試劑或樣本本身攜帶的污染）28.B（引物濃度過低會導致擴增效率下降，平臺期不明顯）29.A（人源內參用于驗證樣本核酸提取是否成功）30.C（“三不原則”指區(qū)域物品不混用、產(chǎn)物不返回前區(qū)、非人員不進入）二、多項選擇題1.ABCD（引物設計、退火溫度、dNTP和Taq酶濃度均影響特異性）2.ABC（大片段缺失需其他方法如PCR-凝膠電泳檢測）3.ABCD（儀器校準、質控品使用、環(huán)境記錄、人員培訓均為質控措施）4.ABCD（樣本保存、裂解液、離心條件、洗脫液pH均影響提取產(chǎn)率）5.ABC（污染、引物二聚體、同源序列均可能導致假陽性）6.ABD（DNA酶無法清除環(huán)境中的DNA污染，需用紫外線或次氯酸鈉）7.ABC（多重PCR需避免引物互補、平衡效率、避免熒光重疊）8.ABD（內標濃度應與靶基因相當，過高會競爭擴增）9.ABCD（RNA降解、酶失活、引物不匹配、dNTP不足均導致逆轉錄失?。?0.ABCD（實驗服、生物安全柜、高壓滅菌、健康監(jiān)測均為生物安全要求）三、案例分析題1.質量控制符合要求。陽性對照Ct值在正常范圍且熔解曲線單峰，說明試劑和擴增體系有效；陰性對照Ct值＞40且無熔解峰，說明無擴增污染。2.樣本A：Ct值32＜40且熔解曲線單峰，判為