匯報人:XXXX2025年12月24日甲型流感病毒實驗室檢測指南PPTCONTENTS目錄01

概述與檢測意義02

標本采集與處理03

核酸檢測技術(shù)04

病毒分離鑒定CONTENTS目錄05

生物安全要求06

質(zhì)量控制與管理07

結(jié)果分析與報告08

附錄與參考文獻概述與檢測意義01甲型流感病毒生物學特性病毒分類與結(jié)構(gòu)甲型流感病毒屬于正黏病毒科，基因組由8個單鏈RNA片段組成，根據(jù)表面糖蛋白血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的差異可分為多種亞型，如H1N1、H3N2等。病毒易變性該病毒易發(fā)生抗原漂移或轉(zhuǎn)變，抗原漂移導致季節(jié)性流行，抗原轉(zhuǎn)變可能引發(fā)大流行，這一特性使其防控難度增加，需要持續(xù)監(jiān)測病毒變異情況。病毒傳播與潛伏期主要通過飛沫、接觸傳播，潛伏期一般為1-4天，在潛伏期內(nèi)患者即可具有傳染性，增加了疾病防控的復雜性。宿主范圍具有廣泛的宿主范圍，包括人、禽類、豬等動物宿主，動物宿主可作為病毒重組庫，增加了跨種傳播和病毒變異的風險。檢測目的與適用范圍檢測目的早期診斷與隔離，快速識別感染者以啟動抗病毒治療及隔離措施，減少社區(qū)傳播；流行病學監(jiān)測，通過病毒分型和基因測序追蹤變異株，評估疫苗匹配度；差異化診療，與其他呼吸道感染鑒別，避免抗生素濫用，優(yōu)化醫(yī)療資源分配。適用人群出現(xiàn)流感樣癥狀（發(fā)熱≥38℃伴咳嗽/咽痛）且發(fā)病48小時內(nèi)的患者；聚集性疫情中的密切接觸者；免疫功能低下者需優(yōu)先檢測。樣本類型選擇鼻咽拭子為首選（病毒載量高），亦可采用咽拭子、肺泡灌洗液或痰液，采樣需嚴格無菌操作以避免假陰性結(jié)果。檢測方法原則推薦快速抗原檢測（15-30分鐘出結(jié)果）用于初篩，但敏感性較低（50-70%）；RT-PCR為金標準（敏感性＞95%），適用于確診及分型；病毒培養(yǎng)和測序僅用于科研或特殊監(jiān)測。流行病學監(jiān)測價值01疫情早期預警與趨勢預測通過實驗室檢測陽性率變化，可早期識別甲型流感流行趨勢，為公共衛(wèi)生決策提供數(shù)據(jù)支持，如及時調(diào)整疫苗接種策略和醫(yī)療資源配置。02病毒變異株追蹤與疫苗匹配對分離的病毒株進行基因測序，監(jiān)測HA、NA等關鍵基因的變異情況，評估流行株與疫苗株的匹配度，為疫苗更新提供科學依據(jù)，保障疫苗保護效果。03傳播鏈分析與防控措施優(yōu)化結(jié)合病例流行病學信息和病毒基因序列，追溯疫情傳播鏈，識別聚集性疫情的傳播來源和途徑，指導針對性防控措施的制定與實施，有效控制疫情擴散。04重癥病例風險評估與救治指導通過對檢測數(shù)據(jù)的分析，掌握不同人群（如兒童、老年人、慢性病患者）的感染率和重癥發(fā)生率，評估特定人群的重癥風險，為臨床救治資源的優(yōu)先調(diào)配和重癥病例的早期干預提供依據(jù)。標本采集與處理02推薦采集標本種類

核心呼吸道標本類型發(fā)病后應盡快采集鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔沖洗液；氣管插管患者需收集氣管吸取物，標本應置于無菌病毒采樣液中。

拭子選擇標準推薦使用頭部為合成纖維（如聚酯纖維）的拭子，鋁或塑料柄；禁止使用棉拭子和木柄，采樣管需含3毫升病毒采樣液（含蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑、抗生素及緩沖液）。

特殊病例標本要求重癥或有創(chuàng)通氣患者優(yōu)先采集下呼吸道標本（如氣管吸取物），其病毒載量更高，檢測準確性優(yōu)于上呼吸道標本。拭子選擇與采樣液要求拭子材質(zhì)與柄部要求應使用頭部為合成纖維（如聚酯纖維）的拭子，柄部為鋁或塑料材質(zhì)。不推薦使用棉拭子和木柄，以避免對病毒核酸檢測造成干擾。采樣液成分標準標本采集管應包含3毫升病毒采樣液，該采樣液需含有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑、阻止細菌和真菌生長的抗生素以及緩沖液，確保病毒在采樣和運輸過程中的穩(wěn)定性。采樣液禁用與替代要求嚴禁使用生理鹽水或蒸餾水替代專用病毒采樣液。采樣液需提前配置并按規(guī)定條件儲存，未收集標本時可在-20℃凍存，采集標本后應在4℃條件下保存和運送。標本儲存與分裝規(guī)范

臨床標本儲存條件保存在4℃（不能超過4天）或者-70℃或-70℃以下。有條件的實驗室均應保存在-70℃或-70℃以下。不應保存在-20℃。

標本分裝處理要求標本送至實驗室后，立即進行處理，避免反復凍融。將原始標本分為三份，一份用于核酸檢測，一份用于病毒分離，一份保存待復核。

短期儲存規(guī)范若樣本需短期保存，置于2-8℃冷藏環(huán)境，避免反復凍融，保存時間不超過規(guī)定期限以保證檢測準確性。

長期冷凍要求需長期保存的樣本應分裝后存放于-70℃超低溫冰箱，避免溫度波動導致病毒核酸降解。定期檢查儲存設備的溫度記錄儀，確保穩(wěn)定性，并配備備用電源以應對突發(fā)斷電情況。UN2814包裝與運送流程UN2814包裝規(guī)范

疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例標本列為A類，需采用符合UN2814標準的三層包裝系統(tǒng)，包括防漏主容器、帶吸附材料的輔助包裝和硬質(zhì)外包裝，并粘貼生物危害標識及方向標簽。標本送檢單填寫要求

需完整填寫疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例標本送檢單（附表2），內(nèi)容包括患者姓名、性別、年齡、職業(yè)、現(xiàn)住址、發(fā)病日期、標本種類、采集日期、標本量等關鍵信息，確保信息準確可追溯。運輸條件與監(jiān)控

運輸過程中應維持適當溫度，避免標本反復凍融。運輸箱內(nèi)放置足量冰排或干冰以保持低溫環(huán)境，并配備溫度監(jiān)控設備記錄全程溫度，確保運輸條件符合生物安全要求，防止標本變質(zhì)或病毒滅活。交接與記錄管理

標本運送至接收實驗室后，雙方需核對標本信息、包裝完整性及溫度記錄，確認無誤后簽字交接。運輸全程需有詳細記錄，包括發(fā)送單位、接收單位、運送人員、起止時間等，確保責任可追溯。核酸檢測技術(shù)03real-timeRT-PCR檢測原理

技術(shù)原理概述基于逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）原理，結(jié)合實時熒光信號監(jiān)測技術(shù)，實現(xiàn)對甲型H1N1流感病毒RNA的定性檢測。通過特異性引物和雙重標記TaqMan?探針，識別病毒保守基因區(qū)域，在擴增過程中實時檢測熒光信號累積，實現(xiàn)快速診斷。

引物與探針設計采用美國CDC設計的特異性引物和探針，針對甲型H1N1流感病毒的保守基因片段（如InfA、swInfA、swH1等靶標）。引物負責擴增目標序列，探針攜帶熒光基團和淬滅基團，擴增時探針被水解釋放熒光信號，確保檢測的高特異性。

檢測流程與信號解讀檢測流程包括RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA、實時熒光PCR擴增三個步驟。通過監(jiān)測熒光信號的S型擴增曲線及Ct值（循環(huán)閾值）判斷結(jié)果：Ct值≤35且曲線典型判為陽性，無擴增或Ct值＞40為陰性，Ct值35-40需重復驗證。該方法可同時篩選甲型流感病毒并排除季節(jié)性流感和H5N1禽流感病毒。引物探針設計與來源

美國CDC設計的real-timeRT-PCR引物探針4月29日WHO網(wǎng)站公布美國CDC設計的針對本次甲型H1N1流感病毒的real-timeRT-PCR引物和探針，用于檢測疑似病例呼吸道樣本，可篩選甲型流感病毒并排除季節(jié)性流感病毒和H5N1禽流感病毒，方法參見附件3（中文翻譯版）和附件4（英文原版）。

國家流感中心設計的RT-PCR引物國家流感中心設計了RT-PCR方法檢測新的甲型H1N1流感病毒，其引物序列為國內(nèi)自主研發(fā)，RT-PCR方法參見附件5。RT-PCR方法操作步驟

核酸提取采用磁珠法或硅膠膜離心柱法提取樣本RNA，加入外源性內(nèi)標監(jiān)控提取效率。在生物安全柜內(nèi)操作，嚴格分區(qū)，洗脫體積控制在50-100μl。

反應體系配制按試劑盒說明配制反應混合液，包含逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、dNTPs、熒光探針及特異性引物。在PCR配制區(qū)進行，避免交叉污染，分裝后立即使用或低溫保存。

樣本RNA加樣在核酸提取區(qū)，向分裝好的反應體系中加入5μlRNA模板，同時設置陰性對照（無菌水）和陽性對照。加樣后蓋緊蓋子，混勻離心。

擴增程序設置進行兩步法擴增：逆轉(zhuǎn)錄階段將RNA轉(zhuǎn)為cDNA，擴增階段設置預變性（95℃30秒）、循環(huán)變性（95℃5秒）、退火/延伸（60℃30秒）共40個循環(huán)，在退火/延伸步驟采集熒光信號。

結(jié)果判讀陽性對照Ct≤35且陰性對照無擴增時，樣本Ct值<40且有典型S型擴增曲線判為陽性；Ct值35-40為灰區(qū)，需重復檢測或測序確認；無擴增曲線或Ct值≥40為陰性。結(jié)果判讀標準與質(zhì)控

陽性結(jié)果判定標準核酸檢測中，擴增曲線呈典型S型且Ct值≤預設截斷值（如Ct≤38），同時內(nèi)參基因擴增正常，可判定為甲型流感病毒核酸陽性。

陰性結(jié)果判定標準所有靶標基因無擴增曲線，且內(nèi)參基因Ct值在有效范圍內(nèi)，同時陰性對照結(jié)果正常，方可報告陰性。需排除標本采集不當或運輸條件不符導致的假陰性。

臨界值結(jié)果處理流程若Ct值處于灰區(qū)（如38<Ct<40）或擴增曲線異常，需重新提取核酸復測，并補充血清學或病毒培養(yǎng)等輔助檢測方法。

質(zhì)量控制品設置要求每批次檢測需包含弱陽性對照（Ct32±2）、陰性對照和空白對照，批內(nèi)變異系數(shù)（CV）應<5%，室間質(zhì)評符合率需≥95%。病毒分離鑒定04雞胚培養(yǎng)方法

01雞胚選擇與預處理選用9-11日齡SPF雞胚，照蛋確認存活后標記氣室及尿囊腔位置，用70%乙醇消毒蛋殼，在氣室端鉆孔避免損傷殼膜。

02病毒接種與孵育使用1mL注射器將樣本接種于尿囊腔（0.1-0.2mL/胚），封孔后置于33-35℃、濕度60%的孵育箱中培養(yǎng)48-72小時，每日照蛋剔除死亡胚胎。

03尿囊液收集與檢測冷藏雞胚4℃過夜后抽取尿囊液，離心取上清進行血凝試驗（HA）檢測病毒滴度，陽性樣本需進一步通過RT-PCR或測序確認亞型。MDCK細胞培養(yǎng)流程細胞復蘇與接種從液氮或-80℃冰箱取出凍存的MDCK細胞，37℃水浴快速解凍，離心去除凍存液后，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，按適宜密度接種于培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細胞傳代與培養(yǎng)待細胞融合度達80%-90%時，棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌后，加入胰蛋白酶消化至細胞脫落，加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，吹打混勻后按1:3-1:5比例傳代，繼續(xù)培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。病毒接種與培養(yǎng)取處理后的臨床標本上清液，按一定比例接種于單層MDCK細胞，37℃吸附1-2小時，期間輕搖培養(yǎng)瓶促進病毒吸附，棄上清后加入含TPCK-胰蛋白酶的維持培養(yǎng)基，33-35℃、5%CO?培養(yǎng)箱孵育，每日觀察細胞病變效應（CPE）。病毒收獲與保存待CPE達75%以上時，收獲培養(yǎng)上清液，4℃離心去除細胞碎片，分裝后標記清楚，置于-70℃或以下保存，用于后續(xù)病毒鑒定或其他相關實驗。病毒鑒定方法與驗證

基于real-timeRT-PCR的病毒鑒定采用美國CDC設計的引物和探針序列，可快速篩選甲型流感病毒并排除季節(jié)性流感病毒和H5N1禽流感病毒，具有高靈敏度和特異性。

基于RT-PCR的病毒鑒定國家流感中心設計的RT-PCR方法，用于檢測新的甲型H1N1流感病毒，為病毒鑒定提供了另一種可靠的分子生物學手段。

病毒分離培養(yǎng)鑒定可采用雞胚和/或MDCK細胞進行流感病毒分離，具有相應條件的網(wǎng)絡實驗室在收到標本后24h內(nèi)進行病毒接種，是病毒鑒定的經(jīng)典方法。

血凝抑制試驗（HI）鑒定使用標準抗血清進行HI試驗，通過血凝抑制效價判定病毒亞型（如H1N1、H3N2等），需設置陰性對照和血清對照以排除非特異性反應。

基因測序與進化分析鑒定提取病毒RNA后通過RT-PCR擴增HA和NA基因片段，測序后與數(shù)據(jù)庫（如GISAID）比對分析，可評估病毒變異情況。生物安全要求05實驗室級別劃分標準診斷性實驗工作環(huán)境要求對疑似甲型H1N1流感病例臨床標本進行診斷性實驗，需在BSL-2實驗室內(nèi)開展，所有樣本操作均應在生物安全柜（BSC）內(nèi)進行，并遵循生物安全三級個人防護。病毒分離培養(yǎng)環(huán)境要求進行甲型H1N1流感病毒分離培養(yǎng)工作，應在BSL-3實驗室內(nèi)進行，同時嚴格遵循生物安全三級個人防護標準，以確保操作安全。分級管理依據(jù)實驗室級別劃分主要依據(jù)實驗操作的生物安全風險程度，診斷性實驗因樣本潛在風險相對較低，故在BSL-2實驗室進行；而病毒分離培養(yǎng)操作風險較高，因此需在更高防護級別的BSL-3實驗室開展。個人防護裝備配置

核心防護裝備要求實驗室人員必須穿戴N95及以上級別口罩、護目鏡、防護服及雙層手套，確保皮膚和黏膜不直接接觸樣本，降低感染風險。

生物安全三級防護標準對采集自疑似病例的臨床標本進行診斷性實驗工作，需遵循生物安全三級個人防護；病毒分離培養(yǎng)工作同樣需此級別防護。

特殊場景防護增強高風險操作（如病毒培養(yǎng)物處理）需額外使用正壓面罩或生物安全柜；處理樣本時，鞋套需防水且高至膝蓋，與防護服褲腳密封銜接。

防護裝備使用規(guī)范實驗開始后穿清潔工作服，使用新的一次性無粉手套；防護服袖口應緊貼手套邊緣，防止氣溶膠滲透；實驗前后需檢查裝備完整性。健康監(jiān)測與暴露處理

日常健康監(jiān)測要求所有實驗室人員均應每日自測發(fā)熱及其他癥狀，包括咳嗽、喉嚨痛、嘔吐、腹瀉、頭痛、流鼻涕和肌肉疼痛等。

癥狀報告與響應機制一旦出現(xiàn)疑似甲型H1N1流感癥狀，實驗室人員應立即停止工作并向上級報告，及時就醫(yī)并遵循醫(yī)療機構(gòu)指導。

職業(yè)暴露評估標準判定標準為在無有效防護情況下暴露于甲型H1N1流感確診病例的臨床標本或活病毒，包括氣溶膠吸入、皮膚黏膜接觸等情形。

暴露后預防措施發(fā)生職業(yè)暴露后，應在暴露后的7天時間里考慮使用奧司他韋或扎那米韋進行抗病毒藥物預防，并進行醫(yī)學觀察。質(zhì)量控制與管理06室內(nèi)質(zhì)控品設置要求

質(zhì)控品類型選擇需包含弱陽性、中陽性和強陽性樣本，覆蓋檢測方法的線性范圍，確保不同濃度水平的甲型流感病毒均能被準確識別。

質(zhì)控頻率與批次匹配每批次檢測必須同步運行內(nèi)部質(zhì)控樣本，若連續(xù)檢測超過規(guī)定批次，需增加質(zhì)控頻次以監(jiān)控系統(tǒng)穩(wěn)定性。

質(zhì)控參數(shù)要求每批次檢測需包含弱陽性對照（Ct32±2）、陰性對照和空白對照，批內(nèi)變異系數(shù)（CV）應<5%，室間質(zhì)評符合率需≥95%。

質(zhì)控數(shù)據(jù)記錄與分析詳細記錄質(zhì)控樣本的CT值、擴增曲線形態(tài)等參數(shù)，定期繪制Levey-Jennings質(zhì)控圖，分析趨勢偏移或失控原因，并形成閉環(huán)管理。室間質(zhì)評與能力驗證

室間質(zhì)評的參與要求實驗室需定期參加國家級或省級臨床檢驗中心組織的甲型流感病毒檢測室間質(zhì)評活動，每年至少1次，確保檢測能力符合國家標準。

能力驗證的實施頻率每季度開展1次實驗室內(nèi)部能力驗證，采用已知濃度的甲型流感病毒核酸標準品進行盲樣檢測，驗證檢測系統(tǒng)的準確性和穩(wěn)定性。

質(zhì)評結(jié)果的判定標準室間質(zhì)評結(jié)果符合率需≥95%，能力驗證樣本檢測結(jié)果與靶值偏差應在±1個Ct值范圍內(nèi)，否則需啟動糾正措施并重新驗證。

持續(xù)改進機制對質(zhì)評不合格項目，需分析原因（如試劑批次、人員操作、設備狀態(tài)等），制定整改計劃并記錄，跟蹤驗證改進效果，確保檢測質(zhì)量持續(xù)提升。試劑與設備維護規(guī)范

試劑存儲與管理要求核酸提取試劑盒、PCR試劑等需按說明書要求避光、低溫（2-8℃或-20℃）保存，避免反復凍融。陽性對照品和陰性對照品應單獨存放，嚴格標記有效期，遵循"先進先出"原則使用。

檢測設備日常維護實時熒光定量PCR儀需每日進行溫度校準和光路檢查，每周清潔樣品槽及傳感器；生物安全柜定期（每6個月）進行高效過濾器完整性測試和氣流速度監(jiān)測，確保符合BSL-2級實驗室要求。

設備校準與性能驗證PCR儀每年由計量部門進行校準，驗證溫度準確性（偏差≤±0.5℃）和均一性；超低溫冰箱、生物安全柜等關鍵設備每日記錄運行參數(shù)，出現(xiàn)異常立即啟動備用設備并聯(lián)系維修。

維護記錄與追溯管理建立試劑使用登記冊，記錄批號、有效期、庫存量及領用信息；設備維護需詳細記錄校準日期、維護內(nèi)容、故障處理結(jié)果及操作人員，確保符合ISO15189實驗室質(zhì)量管理要求。結(jié)果分析與報告07陽性結(jié)果判定依據(jù)核酸檢測陽性標準基于real-timeRT-PCR方法，樣本Ct值≤38且出現(xiàn)典型S型擴增曲線，同時內(nèi)參基因擴增正常，可判定為甲型流感病毒核酸陽性。抗原檢測陽性標準免疫層析法檢測時，檢測線（T線）與質(zhì)控線（C線）同時顯色，無論顯色深淺，均判定為甲型流感病毒抗原陽性。病毒分離培養(yǎng)陽性標準雞胚或MDCK細胞培養(yǎng)出現(xiàn)典型細胞病變效應（CPE），且血凝試驗（HA）結(jié)果陽性，經(jīng)血凝抑制試驗（HI）或RT-PCR鑒定為甲型流感病毒。血清學檢測陽性標準恢復期血清甲型流感病毒IgG抗體滴度較急性期升高4倍及以上，或急性期IgM抗體陽性，結(jié)合流行病學史可判定為近期感染?；覅^(qū)結(jié)果處理流程

灰區(qū)結(jié)果判定標準當檢測樣本的Ct值處于35-40區(qū)間，或擴增曲線形態(tài)不典型（如未呈現(xiàn)明顯S型）時，判定為灰區(qū)結(jié)果，需啟動復核程序。

樣本重新檢測與驗證對灰區(qū)結(jié)果樣本，應重新提取核酸并使用原檢測方法進行重復檢測，同時可采用其他原理的檢測方法（如不同引物探針組合的RT-PCR）進行交叉驗證，確保結(jié)果可靠性。

結(jié)合臨床信息綜合評估復核過程中需結(jié)合患者的臨床癥狀（如發(fā)熱、咳嗽等）、流行病學史（如接觸史、聚集性疫情）及其他實驗室檢查結(jié)果