第八章

基因工程及其在醫(yī)藥工業(yè)中的應(yīng)用

第四節(jié)目的基因制備和常用分離方法

一、已知基因的獲得：（一）人工合成①根據(jù)已知某種基因的核苷酸序列或某種基因產(chǎn)物的氨基酸序列，可推導(dǎo)出為該多肽編碼的核苷酸序列，再用DNA合成儀人工合成目的基因。②適用于合成分子量較小的目的基因（100bp以內(nèi)）。

（二）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）P333圖8-161、定義：又稱基因體外擴(kuò)增；是在引物的介導(dǎo)下，通過(guò)變性、退火、延伸三步循環(huán)反應(yīng)，體外快速的DNA特異性擴(kuò)增技術(shù)。

——PCR技術(shù)的發(fā)明者——DNAReplication:

5’

3’dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPDNA-pol3’TemplatePrimer5’DNAReplication:3’2、PCR反應(yīng)原理模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過(guò)程，通過(guò)變性、退火、延伸三步反應(yīng)的循環(huán)完成，靶基因的雙鏈DNA變性為單鏈，特異的引物在退火過(guò)程中與單鏈DNA模板聚合，在靶DNA的指導(dǎo)下引物的3’末端延伸靶DNA的互補(bǔ)鏈，完成一個(gè)循環(huán)。理論上，每一循環(huán)使DNA分子擴(kuò)增一倍，n次循環(huán)后，DNA分子擴(kuò)增為2n；高溫變性：94℃，目的基因接連為單鏈，以作為擴(kuò)增的模板；

低溫復(fù)性：55～60℃，一對(duì)特異性引物分別與模板3’端互補(bǔ)結(jié)合；

適溫延伸：72℃，延伸反應(yīng)；

5

5

Template

DNA5

Primer15

Primer2

5

5

5

5

The1stcycleThe2ndcycle

5

5

5

5

5

5

5

5

平臺(tái)期指數(shù)擴(kuò)增期到達(dá)平臺(tái)期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于模板拷貝數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶的種類及活性.3、PCR產(chǎn)物特異性①模板序列：應(yīng)使用純度和濃度較高的DNA模板；②引物：優(yōu)化引物的設(shè)計(jì)③使用較高的退火溫度，較少的循環(huán)次數(shù)；④使用較低濃度的引物、酶和鎂離子；

4、PCR反應(yīng)體系模板：DNA或RNA(逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA)DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶緩沖液系統(tǒng)：Tris-HCl,KCl,Mg2＋底物：相同濃度的dNTP引物5、PCR的主要用途目的基因的克隆基因的體外突變DNA和RNA的微量分析DNA序列測(cè)定基因突變分析PCR儀器設(shè)備：自動(dòng)移液器和槍頭微量離心管PCR儀電泳設(shè)備SimpleandrapidoperationWideapplicability二、未知基因獲得(一)基因組DNA文庫(kù)：P336圖8－17采用限制酶將基因組DNA切成片段，每一個(gè)DNA片段都與一個(gè)載體分子拼接成重組DNA，然后將所有的重組體都引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到的分子克隆的混合體稱為“基因文庫(kù)”。從基因組文庫(kù)中通過(guò)雜交篩選得到目的基因片段?；蛭膸?kù)（genelibrary）(G-文庫(kù))：是含有某種生物全部基因隨機(jī)片段的重組DNA克隆群?；蛭膸?kù)含有基因組內(nèi)全部基因片段，包括外顯子和無(wú)表達(dá)功能的內(nèi)含子序列。每一個(gè)克隆只含有一個(gè)基因片段，應(yīng)用時(shí)利用探針，從文庫(kù)中釣取含有所需目的基因的克隆。

（二）cDNA文庫(kù)將不同細(xì)胞類型或不同階段細(xì)胞的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后,將所有cDNA混合體與載體進(jìn)行連接后，將所有的重組體分子都引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，所得到的分子克隆的混合體稱為

cDNA文庫(kù)。cDNA文庫(kù)(C-文庫(kù))：是以mRNA合成的互補(bǔ)cDNA的隨機(jī)片段的重組DNA克隆群。cDNA文庫(kù)不含內(nèi)含子序列，易于表達(dá)。具有組織細(xì)胞特異性：不同組織細(xì)胞、不同發(fā)育階段，基因表達(dá)的情況都不相同，應(yīng)選擇特異表達(dá)的細(xì)胞及狀態(tài)；C-文庫(kù)比G-文庫(kù)小得多，更容易篩選。第五節(jié)載體DNA與目的基因的連接

載體的選擇（主要考慮以下5個(gè)條件）1.有足夠容納目的基因的幅度根據(jù)克隆外源DNA片段的大小選擇合適的載體2.構(gòu)建DNA重組體的目的克隆選克隆載體，表達(dá)選表達(dá)載體3.載體MSC中的酶切位點(diǎn)根據(jù)克隆外源DNA的酶切位點(diǎn)選擇具有相同酶切位點(diǎn)的載體4.根據(jù)受體細(xì)胞的類型確定表達(dá)載體的類型5.載體克隆位點(diǎn)的閱讀框要與目的基因的閱讀框匹配

DNA分子的體外重組過(guò)程示意圖一、黏性末端DNA片斷的連接：當(dāng)在載體和目的基因上有相同的限制酶酶切位點(diǎn)時(shí)，用同種限制酶（或同尾酶）使二者產(chǎn)生相同的黏性末端，從而將二者連接。

同一種限制酶切割DNA產(chǎn)生的粘性末端的連接

G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ的識(shí)別序列及切割部位G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ含目的基因的DNA片段BamHⅠGC

C

T

A

G5'3'5'3'3'5'5'3'5'3'5'3'G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

G

G

A

T

C

C

G目的基因片段混合、退火G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

G

G

A

T

C

C

GG

C

C

T

A

G質(zhì)粒載體含目的基因的重組質(zhì)粒G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

GDNA連接酶1、插入失活法（單酶切）將外源目的基因插入載體選擇性標(biāo)記處，并使其失活。P340圖8－20質(zhì)粒pBR322的抗性基因篩選示意圖插入失活示意圖

2、定向克隆法（雙酶切）

為實(shí)現(xiàn)定向克隆，可采用兩種不同的限制酶同時(shí)酶切，使目的基因兩端具有不同的黏性末端；定向克隆法構(gòu)建重組分子P341

雙酶切DNA片段粘性末端的連接

G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠBamHⅠBamHⅠG

C

C

T

A

G5'3'5'3'5'5'5'3'5'3'3'G

A

A

T

T

CC

T

T

A

A

G

A

A

T

T

C

G目的基因片段混合、退火G

C

T

T

A

A

G

A

T

C

C

G

A

A

T

T

C

GG

C

C

T

A

G重組質(zhì)粒DNA連接酶EcoRIEco

RI5'

G

A

T

C

C

G

G

C

T

T

A

A

A

A

T

T

C

G

G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

G

G

C

T

T

A

AEcoRI

GATCC

G

G

CCTAG3'5'載體3、載體5’端脫磷法

載體酶切后，用AP（堿性磷酸酶）水解5’端的磷酸基團(tuán)防止載體的自身環(huán)化。重組分子在體內(nèi)修復(fù)缺口

P342圖8－22二、平末端DNA片斷的連接：在載體和目的基因上沒(méi)有相同的限制酶酶切位點(diǎn)時(shí)，采用平末端連接。1、由連接酶進(jìn)行的連接：限制酶直接切割生成平末端，或用核酸酶S1切去黏性末端的單鏈部分；P310在連接時(shí)，所用的ATP及T4DNA連接酶的濃度要比連接粘末端的高些2、同聚物尾連接：P343圖8－23利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體和目的基因的3’OH上加上互補(bǔ)的同聚物尾，兩者重組后，空隙由DNA聚合酶Ⅰ填補(bǔ)。

加入同聚體尾（homopolymerictail）連接

TdT：末端轉(zhuǎn)移酶，可將某種單一脫氧核苷酸逐一加到3’-OH上去。底物：3’粘性突出末端

3、人工接頭法：P343圖8－24

人工接頭（linker）：也稱銜接物，是用化學(xué)方法合成的一段由10～20個(gè)核苷酸所組成的，具有一個(gè)或幾個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平頭末端雙鏈寡核苷酸短片段。人工接頭法：用連接酶將人工接頭分子連接在目的基因的末端，再用相關(guān)的限制酶切割就可以使目的基因產(chǎn)生黏性末端。雙銜接物法構(gòu)建重組分子P344圖

連接物分子連接平末端的DNA片段示意圖5'3'3'5'G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

G3'5'5'3'BamHⅠ接頭多核苷酸激酶連接酶5'3'G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

G3'5'G

G

A

T

C

CC

C

T

A

G

GBamHⅠ切割G

C

C

T

A

G5'3'

G

A

T

C

C

G5'3'BamHⅠ切割的質(zhì)粒載體5'3'5'3'G

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

GG

C

C

T

A

G

G

A

T

C

C

G

G

A

T

C

C

GG

C

C

T

A

G重組質(zhì)粒目的基因第六節(jié)重組分子引入受體細(xì)胞

一、受體細(xì)胞的選擇1、原核/真核表達(dá)系統(tǒng)；2、克隆/表達(dá)；3、限制和修飾：應(yīng)為限制酶缺陷型（R-），重組缺陷型（Rec-）；4、互補(bǔ)功能：敏感型，營(yíng)養(yǎng)缺陷型；5、易于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)；6、感染寄生缺陷型。其他：7.遺傳穩(wěn)定性高，易于擴(kuò)大培養(yǎng)或發(fā)酵生長(zhǎng)。8.內(nèi)源蛋白水解酶缺失或蛋白酶含量低細(xì)胞，有利于外源蛋白質(zhì)在胞內(nèi)積累。9.具有較好的翻譯后加工機(jī)制。二、受體細(xì)胞的類型1、原核表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿菌、枯草桿菌、鏈球菌；2、真核表達(dá)系統(tǒng)：酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞（組織培養(yǎng)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞）；

三、受體細(xì)胞的感受態(tài)

重組DNA導(dǎo)入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化效率的高低與受體的感受態(tài)有關(guān)。1、感受態(tài)細(xì)胞：細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增加、具有攝取外源DNA的能力的細(xì)胞。2、制備感受態(tài)細(xì)胞的方法：冰浴中，用一定濃度的CaCl2處理。

四、重組子導(dǎo)入細(xì)胞的方法1、轉(zhuǎn)化：重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞的過(guò)程。2、轉(zhuǎn)染：重組DNA包裝成病毒顆粒再來(lái)感染受體細(xì)胞。3、微注射技術(shù)；4、電轉(zhuǎn)化法；5、基因槍技術(shù)；6、脂質(zhì)體介導(dǎo)法；

轉(zhuǎn)化（transformation）

定義：

將質(zhì)粒或其它外源DNA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過(guò)程。過(guò)程：細(xì)胞—低溫CaCl2處理—感受態(tài)細(xì)胞—加重組DNA—42℃熱休克—重組體吸入細(xì)胞—復(fù)蘇—涂板（含抗生素）—篩選轉(zhuǎn)化菌落。其它方法：電轉(zhuǎn)化、PEG法等。

重組DNA轉(zhuǎn)化過(guò)程示意圖轉(zhuǎn)染（fection）

以噬菌體、粘粒和真核病毒為載體的重組DNA分子，體外經(jīng)包裝成為具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染相應(yīng)的細(xì)胞，并在其中擴(kuò)增。此過(guò)程又叫轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）。

轉(zhuǎn)染效率》轉(zhuǎn)化效率

顯微注射法

使用機(jī)械的方法直接將外源DNA注射到細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)的方法。第七節(jié)重組體的鑒定和分析

陽(yáng)性重組子的鑒定和篩選①根據(jù)遺傳標(biāo)記表型特征：抗藥性、α－互補(bǔ)、營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記；②根據(jù)重組子結(jié)構(gòu)特征：大小、酶切圖譜、PCR擴(kuò)增、核酸分子雜交、DNA測(cè)序；③根據(jù)重組子表達(dá)產(chǎn)物：免疫分析篩選；一、生物學(xué)方法（一）表型篩選法1、雙抗生素篩選法結(jié)合載體上所含有的原核抗藥性標(biāo)記，利用抗生素和選擇培養(yǎng)基（不完全培養(yǎng)基），十分便于篩選陽(yáng)性重組子。適用于含>2個(gè)的抗性標(biāo)記的質(zhì)粒。例如pBR322，含Tetr（BamHI位點(diǎn)）和Ampr基因，外源DNA插入，使Tetr滅活。用分別含Ampr

和Tetr的平皿同時(shí)篩選，可鑒定出重組子。2、β－半乳糖苷酶篩選法a–互補(bǔ)（a-

complementation）某些質(zhì)粒（如PUC系列），含有大腸桿菌的lacZ基因片段，在該基因區(qū)又有MCS，這些質(zhì)粒將導(dǎo)入lacZ-的宿主菌中表達(dá)。

如果無(wú)外源基因插入：則質(zhì)粒lacZ基因正常表達(dá)和宿主菌的lacZ基因互補(bǔ)，產(chǎn)生有活性的β–半乳糖苷酶，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，分解X-gal底物，產(chǎn)生blueclony。

如果有外源基因插入：則質(zhì)粒編碼的lacZ基因失活、菌體不可能互補(bǔ)產(chǎn)生β–半乳糖苷酶，產(chǎn)生whiteclony。a–互補(bǔ)篩選重組體示意圖3、營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記篩選法例如酵母人工染色體上的TRP1HURA3基因，分別是酵母色氨酸和尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型trp1-和ura3-的野生型等位基因，在相應(yīng)的缺陷型酵母細(xì)胞中作為選擇標(biāo)記；（二）噬菌斑形成篩選法：含有外源基因的噬菌體載體可以形成噬菌斑，反之不能。（三）遺傳互補(bǔ)法——利用遺傳選擇標(biāo)記篩選哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)基因細(xì)胞利用表達(dá)產(chǎn)物與宿主細(xì)胞中營(yíng)養(yǎng)缺陷突變發(fā)生互補(bǔ)。（四）利用報(bào)告基因篩選植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞二、核酸分子雜交：1、原理：利用序列互補(bǔ)的單鏈DNA和RNA可利用堿基配對(duì)產(chǎn)生氫鍵而形成雜交分子的特性，檢測(cè)核酸分子中特異性序列的存在。2、類型：菌落原位雜交；DNA印跡分析；RNA印跡分析；斑點(diǎn)雜交和狹縫雜交；

三、免疫學(xué)方法用表達(dá)產(chǎn)物的抗血清或McAb進(jìn)行篩選

四、PCR技術(shù)

針對(duì)插入重組體中的目的基因，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，進(jìn)行菌落PCR，如能擴(kuò)增出條帶，則為陽(yáng)性克隆。

五、酶切鑒定

挑選單個(gè)菌落—擴(kuò)大培養(yǎng)—小量快速提取質(zhì)?！盖校ǜ鶕?jù)插入片段上的酶切位點(diǎn)選定）—分析有無(wú)插入片段、插入片段大小及數(shù)量、插入方向等。

六、序列分析－雙脫氧終止法測(cè)序（Sanger法）鏈末端終止法的原理：P3541、利用DNA聚合酶，以單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，在四組互相獨(dú)立的反應(yīng)體系中分別加入不同的雙脫氧核苷三磷酸作為鏈反應(yīng)終止劑，根據(jù)堿基配對(duì)原則，在測(cè)序引物引導(dǎo)下，合成四組有序列梯度的互補(bǔ)DNA鏈，然后通過(guò)高分辨率的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，放射自顯影檢測(cè)后識(shí)讀待測(cè)DNA序列。2、引入雙脫氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作為鏈終止劑，2ˊ,3ˊ-ddNTP與普通的dNTP不同之處在于其3ˊ位又少了個(gè)羥基。其5’Pi可以和多核苷酸鏈的3ˊ羥基形成磷酸二酯鍵，但3’不能再與下一個(gè)核苷酸縮合，結(jié)果使得多核苷酸鏈的延伸終止于ddNTP。3、如果在DNA的合成反應(yīng)中，在4種正常的dNTP之外，再加入一種少量的ddNTP，那么多核苷酸鏈的延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止展開(kāi)競(jìng)爭(zhēng)，所以反應(yīng)產(chǎn)物是一系列長(zhǎng)短不一的核苷酸鏈。4、在4組獨(dú)立的DNA合成反應(yīng)中，分別加入4種不同的ddNTP，結(jié)果將生成4組核苷酸鏈，它們將分別終止于每一個(gè)A、G、C、T的位置上。對(duì)這4組核苷酸鏈同時(shí)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列序列測(cè)定Sanger等（1977）發(fā)明的雙脫氧鏈末端終止法。

第八節(jié)克隆基因的表達(dá)一、表達(dá)系統(tǒng)分類（一）按克隆基因與受體細(xì)胞不同組合分為4類1.原核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)，例基因工程生產(chǎn)各類工具酶2.原核基因在真核細(xì)胞中表達(dá)，如β-gal在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)3.真核基因在原核細(xì)胞表達(dá)，如IL-2,INF-γ等4.真核基因在真核細(xì)胞表達(dá)，如人β-干擾素和α-干擾素在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)，α-干擾素在小鼠細(xì)胞表達(dá)（二）按受體細(xì)胞表達(dá)類型分2類1、原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（大腸桿菌、枯草桿菌等）2、真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及昆蟲(chóng)細(xì)胞）二、克隆基因在大腸桿菌中的表達(dá)（一）困難1、缺乏E.coliRNA聚合酶識(shí)別的啟動(dòng)子2、無(wú)SD序列，不能與E.coli核糖體小亞基16srRNA結(jié)合，不能翻譯3、真核基因較大，有內(nèi)含子，原核生物無(wú)剪接內(nèi)含子的功能4、

原核細(xì)胞缺乏真核細(xì)胞特有的蛋白修飾系統(tǒng)5、真核蛋白易被E.coli蛋白酶水解

6、原核細(xì)胞無(wú)法切除信號(hào)序列等結(jié)構(gòu)。

（二）構(gòu)建策略：一）目的基因