COX-2基因真核表達載體的構建及在293細胞中的表達目錄TOC\o"1-3"\h\u摘要 1Abstract 21前言 31.1環(huán)氧化酶 31.2COX-2 31.2.1COX-2的結構 31.2.2COX-2的功能 31.3COX-1 31.4COX-3 41.5本次實驗開展的目的 42COX-2基因真核表達載體的構建及鑒定 52.1細胞及質(zhì)粒 52.2試劑及耗材 52.3儀器設備 52.4主要溶液配制 52.5實驗方法 62.5.1PCR擴增目的基因COX-2 62.5.2目的基因COX-2與載體連接 62.5.3COX-2重組真核表達載體的鑒定 73COX-2基因真核表達載體在293細胞中的表達 ⑩顯色：于平皿中加入1mL顯色液，顯色液配置比例為A液：B液=1:1。將膜置于顯色液里，用ECL發(fā)光顯色儀進行拍攝并保存。4結果與結論4.1結果4.1.1PCR擴增目的基因COX-2根據(jù)設計后的上下游引物，以pUC19-COX-2質(zhì)粒為模板，利用PCR方法擴增目的基因COX-2，擴增產(chǎn)物與實際大小一致，如圖4-1：圖4-1PCR擴增產(chǎn)物圖4-1PCR擴增產(chǎn)物4.1.2COX-2基因真核表達載體的鑒定(1)重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定將提取的重組質(zhì)粒經(jīng)SgfΙ和MluΙ雙酶切后，雙酶切5min和10min效果沒有明顯差異，可以看到將目的基因COX-2和pCMV6-Entry載體分開，如圖4-2：圖4-2重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定(2)重組質(zhì)粒的PCR鑒定根據(jù)設計后的上下游引物，以提取的重組質(zhì)粒為模板，利用PCR方法擴增目的基因COX-1，擴增產(chǎn)物與實際大小一致，如圖4-3：圖4-3重組質(zhì)粒的PCR擴增產(chǎn)物4.1.3WesternBlot實驗檢測COX-2蛋白的表達分別收集轉染2天后和轉染5天后的293-F細胞培養(yǎng)基和細胞，細胞破碎提取的細胞的總蛋白，細胞培養(yǎng)基經(jīng)超濾濃縮，經(jīng)WesternBlot實驗檢測后，可看到在轉染后的293-F胞培養(yǎng)基和細胞中均有COX-2蛋白的表達，并且轉染5天后的293-F細胞培養(yǎng)基中的COX-2蛋白的表達含量比轉染2天后的多，轉染2天后的293-F細胞和轉染5天后的細胞內(nèi)的COX-2蛋白表達含量沒有明顯變化，檢測到的COX-2的蛋白質(zhì)分子量大小在70kDa左右，GAPDH的蛋白質(zhì)分子量大小在35kDa左右，與實際大小一致，如圖4-4：圖4-4WesternBlot檢測COX-2蛋白的表達4.2結論4.2.1成功構建COX-2基因真核表達載體4.2.2COX-2蛋白在293-F細胞中成功表達5討論與展望5.1討論在各種表達系統(tǒng)中，最早被采用進行研究的是原核表達系統(tǒng)，這也是目前掌握最為成熟的表達系統(tǒng)[11]。其優(yōu)點在于能夠在較短時間內(nèi)獲得基因表達產(chǎn)物，而且所需的成本相對比較低廉。但與此同時原核表達系統(tǒng)還存在許多難以克服的缺點：如通常使用的表達系統(tǒng)無法對表達時間及表達水平進行調(diào)控，有些基因的持續(xù)表達可能會對宿主細胞產(chǎn)生毒害作用，產(chǎn)物純化困難；而且原核表達系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達產(chǎn)物的生物活性較低等。為克服上述不足，許多學者將原核基因調(diào)控系統(tǒng)引入真核基因調(diào)控領域，其優(yōu)點是：真核表達系統(tǒng)具有翻譯后修飾功能，表達的蛋白更接近天然狀態(tài)，結構更完整，并有相應的生物學活性，適用于一些依賴高級結構的蛋白功能的研究[12,13]。因此構建COX-2基因真核表達載體，使用293-F細胞真核表達系統(tǒng)，是非常適合研究COX-2蛋白的功能和生物學活性的。有研究表明，在黑腹果蠅S2細胞中和鵪鶉的卵巢中表達COX-2蛋白[14]，雖然相對于人腎上皮293-F細胞而言，其繁殖速度快，容易飼養(yǎng)，但是對于表達人源性的COX-2蛋白有宿主差異性，因此不予考慮。除此之外，本研究的轉染對象是體外懸浮培養(yǎng)的293-F細胞，懸浮培養(yǎng)動物細胞以細胞增殖快、生產(chǎn)效率高等優(yōu)勢，成為動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的首選方式。293-F懸浮細胞有以下優(yōu)點：能完成翻譯后修飾、能為蛋白的功能和復合物的組裝提供輔助因子、能夠表達需要復合物折疊機制的哺乳動物蛋白[15,16,17]。懸浮細胞轉染成功后收集到的表達的COX-2蛋白相對轉染對象是貼壁細胞來說數(shù)量更多，可為大規(guī)模提取COX-2蛋白并純化COX-2蛋白提供實驗基礎。5.2展望本研究已經(jīng)成功構建出COX-2基因真核表達載體并將其通過脂質(zhì)體轉染的方法轉染入懸浮培養(yǎng)的293-F細胞并成功表達COX-2蛋白。我們可以以該實驗為基礎，進行更深一步地研究，嘗試著將COX-2基因真核表達載體整合進入293-F細胞的基因組，并通過G418藥物的篩選，篩選得到可以穩(wěn)定表達COX-2蛋白的293-F細胞克隆，也可對提取的COX-2蛋白進行純化以便對其生物學功能進行研究等。參考文獻[1]畢建斌.腎癌細胞中環(huán)氧合酶-2的表達及非甾體類抗炎藥NS398對腎癌細胞生長抑制作用的研究[D].中國醫(yī)科大學,2006.[2]潘賽英.COX-2表達與大腸癌TNM分期、分化及轉移之間的關系[D].浙江大學,2003.[3]OshimaM,DinchukJE,KargmanSL,etal.SuppressionofIntestinalPolyposisinApcΔ716KnockoutMicebyInhibitionofCyclooxygenase2(COX-2)[J].Cell,1996,87(5):803-809.[4]李俊青,孫建寧,李軍祥.環(huán)氧化酶-2及相關信號通路在慢性萎縮性胃炎中的研究進展[J].中國中西醫(yī)結合消化雜志,2013,21(8):437-441.[5]徐三男.環(huán)氧化酶-2與鼻咽癌相關性研究進展[J].臨床和實驗醫(yī)學雜志,2007,6(7):151-152.[6]黃多美,劉芳,趙霞.環(huán)氧合酶-2與子宮內(nèi)膜癌[J].醫(yī)學綜述,2007,13(3):205-207.[7]SmithFG,WadeAW,LewismL,etal.Cyclooxygenase(COX)inhibitorsandthenewbornkidney[J].Pharmaceuticals(Basel),2012,5(11):1160-1176.[8]SinghS,PandeyVP,NaazH,etal.Structuralmodelingandsimulationstudiesofhumancyclooxygenase(COX)isozymeswithselectedterpenes:implicationsindrugdesigninganddevelopment[J].ComputBiolMed,2013,43(6):744-750.[9]DaviesNM,GoodRL,RoupeKA,etal.Cyclooxygenase-3:axiom,dogma,anomaly,enigmaorspliceerror?--Notaseasyas1,2,3.[J].JournalofPharmacy&PharmaceuticalSciences,2004,7(2):217-226.[10]周肖,程愛蘭,甘潤良.COX3對腫瘤作用機制的研究進展[J].當代醫(yī)藥論叢,2012,10(2):530-530.[11]楊秋梅.多能維持因子OCT4在大腸桿菌中表達和純化的研究[D].2009.[12]陳慧.采用基于CDR3δ肽結合特性的免疫—生物化學技術策略鑒定TCRγδ所識別的新型配體-hMSH2蛋白[D].中國協(xié)和醫(yī)科大學,2008.[13]鄧長江.分泌性表達人rPA畢赤酵母菌株的構建及發(fā)酵條件的優(yōu)化[D].山東大學,2005.[14]ChangKH,ParkJH,ChungHY,etal.Enhancedexpressionofrecombinanthumancyclooxygenase1fromstably-transfectedDrosophilamelanogasterS2cellsbydimethylsulfoxideismediatedbyup-regulationofnitricoxidesynthaseandtranscriptionfactorKr-h1[J].BiotechnolLett,2012,34(7):1243-1250.[15]陳昭烈,劉紅,吳本傳,etal.HEK293F細胞的無載體固定化培養(yǎng)及重組腺病毒的高效擴增[C]//全國工業(yè)生化學術會議.2002.[16]黃永紅,成小東,孫玉坤,etal.動物細胞懸浮培養(yǎng)過程神經(jīng)網(wǎng)絡逆解耦控制[J].計算機測量與控制,2018,v.26；No.236(05):79-82+280.[17]周文泉,閔志廉,李莉,etal.影響293細胞體外生長因素初步探討[J].江蘇醫(yī)藥,2001,27(6):403-403.

致謝光陰似箭，日月如梭，時間如白駒過隙，轉眼間在學校實習的日子已然接近尾聲。在實習過程中，我經(jīng)歷了很多讓人無法忘懷的事情。在做實驗的過程中可以為取得一點小成果而歡呼雀躍，也會因實驗的失敗而垂頭喪氣，在日積月累下，我逐漸養(yǎng)成了冷靜處理事情的習慣。我很珍惜并且感激這半年來的實習經(jīng)歷，感謝王會巖老師、孟繁偉老師的諄諄教誨，他們的專業(yè)指導讓我收獲頗豐，也讓我的實驗能夠