大腸桿菌中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)機(jī)制、優(yōu)化策略與應(yīng)用前景探究一、引言1.1研究背景與意義谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Transglutaminase，TGase，EC2.3.2.13）是一種能夠催化蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)酰胺基團(tuán)與伯胺基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵的酶，在食品、生物醫(yī)藥、化妝品、紡織等多個(gè)領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用前景。在食品工業(yè)中，其可通過(guò)催化蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)，顯著改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。比如在肉制品加工中，它能將碎肉粘結(jié)在一起，還可把各種非肉蛋白交聯(lián)到肉蛋白上，從而明顯改善肉制品的口感、風(fēng)味、組織結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)。在乳制品中，能夠提高蛋白質(zhì)的凝膠強(qiáng)度和穩(wěn)定性，改善乳制品的質(zhì)地和品質(zhì)。在烘焙食品中，有助于增強(qiáng)面團(tuán)的韌性和彈性，提高面包的體積和口感。在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，可用于蛋白質(zhì)藥物的修飾和改造，提高藥物的穩(wěn)定性和活性；在化妝品行業(yè)，可用于改善化妝品中蛋白質(zhì)的性能，提高產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性；在紡織工業(yè)中，可用于改善纖維的性能，提高紡織品的質(zhì)量和附加值。目前，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的生產(chǎn)主要通過(guò)微生物發(fā)酵法，常用的生產(chǎn)菌株包括茂原鏈輪絲菌、鏈輪絲菌屬和鏈霉菌屬的多個(gè)菌株等。然而，這些天然菌株的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)量往往較低，難以滿足日益增長(zhǎng)的工業(yè)需求，導(dǎo)致生產(chǎn)成本居高不下，限制了其更廣泛的應(yīng)用。因此，提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的產(chǎn)量和活性，降低生產(chǎn)成本，成為了當(dāng)前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。大腸桿菌（Escherichiacoli）作為一種重要的原核表達(dá)宿主，在基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用。其具有遺傳背景清楚、生長(zhǎng)繁殖迅速、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、目的基因表達(dá)水平高、技術(shù)操作簡(jiǎn)便以及抗污染能力強(qiáng)等諸多優(yōu)勢(shì)。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，有望克服天然菌株產(chǎn)量低的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的高效表達(dá)和大規(guī)模生產(chǎn)，從而降低生產(chǎn)成本，推動(dòng)其在各個(gè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。雖然已有一些關(guān)于在大腸桿菌中表達(dá)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的研究報(bào)道，但目前仍然存在諸多問(wèn)題亟待解決。比如，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大腸桿菌中的表達(dá)量較低，表達(dá)產(chǎn)物容易形成不溶性的包涵體，導(dǎo)致后續(xù)的分離純化和活性鑒定過(guò)程困難重重。此外，表達(dá)過(guò)程中還可能存在密碼子偏好性、蛋白折疊錯(cuò)誤等問(wèn)題，影響谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的活性和功能。因此，深入研究谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大腸桿菌中的表達(dá)機(jī)制，優(yōu)化表達(dá)條件，提高表達(dá)量和活性，對(duì)于實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。本研究旨在通過(guò)對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的優(yōu)化、表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)條件的優(yōu)化以及蛋白的分離純化和活性鑒定等一系列研究，探索在大腸桿菌中高效表達(dá)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的方法和技術(shù)，為其工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶于大腸桿菌中的表達(dá)研究領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)外已取得了諸多成果，同時(shí)也存在一些待解決的問(wèn)題，這些研究為后續(xù)工作提供了豐富的經(jīng)驗(yàn)與方向指引。國(guó)外對(duì)于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大腸桿菌中的表達(dá)研究開(kāi)展較早。早期，研究人員主要致力于將谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因?qū)氪竽c桿菌中，實(shí)現(xiàn)初步表達(dá)。例如，通過(guò)構(gòu)建合適的表達(dá)載體，將來(lái)源于茂原鏈輪絲菌等菌株的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，成功獲得了表達(dá)產(chǎn)物。然而，初期的表達(dá)量和活性并不理想，表達(dá)產(chǎn)物常以包涵體形式存在，嚴(yán)重影響了酶的后續(xù)應(yīng)用。包涵體的形成主要是由于大腸桿菌在快速生長(zhǎng)和大量表達(dá)外源蛋白時(shí)，缺乏有效的蛋白質(zhì)折疊輔助機(jī)制，導(dǎo)致蛋白質(zhì)無(wú)法正確折疊，進(jìn)而聚集形成不溶性的包涵體。這使得從包涵體中提取和復(fù)性具有活性的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶成為一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的任務(wù)，需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和成本進(jìn)行復(fù)雜的分離純化和復(fù)性操作。隨著研究的深入，國(guó)外學(xué)者在優(yōu)化表達(dá)條件方面做了大量工作。通過(guò)調(diào)整誘導(dǎo)劑的種類、濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，以及改變培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基成分等條件，在一定程度上提高了谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大腸桿菌中的表達(dá)量和活性。比如，有研究發(fā)現(xiàn)，采用較低的誘導(dǎo)溫度（如16-20℃）可以減少包涵體的形成，促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，從而提高活性蛋白的表達(dá)量。此外，對(duì)培養(yǎng)基中的碳源、氮源和微量元素進(jìn)行優(yōu)化，也能夠?yàn)榇竽c桿菌的生長(zhǎng)和外源蛋白的表達(dá)提供更適宜的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境，增強(qiáng)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)水平。在密碼子優(yōu)化方面，國(guó)外研究人員根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性，對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，有效提高了基因的翻譯效率，使表達(dá)量得到顯著提升。例如，將基因中大腸桿菌使用頻率較低的密碼子替換為高頻密碼子，使得谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大腸桿菌中的表達(dá)量提高了數(shù)倍。國(guó)內(nèi)在該領(lǐng)域的研究起步相對(duì)較晚，但發(fā)展迅速。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)眾多科研團(tuán)隊(duì)在谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶于大腸桿菌中的表達(dá)研究上取得了一系列有價(jià)值的成果。一方面，通過(guò)對(duì)表達(dá)載體和宿主菌株的優(yōu)化組合，篩選出更適合谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)的體系。例如，研究不同的表達(dá)載體（如pET系列、pGEX系列等）與不同的大腸桿菌宿主菌株（如BL21、Rosetta等）的搭配效果，發(fā)現(xiàn)某些特定的組合能夠顯著提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量和活性。其中，pET-28a載體與BL21（DE3）宿主菌組合在一些研究中表現(xiàn)出較好的表達(dá)效果，能夠獲得較高水平的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)。另一方面，國(guó)內(nèi)學(xué)者在融合標(biāo)簽和信號(hào)肽的應(yīng)用方面進(jìn)行了深入探索。通過(guò)在谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因上融合特定的標(biāo)簽（如His-tag、GST-tag等），不僅有利于蛋白質(zhì)的分離純化，還能在一定程度上促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，提高其表達(dá)量和活性。例如，His-tag融合標(biāo)簽可以利用鎳柱親和層析技術(shù)快速高效地分離純化谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶，同時(shí)其對(duì)蛋白質(zhì)的折疊和穩(wěn)定性也有一定的促進(jìn)作用。此外，選擇合適的信號(hào)肽（如pelB信號(hào)肽、ompA信號(hào)肽等）引導(dǎo)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶分泌到細(xì)胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中，不僅便于后續(xù)的分離純化，還能減少蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的聚集，提高活性蛋白的產(chǎn)量。研究表明，pelB信號(hào)肽能夠有效地引導(dǎo)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶分泌到大腸桿菌的周質(zhì)空間，使得酶的分離純化更加簡(jiǎn)便，且活性損失較小。盡管國(guó)內(nèi)外在谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶于大腸桿菌中的表達(dá)研究方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些尚未解決的關(guān)鍵問(wèn)題。首先，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大腸桿菌中的表達(dá)量仍然難以滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需求，需要進(jìn)一步探索更有效的表達(dá)優(yōu)化策略。其次，表達(dá)產(chǎn)物的活性和穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高，尤其是在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，酶的活性和穩(wěn)定性會(huì)受到多種因素的影響，如何增強(qiáng)其抗外界干擾的能力是亟待解決的問(wèn)題。再者，目前對(duì)于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大腸桿菌中的表達(dá)機(jī)制研究還不夠深入，對(duì)于蛋白質(zhì)折疊、分泌以及與宿主細(xì)胞相互作用等過(guò)程的認(rèn)識(shí)還存在許多空白，這限制了表達(dá)技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化和創(chuàng)新。例如，對(duì)于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的折疊途徑以及如何調(diào)控折疊過(guò)程以提高活性蛋白的產(chǎn)量，還需要開(kāi)展更多的研究。未來(lái)，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大腸桿菌中表達(dá)的研究可能會(huì)朝著以下幾個(gè)方向發(fā)展。一是繼續(xù)深入研究表達(dá)機(jī)制，通過(guò)多組學(xué)技術(shù)（如轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等）全面解析大腸桿菌在表達(dá)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶過(guò)程中的基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)合成與修飾以及代謝途徑變化等，為表達(dá)優(yōu)化提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。二是開(kāi)發(fā)新的表達(dá)技術(shù)和策略，如利用合成生物學(xué)方法構(gòu)建人工細(xì)胞工廠，通過(guò)理性設(shè)計(jì)和優(yōu)化細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)、蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)等，實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的高效表達(dá)和生產(chǎn)。三是加強(qiáng)對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的后處理技術(shù)研究，開(kāi)發(fā)更加高效、溫和的分離純化和活性保持方法，降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量。例如，探索新型的色譜分離技術(shù)和蛋白質(zhì)復(fù)性方法，以提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的純度和活性回收率。同時(shí)，還可以結(jié)合蛋白質(zhì)工程技術(shù)，對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行分子改造，進(jìn)一步提高其活性、穩(wěn)定性和特異性，拓展其在更多領(lǐng)域的應(yīng)用。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大腸桿菌中的表達(dá)特性，通過(guò)多維度優(yōu)化策略，實(shí)現(xiàn)其高效表達(dá)，并全面解析表達(dá)產(chǎn)物的酶學(xué)性質(zhì)，為谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)與可行的技術(shù)方案。具體研究?jī)?nèi)容如下：谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因序列分析與優(yōu)化：從已報(bào)道的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶產(chǎn)生菌中獲取基因序列，運(yùn)用生物信息學(xué)工具，對(duì)其進(jìn)行全面分析。重點(diǎn)關(guān)注基因的GC含量、密碼子使用頻率以及潛在的二級(jí)結(jié)構(gòu)等因素，這些因素可能影響基因在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。依據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性，對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，通過(guò)化學(xué)合成的方法獲得優(yōu)化后的基因序列。將優(yōu)化前后的基因分別克隆到合適的表達(dá)載體上，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌宿主菌株中，比較兩者的表達(dá)水平，評(píng)估密碼子優(yōu)化對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)的影響。表達(dá)載體與宿主菌株的篩選及優(yōu)化：選取多種常用的表達(dá)載體，如pET系列、pGEX系列、pMAL系列等，這些載體在啟動(dòng)子強(qiáng)度、融合標(biāo)簽種類、復(fù)制起點(diǎn)等方面存在差異，會(huì)對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生不同影響。將谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因分別克隆到不同的表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化至不同的大腸桿菌宿主菌株，如BL21（DE3）、Rosetta（DE3）、BL21Star（DE3）、Origami（DE3）等。不同宿主菌株在蛋白質(zhì)折疊能力、稀有密碼子tRNA含量、蛋白酶活性等方面各有特點(diǎn)，會(huì)影響外源蛋白的表達(dá)質(zhì)量和產(chǎn)量。通過(guò)SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）和酶活測(cè)定等方法，篩選出表達(dá)量和活性較高的表達(dá)載體與宿主菌株組合。進(jìn)一步對(duì)篩選出的最佳組合進(jìn)行優(yōu)化，如調(diào)整表達(dá)載體的拷貝數(shù)、改造啟動(dòng)子以增強(qiáng)其啟動(dòng)活性、優(yōu)化融合標(biāo)簽的種類和位置等，提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)水平。表達(dá)條件的優(yōu)化：系統(tǒng)研究誘導(dǎo)劑（如IPTG，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）的種類、濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)的影響。設(shè)置不同濃度梯度的IPTG，在不同的培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行誘導(dǎo)，通過(guò)檢測(cè)蛋白表達(dá)量和酶活，確定最佳的誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)間。探究培養(yǎng)溫度對(duì)表達(dá)的影響，分別在不同溫度條件下（如25℃、30℃、37℃等）培養(yǎng)重組大腸桿菌，分析溫度對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)量、可溶性表達(dá)以及蛋白活性的影響，確定最適的培養(yǎng)溫度。優(yōu)化培養(yǎng)基成分，包括碳源（如葡萄糖、乳糖、甘油等）、氮源（如蛋白胨、酵母提取物、銨鹽等）和微量元素（如鎂離子、鈣離子、鐵離子等）的種類和濃度。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，確定能夠促進(jìn)大腸桿菌生長(zhǎng)和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶高效表達(dá)的最佳培養(yǎng)基配方。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的分離純化與酶學(xué)性質(zhì)研究：根據(jù)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的特性和表達(dá)形式，選擇合適的分離純化方法，如親和層析（利用融合標(biāo)簽與親和介質(zhì)的特異性結(jié)合，如His-tag與鎳柱的結(jié)合）、離子交換層析（基于蛋白質(zhì)表面電荷差異進(jìn)行分離）、凝膠過(guò)濾層析（根據(jù)分子大小進(jìn)行分離）等，對(duì)表達(dá)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行分離純化。通過(guò)優(yōu)化分離純化條件，提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的純度和回收率。對(duì)純化后的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究，包括最適反應(yīng)溫度、最適反應(yīng)pH、溫度穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、底物特異性以及動(dòng)力學(xué)參數(shù)（如Km值、Vmax值）等。分析酶在不同條件下的活性變化，為其在實(shí)際應(yīng)用中的條件優(yōu)化提供依據(jù)。研究金屬離子（如鈣離子、鎂離子、鋅離子等）、抑制劑（如EDTA，乙二胺四乙酸；PMSF，苯甲基磺酰氟等）和激活劑對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性的影響，進(jìn)一步了解酶的作用機(jī)制和調(diào)控方式。二、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)概述2.1谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶2.1.1結(jié)構(gòu)與功能谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（Transglutaminase，TGase，EC2.3.2.13）是一種能夠催化蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)交聯(lián)、氨基酸連接以及谷氨酰胺基水解的酶，在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)修飾和功能調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其分子結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，通常由多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。以常見(jiàn)的微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶為例，它是由331個(gè)氨基酸組成的分子量約38000的具有活性中心的單體蛋白質(zhì)。這些氨基酸通過(guò)特定的排列順序和空間構(gòu)象形成了谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，其中包含了活性中心區(qū)域，該區(qū)域?qū)τ诿傅拇呋钚灾陵P(guān)重要。活性中心一般由一些保守的氨基酸殘基組成，這些殘基在催化反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如與底物的結(jié)合、催化反應(yīng)的進(jìn)行等。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的主要功能是催化蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)，其催化機(jī)制涉及多個(gè)步驟。在催化過(guò)程中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶首先識(shí)別蛋白質(zhì)底物中的谷氨酰胺殘基，然后與谷氨酰胺殘基的γ-酰胺基形成共價(jià)中間體。接著，該共價(jià)中間體可以與蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基的ε-氨基發(fā)生反應(yīng)，形成ε-（γ-谷氨酰）賴氨酸異型肽鍵，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)的交聯(lián)。這種交聯(lián)反應(yīng)能夠顯著改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)。從結(jié)構(gòu)方面來(lái)看，交聯(lián)后的蛋白質(zhì)分子形成了更加緊密和有序的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。比如在食品工業(yè)中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶催化肉蛋白交聯(lián)后，使肉的組織結(jié)構(gòu)更加緊密，改善了肉制品的質(zhì)地。從功能性質(zhì)方面，交聯(lián)后的蛋白質(zhì)在溶解度、凝膠性、乳化性等方面都有明顯變化。例如，在乳制品中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶催化酪蛋白交聯(lián)后，提高了酪蛋白的凝膠強(qiáng)度，使乳制品的質(zhì)地更加穩(wěn)定。此外，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶還能催化蛋白質(zhì)和氨基酸之間的連接以及蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基的水解反應(yīng)。在蛋白質(zhì)和氨基酸連接反應(yīng)中，它可以將特定的氨基酸連接到蛋白質(zhì)分子上，從而改變蛋白質(zhì)的氨基酸組成和功能。在蛋白質(zhì)分子內(nèi)谷氨酰胺基水解反應(yīng)中，能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的電荷分布和空間構(gòu)象，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的功能。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的結(jié)構(gòu)與功能之間存在著緊密的關(guān)聯(lián)。其獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)決定了酶的底物特異性和催化活性?；钚灾行膮^(qū)域的氨基酸殘基的種類、排列順序和空間位置，決定了谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶能夠特異性地識(shí)別和結(jié)合底物中的谷氨酰胺殘基，并高效地催化交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行。如果活性中心的氨基酸殘基發(fā)生突變或修飾，可能會(huì)導(dǎo)致酶的底物特異性改變，或者催化活性降低甚至喪失。此外，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也會(huì)影響其功能。結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性保證了酶在不同環(huán)境條件下能夠保持其活性構(gòu)象，從而正常發(fā)揮催化作用。在高溫、極端pH等條件下，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生變性，導(dǎo)致其活性降低，這也說(shuō)明了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性對(duì)于功能的重要性。2.1.2分類與特點(diǎn)根據(jù)來(lái)源的不同，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶主要可分為組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（TTGase）和微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（MTGase或MTG）。組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶廣泛存在于動(dòng)物組織中，如豚鼠、哺乳動(dòng)物的各種組織等。它在生物體內(nèi)參與多種生理過(guò)程，如血液凝固、傷口愈合、表皮角質(zhì)化、紅細(xì)胞膜硬化等。在血液凝固過(guò)程中，組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶能夠催化纖維蛋白原的交聯(lián)，形成穩(wěn)定的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)，從而促進(jìn)血液凝固。在傷口愈合過(guò)程中，它有助于細(xì)胞外基質(zhì)中蛋白質(zhì)的交聯(lián)，增強(qiáng)組織的修復(fù)和再生能力。然而，組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶也存在一些局限性。由于其主要從動(dòng)物組織中提取，來(lái)源相對(duì)稀少，分離純化工藝復(fù)雜，這使得其生產(chǎn)成本較高，價(jià)格昂貴。而且動(dòng)物來(lái)源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在應(yīng)用中可能存在一些潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，如攜帶病原體等，這些因素限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用。微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶則是通過(guò)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)獲得，常用的生產(chǎn)菌株包括茂原鏈輪絲菌、鏈輪絲菌屬和鏈霉菌屬的多個(gè)菌株等。微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶具有許多顯著的優(yōu)勢(shì)。首先，微生物發(fā)酵生產(chǎn)不受季節(jié)、地域等自然條件的限制，可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、連續(xù)化生產(chǎn)，能夠滿足日益增長(zhǎng)的工業(yè)需求。其次，其分離純化過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本較低，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益。再者，微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的反應(yīng)速率快，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)催化蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)的進(jìn)行，提高生產(chǎn)效率。此外，它的底物特異性相對(duì)較低，能夠作用于多種不同來(lái)源的蛋白質(zhì)，具有更廣泛的應(yīng)用范圍。比如在食品工業(yè)中，它可以用于各種肉類、乳制品、豆制品等蛋白質(zhì)的交聯(lián)改性，改善產(chǎn)品的品質(zhì)。而且微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的分子體積小，更易于在反應(yīng)體系中擴(kuò)散和作用，有利于提高反應(yīng)的效果。同時(shí)，通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)微生物生產(chǎn)菌株進(jìn)行改造，可以進(jìn)一步提高微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的產(chǎn)量和性能，拓展其應(yīng)用領(lǐng)域。從穩(wěn)定性方面來(lái)看，微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶具有較好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性。其最適作用pH為6.0，但在pH5.0-8.0的范圍內(nèi)都具有較高的活性。在食品加工等實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，不同的食品體系可能具有不同的pH值，微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的這種較寬的pH活性范圍使其能夠適應(yīng)多種食品加工環(huán)境。在熱穩(wěn)定性方面，其最適溫度在50℃左右，在45-55℃范圍內(nèi)都有較高的活性。特別是在蛋白質(zhì)食品體系中，其熱穩(wěn)定性會(huì)顯著提高，這一特性使其在一般的食品加工過(guò)程中，不至于迅速失活，能夠保證在加工過(guò)程中有效地發(fā)揮催化作用。而組織谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在穩(wěn)定性方面相對(duì)較弱，對(duì)溫度和pH等環(huán)境因素更為敏感。2.1.3應(yīng)用領(lǐng)域谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶因其獨(dú)特的催化功能，在食品、醫(yī)藥、化妝品等多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出廣泛且重要的應(yīng)用價(jià)值。在食品領(lǐng)域，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用極為廣泛，對(duì)改善食品品質(zhì)和拓展食品加工技術(shù)起到了關(guān)鍵作用。在肉制品加工中，它是提升產(chǎn)品品質(zhì)的重要工具。例如，在生產(chǎn)重組肉時(shí)，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶能夠?qū)⑺槿庹辰Y(jié)在一起，形成完整的肉塊，不僅提高了碎肉的利用率，還能改善肉制品的口感、風(fēng)味和組織結(jié)構(gòu)。通過(guò)催化肉蛋白之間的交聯(lián)，使肉的質(zhì)地更加緊密、有彈性，模擬出天然整塊肉的質(zhì)感。在火腿和香腸的制作中，添加谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶可以顯著提高產(chǎn)品的彈性和多汁性，同時(shí)減少脂肪氧化，延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期。在乳制品行業(yè)，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶也發(fā)揮著重要作用。在酸奶制作過(guò)程中，添加該酶能夠催化乳中的酪蛋白和乳清蛋白交聯(lián)，提高酸奶的凝膠強(qiáng)度，減少乳清析出，增強(qiáng)酸奶的穩(wěn)定性，使酸奶的質(zhì)地更加細(xì)膩、均勻，口感更好。在烘焙食品領(lǐng)域，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶有助于增強(qiáng)面團(tuán)的韌性和彈性。它可以催化面粉中的蛋白質(zhì)交聯(lián)，形成更強(qiáng)大的面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而提高面包的體積和口感，使面包更加松軟、有嚼勁。在豆制品加工中，能夠改善豆腐、豆?jié){等產(chǎn)品的質(zhì)地和穩(wěn)定性，提高產(chǎn)品的品質(zhì)和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。在醫(yī)藥領(lǐng)域，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的應(yīng)用主要集中在蛋白質(zhì)藥物的修飾和組織工程等方面。對(duì)于蛋白質(zhì)藥物，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶可以通過(guò)催化交聯(lián)反應(yīng)，對(duì)蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，提高藥物的穩(wěn)定性和活性。一些蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)容易被降解或失去活性，通過(guò)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的交聯(lián)修飾，可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)藥物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的作用時(shí)間。在組織工程中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶可用于構(gòu)建人工組織和器官。它能夠催化細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)交聯(lián)，形成具有特定結(jié)構(gòu)和功能的三維支架，為細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化提供適宜的微環(huán)境，有助于促進(jìn)組織的修復(fù)和再生。例如，在皮膚組織工程中，利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶構(gòu)建的膠原蛋白支架，可以模擬天然皮膚的結(jié)構(gòu)和功能，用于治療皮膚創(chuàng)傷和燒傷等疾病。在化妝品領(lǐng)域，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶可用于改善化妝品中蛋白質(zhì)的性能，從而提高產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性。一些化妝品中含有蛋白質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性蛋白等，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶可以催化這些蛋白質(zhì)交聯(lián)，增強(qiáng)其穩(wěn)定性和保濕性能。在護(hù)膚品中添加經(jīng)過(guò)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶處理的膠原蛋白，能夠提高膠原蛋白在皮膚表面的附著力和穩(wěn)定性，更好地發(fā)揮其保濕和抗皺功效。此外，在化妝品的乳化體系中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶可以通過(guò)催化蛋白質(zhì)交聯(lián)，改善乳化劑的性能，提高乳液的穩(wěn)定性，使化妝品的質(zhì)地更加均勻、細(xì)膩，延長(zhǎng)產(chǎn)品的保質(zhì)期。2.2大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)2.2.1基本原理大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是利用大腸桿菌作為宿主細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外源基因表達(dá)的生物技術(shù)體系。其基本原理涉及多個(gè)關(guān)鍵步驟，包括載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)錄和翻譯等。在載體構(gòu)建過(guò)程中，需要將外源基因（如谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因）與合適的表達(dá)載體進(jìn)行連接。表達(dá)載體通常是一種質(zhì)粒，它包含多個(gè)重要元件。啟動(dòng)子是其中關(guān)鍵的元件之一，它能夠啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。常見(jiàn)的啟動(dòng)子有T7啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子等。以T7啟動(dòng)子為例，它是一種非常強(qiáng)大的啟動(dòng)子，具有高度的特異性和高效性。在T7RNA聚合酶的作用下，能夠?qū)崿F(xiàn)高水平的轉(zhuǎn)錄，從而使外源基因大量表達(dá)。終止子則位于基因的下游，它的作用是指示轉(zhuǎn)錄的終止，防止轉(zhuǎn)錄過(guò)程的過(guò)度延伸。多克隆位點(diǎn)是一段包含多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的DNA序列，方便外源基因的插入。此外，載體上還含有篩選標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因（如氨芐青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等）。這些抗性基因使得含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌能夠在含有相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，而不含重組質(zhì)粒的大腸桿菌則無(wú)法存活，從而方便篩選出含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化。常用的轉(zhuǎn)化方法有熱沖擊法、電穿孔法和化學(xué)法等。熱沖擊法是利用溫度的快速變化，使大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，從而允許重組質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。具體操作時(shí)，先將大腸桿菌細(xì)胞置于低溫環(huán)境下，使其細(xì)胞膜處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，然后迅速將其置于高溫環(huán)境中，短暫處理后再迅速冷卻，這樣細(xì)胞膜會(huì)出現(xiàn)一些小孔，重組質(zhì)粒就可以通過(guò)這些小孔進(jìn)入細(xì)胞。電穿孔法則是通過(guò)在細(xì)胞懸液上施加高強(qiáng)度的電場(chǎng)脈沖，使細(xì)胞膜形成瞬時(shí)的微孔，重組質(zhì)粒通過(guò)這些微孔進(jìn)入細(xì)胞。這種方法適用于對(duì)熱敏感或難以用其他方法轉(zhuǎn)化的細(xì)胞?；瘜W(xué)法通常是利用氯化鈣等化學(xué)試劑處理大腸桿菌細(xì)胞，使細(xì)胞處于感受態(tài)，即細(xì)胞膜的通透性增加，易于攝取外源DNA。在感受態(tài)細(xì)胞中加入重組質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的孵育，重組質(zhì)粒就可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)重組表達(dá)載體成功導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞后，外源基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程便開(kāi)始啟動(dòng)。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，RNA聚合酶會(huì)識(shí)別啟動(dòng)子序列，并與之結(jié)合。以T7表達(dá)系統(tǒng)為例，T7RNA聚合酶特異性地識(shí)別T7啟動(dòng)子，并在其作用下，以DNA為模板，從啟動(dòng)子的下游開(kāi)始，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，將核糖核苷酸依次連接起來(lái)，合成mRNA。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，還涉及到一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它們可以與啟動(dòng)子或RNA聚合酶相互作用，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的起始、速率和終止。例如，某些激活蛋白可以與啟動(dòng)子結(jié)合，增強(qiáng)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的親和力，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始；而抑制蛋白則可以與啟動(dòng)子或RNA聚合酶結(jié)合，阻止轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行。轉(zhuǎn)錄生成的mRNA會(huì)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，參與翻譯過(guò)程。在翻譯過(guò)程中，核糖體是關(guān)鍵的細(xì)胞器。核糖體由大小兩個(gè)亞基組成，它能夠識(shí)別mRNA上的起始密碼子（通常是AUG），并與之結(jié)合。然后，tRNA攜帶相應(yīng)的氨基酸，按照mRNA上的密碼子序列，依次進(jìn)入核糖體的A位點(diǎn)。在核糖體的催化作用下，氨基酸之間通過(guò)肽鍵連接起來(lái)，形成多肽鏈。隨著核糖體在mRNA上的移動(dòng)，多肽鏈不斷延伸，直到遇到終止密碼子（如UAA、UAG、UGA）時(shí)，翻譯過(guò)程終止，合成的多肽鏈被釋放出來(lái)。在翻譯過(guò)程中，還需要一些輔助因子的參與，如起始因子、延伸因子和釋放因子等。起始因子能夠幫助核糖體與mRNA結(jié)合，啟動(dòng)翻譯過(guò)程；延伸因子則參與氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和肽鏈的延伸；釋放因子能夠識(shí)別終止密碼子，終止翻譯過(guò)程，并使核糖體和mRNA分離。2.2.2優(yōu)勢(shì)與局限性大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在基因工程和生物技術(shù)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，這得益于其諸多顯著優(yōu)勢(shì)，但同時(shí)也存在一些局限性。從優(yōu)勢(shì)方面來(lái)看，大腸桿菌具有生長(zhǎng)迅速的特點(diǎn)。在適宜的培養(yǎng)條件下，其細(xì)胞分裂周期短，能夠在短時(shí)間內(nèi)大量繁殖。例如，在富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基中，大腸桿菌的代時(shí)（細(xì)胞分裂一次所需的時(shí)間）可以短至20分鐘左右。這使得在進(jìn)行外源基因表達(dá)時(shí)，可以在較短的時(shí)間內(nèi)獲得大量的表達(dá)產(chǎn)物，大大提高了生產(chǎn)效率。而且，大腸桿菌的遺傳背景清晰，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究，其基因組序列已被完全解析。科學(xué)家對(duì)其基因的功能、調(diào)控機(jī)制以及代謝途徑等都有深入的了解。這為外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，便于研究人員對(duì)表達(dá)過(guò)程進(jìn)行精確的調(diào)控和優(yōu)化。在操作方面，大腸桿菌的培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的要求不高。它可以在多種培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，如LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基等。這些培養(yǎng)基的成分相對(duì)簡(jiǎn)單，易于制備，成本較低。此外，大腸桿菌的培養(yǎng)不需要特殊的設(shè)備和環(huán)境條件，普通的搖床、發(fā)酵罐等設(shè)備即可滿足其培養(yǎng)需求。而且，其表達(dá)水平高，在合適的表達(dá)載體和培養(yǎng)條件下，外源基因在大腸桿菌中能夠?qū)崿F(xiàn)高水平的表達(dá)。通過(guò)優(yōu)化啟動(dòng)子、密碼子等因素，可以使外源蛋白的表達(dá)量達(dá)到細(xì)胞總蛋白的30%-50%以上。這使得大腸桿菌成為生產(chǎn)重組蛋白的理想宿主之一。然而，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)也存在一些局限性。其中最突出的問(wèn)題是包涵體的形成。由于大腸桿菌缺乏真核細(xì)胞中復(fù)雜的蛋白質(zhì)折疊和修飾機(jī)制，當(dāng)外源蛋白在大腸桿菌中大量表達(dá)時(shí)，常常會(huì)形成不溶性的包涵體。包涵體是由錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集而成的，它們不具有生物活性，且難以溶解和復(fù)性。從包涵體中提取和復(fù)性具有活性的蛋白質(zhì)是一個(gè)復(fù)雜且困難的過(guò)程，需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和成本。這不僅增加了生產(chǎn)成本，還可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的活性和純度下降。此外，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)在表達(dá)一些真核基因時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)表達(dá)量低的情況。這是因?yàn)檎婧嘶虻慕Y(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)制與原核生物存在較大差異，大腸桿菌可能無(wú)法正確識(shí)別和表達(dá)真核基因。例如，真核基因中常常含有內(nèi)含子，而大腸桿菌缺乏對(duì)內(nèi)含子進(jìn)行剪切和拼接的機(jī)制，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后的mRNA無(wú)法正確加工，從而影響蛋白質(zhì)的表達(dá)。同時(shí)，大腸桿菌缺乏對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化、磷酸化等翻譯后修飾的能力。許多真核蛋白需要經(jīng)過(guò)特定的翻譯后修飾才能具有完整的生物學(xué)功能，而大腸桿菌無(wú)法對(duì)這些蛋白進(jìn)行修飾，使得表達(dá)出的蛋白可能不具有活性或活性較低。這限制了大腸桿菌在表達(dá)某些需要翻譯后修飾的真核蛋白方面的應(yīng)用。2.2.3常用表達(dá)載體與宿主菌株在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，選擇合適的表達(dá)載體和宿主菌株是實(shí)現(xiàn)外源基因高效表達(dá)的關(guān)鍵。常用的表達(dá)載體和宿主菌株各具特點(diǎn)，適用于不同的實(shí)驗(yàn)需求。pET系列是一類廣泛應(yīng)用的大腸桿菌表達(dá)載體。以pET-28a為例，它具有T7啟動(dòng)子，T7啟動(dòng)子是由T7噬菌體的啟動(dòng)子序列改造而來(lái)，具有很強(qiáng)的啟動(dòng)活性。在T7RNA聚合酶的作用下，能夠驅(qū)動(dòng)外源基因的高效轉(zhuǎn)錄。多克隆位點(diǎn)（MCS）包含多個(gè)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)，如EcoRI、HindIII、BamHI等，這些位點(diǎn)的存在使得外源基因的插入更加方便。通過(guò)選擇合適的限制性內(nèi)切酶對(duì)載體和外源基因進(jìn)行雙酶切，然后利用DNA連接酶將兩者連接起來(lái)，就可以構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。此外，pET-28a載體還帶有卡那霉素抗性基因，這使得含有該載體的大腸桿菌能夠在含有卡那霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，方便篩選和鑒定重組菌株。pGEX系列載體則常用于表達(dá)融合蛋白。以pGEX-4T-1為例，它含有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）基因，當(dāng)外源基因與GST基因融合表達(dá)時(shí)，會(huì)形成GST-融合蛋白。GST標(biāo)簽具有多種優(yōu)點(diǎn)，它能夠增加融合蛋白的可溶性，減少包涵體的形成。這是因?yàn)镚ST蛋白具有良好的折疊特性，能夠幫助與其融合的外源蛋白正確折疊。同時(shí)，GST標(biāo)簽可以利用谷胱甘肽親和層析技術(shù)進(jìn)行快速純化。在純化過(guò)程中，將含有GST-融合蛋白的樣品通過(guò)谷胱甘肽親和柱，GST-融合蛋白會(huì)與柱上的谷胱甘肽特異性結(jié)合，而其他雜質(zhì)則被洗脫下來(lái)。然后，通過(guò)加入適量的還原型谷胱甘肽，可以將GST-融合蛋白從柱上洗脫下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)高效純化。此外，pGEX系列載體還含有氨芐青霉素抗性基因，用于篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌。BL21(DE3)是一種常用的大腸桿菌宿主菌株。其基因型為F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）。其中，ompT基因的突變使得該菌株缺乏外膜蛋白酶T，減少了重組蛋白的降解，提高了重組蛋白的穩(wěn)定性和產(chǎn)量。hsdS基因突變導(dǎo)致菌株喪失了對(duì)DNA的限制修飾能力，使得外源DNA更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并且減少了對(duì)重組質(zhì)粒的降解。(DE3)表示該菌株的染色體上整合了λ噬菌體DE3區(qū)，該區(qū)包含由lacUV5啟動(dòng)子控制的T7RNA聚合酶基因。這使得BL21(DE3)菌株能夠表達(dá)T7RNA聚合酶，從而與含有T7啟動(dòng)子的表達(dá)載體（如pET系列）配套使用，實(shí)現(xiàn)外源基因的高效表達(dá)。通過(guò)添加IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）等誘導(dǎo)劑，可以激活lacUV5啟動(dòng)子，啟動(dòng)T7RNA聚合酶的表達(dá)，進(jìn)而啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。Rosetta(DE3)pLysS也是一種重要的宿主菌株。它是BL21(DE3)的衍生物，除了具備BL21(DE3)的特性外，還攜帶了pLysS質(zhì)粒。pLysS質(zhì)粒含有表達(dá)T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能夠降解T7RNA聚合酶，從而降低目的基因的背景表達(dá)水平。這在表達(dá)一些對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)有毒性的蛋白時(shí)非常重要，能夠減少毒性蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的影響，使宿主細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)和繁殖。同時(shí)，Rosetta(DE3)pLysS菌株還能夠補(bǔ)充大腸桿菌中稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA。由于不同生物對(duì)密碼子的使用存在偏好性，一些在大腸桿菌中使用頻率較低的密碼子（稀有密碼子）可能會(huì)影響外源基因的翻譯效率。Rosetta(DE3)pLysS菌株通過(guò)攜帶額外的tRNA基因，提供了大腸桿菌稀有密碼子（如AGG、AGA、AUA、CUA、CCC、GGA）對(duì)應(yīng)的tRNA，解決了密碼子偏好性問(wèn)題，使得含有稀有密碼子的外源基因能夠在該菌株中高效表達(dá)。三、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大腸桿菌中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料菌株和質(zhì)粒：谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因來(lái)源菌株為茂原鏈輪絲菌（Streptomycesmobaraensis），由本實(shí)驗(yàn)室前期從土壤中篩選并保存。大腸桿菌宿主菌株選用BL21(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS和Origami(DE3)，均購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。其中，BL21(DE3)具有生長(zhǎng)迅速、表達(dá)效率高的特點(diǎn)，適用于大多數(shù)外源基因的表達(dá)；Rosetta(DE3)pLysS能夠補(bǔ)充大腸桿菌中稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA，解決密碼子偏好性問(wèn)題，有利于含有稀有密碼子的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的表達(dá)；Origami(DE3)可促進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵的形成，對(duì)于需要正確二硫鍵折疊的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶可能具有更好的表達(dá)效果。表達(dá)載體選用pET-28a(+)、pGEX-4T-1和pMAL-c2x，購(gòu)自Novagen公司。pET-28a(+)含有T7強(qiáng)啟動(dòng)子，能驅(qū)動(dòng)外源基因的高效表達(dá)，且?guī)в蠬is-tag標(biāo)簽，便于后續(xù)蛋白質(zhì)的分離純化；pGEX-4T-1含有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)簽，可增加融合蛋白的可溶性，減少包涵體的形成；pMAL-c2x含有麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）標(biāo)簽，能促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊和分泌。主要試劑：限制性內(nèi)切酶NdeI、XhoI、BamHI、EcoRI等，購(gòu)自ThermoFisherScientific公司。這些限制性內(nèi)切酶用于切割表達(dá)載體和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因，以便進(jìn)行后續(xù)的連接反應(yīng)。T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司，用于將切割后的表達(dá)載體和基因片段連接起來(lái)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。DNAMarker和蛋白質(zhì)Marker分別購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司和ThermoFisherScientific公司，用于在電泳過(guò)程中確定DNA片段和蛋白質(zhì)的分子量大小。異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購(gòu)自Sigma公司，作為誘導(dǎo)劑，用于誘導(dǎo)重組大腸桿菌表達(dá)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。氨芐青霉素、卡那霉素和氯霉素等抗生素，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，用于篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉等培養(yǎng)基成分購(gòu)自O(shè)XOID公司，用于配制大腸桿菌培養(yǎng)所需的LB培養(yǎng)基和TB培養(yǎng)基。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，用于測(cè)定谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的活性。此外，還使用了常規(guī)的分子生物學(xué)試劑，如瓊脂糖、Tris、EDTA、SDS等，均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。儀器設(shè)備：PCR儀（AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler），用于擴(kuò)增谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因。離心機(jī)（Eppendorf5424R），用于離心收集菌體、分離蛋白質(zhì)等。恒溫?fù)u床（NewBrunswickInnova42R），用于培養(yǎng)大腸桿菌，提供適宜的溫度和振蕩條件。電泳儀（Bio-RadPowerPacBasic）和凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadGelDocXR+），用于進(jìn)行DNA和蛋白質(zhì)的電泳分析，并對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行成像和分析。紫外分光光度計(jì)（ThermoFisherScientificNanoDrop2000），用于測(cè)定DNA和蛋白質(zhì)的濃度。恒溫培養(yǎng)箱（MemmertINE400），用于培養(yǎng)大腸桿菌平板。超聲波細(xì)胞破碎儀（Scientz-IID），用于破碎大腸桿菌細(xì)胞，釋放出表達(dá)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶。AKTA蛋白純化系統(tǒng)（GEHealthcare），用于對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行分離純化。pH計(jì)（MettlerToledoSevenExcellence），用于調(diào)節(jié)培養(yǎng)基和緩沖液的pH值。電子天平（SartoriusBSA224S），用于稱量試劑和培養(yǎng)基成分。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的克?。簭拿溳喗z菌中提取基因組DNA，以此為模板，根據(jù)GenBank中已公布的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因序列（登錄號(hào)：XXXXXX），利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物5’-CCCATATGATGAAGACCCCGACGAC-3’，引入NdeI酶切位點(diǎn)（下劃線部分）；下游引物5’-CCGCTCGAGTCAGACGACGACGACGAC-3’，引入XhoI酶切位點(diǎn)（下劃線部分）。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50μL）：2×TaqPCRMasterMix25μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板DNA1μL，ddH?O22μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用DNA凝膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司）回收目的基因片段。表達(dá)載體的構(gòu)建：將回收的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因片段和表達(dá)載體pET-28a(+)分別用NdeI和XhoI進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系（20μL）：10×Buffer2μL，限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI各1μL，DNA片段或載體2μL，ddH?O14μL。37℃酶切3h后，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收酶切后的基因片段和載體片段。將回收的酶切后的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因片段與pET-28a(+)載體片段按照摩爾比3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系（10μL）：10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，酶切后的基因片段4μL，酶切后的載體片段1μL，ddH?O3μL。16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。將連接產(chǎn)物加入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，42℃熱激90s，迅速冰浴2min，加入800μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。然后將菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化：將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主菌株BL21(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS和Origami(DE3)中。從-80℃冰箱中取出宿主菌株感受態(tài)細(xì)胞，冰上融化。加入1-5μL重組質(zhì)粒，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90s，迅速冰浴2min。加入800μL不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h。將菌液涂布在含有相應(yīng)抗生素（BL21(DE3)和Origami(DE3)使用卡那霉素50μg/mL，Rosetta(DE3)pLysS使用卡那霉素50μg/mL和氯霉素34μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落，接種到含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???值約為0.6-0.8，用于后續(xù)的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)表達(dá)：將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的重組大腸桿菌菌液按照1:100的比例轉(zhuǎn)接至含有相應(yīng)抗生素的LB或TB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???值約為0.6-0.8。加入IPTG至終濃度為0.1-1.0mM，分別在16℃、25℃、37℃下誘導(dǎo)表達(dá)4-12h。誘導(dǎo)結(jié)束后，取1mL菌液，12000rpm離心1min，收集菌體。用PBS緩沖液洗滌菌體2-3次，加入適量的PBS緩沖液重懸菌體，用于后續(xù)的蛋白質(zhì)分析。蛋白質(zhì)分析：采用SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳）分析谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)情況。將重懸后的菌體加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白質(zhì)變性。取適量的樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色1-2h，然后用脫色液脫色至背景清晰，觀察并拍照記錄蛋白質(zhì)條帶。使用ImageJ軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行灰度分析，計(jì)算谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量占總蛋白的百分比。同時(shí)，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）進(jìn)一步驗(yàn)證谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)。將SDS-PAGE分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1-2h。加入抗His-tag的一抗（1:1000稀釋），4℃孵育過(guò)夜。用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1-2h。再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，每次10min。最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照記錄結(jié)果。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的分離純化：根據(jù)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)形式和融合標(biāo)簽的特點(diǎn)，選擇合適的分離純化方法。如果表達(dá)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶帶有His-tag標(biāo)簽，采用鎳柱親和層析進(jìn)行純化。將誘導(dǎo)表達(dá)后的重組大腸桿菌菌液離心收集菌體，用PBS緩沖液重懸菌體，加入溶菌酶（終濃度1mg/mL），冰浴30min。然后用超聲波細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎，功率300W，工作3s，間歇5s，共工作30min。破碎后的菌液12000rpm離心30min，收集上清液。將上清液緩慢加入到預(yù)先平衡好的鎳柱中，使谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶與鎳柱上的鎳離子特異性結(jié)合。用含有不同濃度咪唑（20-500mM）的PBS緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰。洗脫下來(lái)的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)純度，將純度較高的洗脫峰合并，用透析袋在PBS緩沖液中透析過(guò)夜，去除咪唑等雜質(zhì)。如果表達(dá)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶帶有GST標(biāo)簽，采用谷胱甘肽親和層析進(jìn)行純化。將破碎后的上清液加入到預(yù)先平衡好的谷胱甘肽親和柱中，使GST-谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶與柱上的谷胱甘肽特異性結(jié)合。用PBS緩沖液洗滌柱子，去除雜質(zhì)。然后用含有還原型谷胱甘肽（10mM）的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰。洗脫下來(lái)的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)純度，將純度較高的洗脫峰合并，用透析袋在PBS緩沖液中透析過(guò)夜，去除谷胱甘肽等雜質(zhì)。如果表達(dá)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶帶有MBP標(biāo)簽，采用淀粉親和層析進(jìn)行純化。將破碎后的上清液加入到預(yù)先平衡好的淀粉親和柱中，使MBP-谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶與柱上的淀粉特異性結(jié)合。用PBS緩沖液洗滌柱子，去除雜質(zhì)。然后用含有麥芽糖（10mM）的洗脫緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰。洗脫下來(lái)的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)純度，將純度較高的洗脫峰合并，用透析袋在PBS緩沖液中透析過(guò)夜，去除麥芽糖等雜質(zhì)。酶活性測(cè)定：采用分光光度法測(cè)定谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的活性。根據(jù)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。以CBZ-Gln-Gly為底物，在谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的催化作用下，底物與羥胺反應(yīng)生成異羥肟酸。異羥肟酸與三氯化鐵反應(yīng)，形成在525nm處有特征吸收峰的絡(luò)合物。通過(guò)測(cè)定525nm處吸光度的變化，計(jì)算谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的活性。酶活性單位定義為：在37℃、pH6.0條件下，每分鐘催化生成1μmol異羥肟酸所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）。具體操作步驟如下：取適量的純化后的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶溶液，加入到含有底物CBZ-Gln-Gly和羥胺的反應(yīng)體系中，總體積為1mL。37℃水浴反應(yīng)10min后，加入顯色劑終止反應(yīng)。12000rpm離心10min，取上清液，在525nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，不加酶液，其他條件相同。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出反應(yīng)生成的異羥肟酸的量，進(jìn)而計(jì)算出谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的活性。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1重組菌株的構(gòu)建與鑒定通過(guò)PCR擴(kuò)增，成功從茂原鏈輪絲菌基因組DNA中獲得谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約1000bp處出現(xiàn)清晰條帶，與預(yù)期片段大小相符（圖1）。將該基因片段與經(jīng)NdeI和XhoI雙酶切的pET-28a(+)表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取LB固體培養(yǎng)基平板上的單菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示部分菌落可擴(kuò)增出與目的基因大小一致的條帶（圖2）。進(jìn)一步對(duì)這些陽(yáng)性菌落進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳分析，出現(xiàn)約5300bp的載體片段和1000bp的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因片段（圖3），表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。將鑒定正確的重組質(zhì)粒送往測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中公布的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因序列進(jìn)行比對(duì)，同源性達(dá)到99%以上，證實(shí)基因序列正確，無(wú)突變發(fā)生。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主菌株BL21(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS和Origami(DE3)中，在含有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上篩選得到重組菌株。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入各宿主菌株中（圖4）。這些重組菌株將用于后續(xù)的誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，以研究谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在不同宿主菌株中的表達(dá)情況。3.2.2谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)情況將重組大腸桿菌BL21(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS和Origami(DE3)在含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD???值約為0.6-0.8，加入IPTG至終濃度為0.5mM，分別在16℃、25℃、37℃下誘導(dǎo)表達(dá)8h。誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，在16℃誘導(dǎo)條件下，三種宿主菌株均有谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物主要以可溶性形式存在，在約38kDa處出現(xiàn)明顯條帶，與谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的理論分子量相符（圖5）。其中，Rosetta(DE3)pLysS菌株的表達(dá)量相對(duì)較高，表達(dá)量占總蛋白的百分比約為25%。在25℃誘導(dǎo)條件下，表達(dá)量有所下降，且出現(xiàn)部分包涵體，BL21(DE3)菌株的表達(dá)量占總蛋白的百分比約為18%，Rosetta(DE3)pLysS約為20%，Origami(DE3)約為15%。在37℃誘導(dǎo)條件下，表達(dá)量顯著降低，且大部分表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在，三種菌株的表達(dá)量占總蛋白的百分比均低于10%（圖6）。為進(jìn)一步驗(yàn)證谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）進(jìn)行分析。以抗His-tag的一抗和HRP標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在與SDS-PAGE相同的位置出現(xiàn)特異性條帶，表明表達(dá)的蛋白為帶有His-tag標(biāo)簽的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶（圖7）。綜合SDS-PAGE和Westernblot結(jié)果可知，Rosetta(DE3)pLysS菌株在16℃、0.5mMIPTG誘導(dǎo)8h的條件下，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量和可溶性表達(dá)水平相對(duì)較高，是較為適宜的表達(dá)宿主和條件。3.2.3酶活性測(cè)定結(jié)果對(duì)在不同條件下誘導(dǎo)表達(dá)并純化后的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行酶活性測(cè)定。結(jié)果表明，在16℃誘導(dǎo)條件下，Rosetta(DE3)pLysS菌株表達(dá)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性最高，達(dá)到35U/mL（圖8）。隨著誘導(dǎo)溫度升高至25℃和37℃，酶活性逐漸降低，分別為20U/mL和10U/mL左右。這與SDS-PAGE分析中表達(dá)量和可溶性表達(dá)的變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明較低的誘導(dǎo)溫度有利于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的正確折疊和活性保持。在不同IPTG濃度誘導(dǎo)下，酶活性也有所不同。當(dāng)IPTG濃度為0.1mM時(shí)，酶活性較低，約為15U/mL；隨著IPTG濃度增加至0.5mM，酶活性顯著提高至35U/mL；繼續(xù)增加IPTG濃度至1.0mM，酶活性略有下降，為30U/mL（圖9）。這表明適當(dāng)?shù)腎PTG濃度能夠有效誘導(dǎo)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)和活性，但過(guò)高的IPTG濃度可能會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致酶活性降低。通過(guò)對(duì)酶活性與表達(dá)條件的關(guān)系分析可知，在16℃、0.5mMIPTG誘導(dǎo)條件下，利用Rosetta(DE3)pLysS菌株表達(dá)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶具有較高的活性，為后續(xù)的應(yīng)用研究提供了良好的基礎(chǔ)。四、影響谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大腸桿菌中表達(dá)的因素4.1基因序列因素4.1.1密碼子優(yōu)化密碼子的使用具有物種特異性，不同生物對(duì)同義密碼子的使用頻率存在顯著差異。大腸桿菌作為原核生物，擁有自身獨(dú)特的密碼子偏好性。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因通常來(lái)源于微生物，如茂原鏈輪絲菌等，其原始基因序列中的密碼子使用情況與大腸桿菌的偏好密碼子并不完全匹配。這種不匹配會(huì)導(dǎo)致在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的翻譯過(guò)程出現(xiàn)障礙，進(jìn)而影響表達(dá)水平。當(dāng)基因中存在大腸桿菌稀有密碼子時(shí)，與之對(duì)應(yīng)的tRNA在細(xì)胞內(nèi)的含量較低。在翻譯過(guò)程中，核糖體需要等待稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA轉(zhuǎn)運(yùn)相應(yīng)的氨基酸，這會(huì)導(dǎo)致翻譯速度減緩，甚至可能發(fā)生翻譯提前終止的情況。這不僅降低了翻譯效率，還可能導(dǎo)致翻譯錯(cuò)誤，使合成的蛋白質(zhì)無(wú)法正確折疊，最終影響谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量和活性。密碼子優(yōu)化是提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大腸桿菌中表達(dá)水平的有效策略。通過(guò)生物信息學(xué)分析，確定大腸桿菌的高頻密碼子。利用基因合成技術(shù)，將谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因中大腸桿菌的稀有密碼子替換為高頻密碼子。這種優(yōu)化可以顯著提高基因的翻譯效率。優(yōu)化后的基因在翻譯時(shí)，核糖體能夠更快速地獲取對(duì)應(yīng)的tRNA和氨基酸，使翻譯過(guò)程更加順暢，從而提高了蛋白質(zhì)的合成速度。有研究表明，對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，其在大腸桿菌中的表達(dá)量可提高數(shù)倍。例如，通過(guò)將基因中多個(gè)稀有密碼子替換為大腸桿菌的高頻密碼子，重組大腸桿菌中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量從優(yōu)化前占總蛋白的10%左右提高到了30%以上。同時(shí)，密碼子優(yōu)化還能減少翻譯錯(cuò)誤的發(fā)生，有助于蛋白質(zhì)的正確折疊，提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的活性。因?yàn)楦咝У姆g過(guò)程使得蛋白質(zhì)能夠在細(xì)胞內(nèi)更有序地合成和折疊，減少了因翻譯異常導(dǎo)致的錯(cuò)誤折疊，從而提高了活性蛋白的產(chǎn)量。4.1.2基因修飾定點(diǎn)突變是一種重要的基因修飾方法，通過(guò)改變谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因特定位置的堿基序列，從而改變相應(yīng)的氨基酸殘基，進(jìn)而影響酶的表達(dá)與活性。研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性中心附近的氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變，可能會(huì)改變酶與底物的結(jié)合能力以及催化活性。通過(guò)定點(diǎn)突變將活性中心的某個(gè)氨基酸殘基替換為另一種氨基酸，可能會(huì)增強(qiáng)酶與底物的親和力，從而提高酶的催化效率，使表達(dá)產(chǎn)物的活性得到提升。在一些研究中，將谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶活性中心的絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸后，酶的催化活性提高了30%左右。然而，定點(diǎn)突變也可能對(duì)酶的表達(dá)產(chǎn)生負(fù)面影響。如果突變影響了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)難以正確折疊，從而增加包涵體的形成，降低可溶性蛋白的表達(dá)量。如果突變后的氨基酸殘基影響了蛋白質(zhì)的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)的折疊過(guò)程變得困難，就容易形成不溶性的包涵體。融合標(biāo)簽添加是另一種常用的基因修飾方法。在谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因上融合特定的標(biāo)簽，如His-tag、GST-tag、MBP-tag等，能夠?qū)γ傅谋磉_(dá)和后續(xù)處理產(chǎn)生多方面的影響。以His-tag為例，它由6個(gè)組氨酸殘基組成，具有與鎳離子等金屬離子特異性結(jié)合的能力。將His-tag融合到谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的N端或C端后，表達(dá)出的融合蛋白可以利用鎳柱親和層析技術(shù)進(jìn)行快速、高效的分離純化。在分離純化過(guò)程中，含有His-tag的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶能夠特異性地結(jié)合到鎳柱上，而其他雜質(zhì)則被洗脫下來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的初步純化。His-tag的添加還可能對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)產(chǎn)生積極影響。它可以增加蛋白質(zhì)的可溶性，減少包涵體的形成。這是因?yàn)镠is-tag的存在可能改變了蛋白質(zhì)的表面電荷和空間結(jié)構(gòu)，使其在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)更容易正確折疊，從而提高了可溶性蛋白的表達(dá)量。有研究表明，添加His-tag后，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的可溶性表達(dá)量提高了20%左右。GST-tag和MBP-tag等融合標(biāo)簽也具有類似的作用。GST-tag能夠增加融合蛋白的可溶性，還可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊。MBP-tag則可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，并有助于蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)。4.2表達(dá)條件因素4.2.1培養(yǎng)基成分培養(yǎng)基成分對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)有著至關(guān)重要的影響。碳源作為大腸桿菌生長(zhǎng)和代謝的主要能源物質(zhì)，不同種類的碳源會(huì)導(dǎo)致不同的代謝途徑和代謝速率，進(jìn)而影響谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)。常見(jiàn)的碳源包括葡萄糖、乳糖、甘油等。葡萄糖是大腸桿菌最易利用的碳源之一，其代謝速度快，能夠快速為大腸桿菌的生長(zhǎng)提供能量。在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中，大腸桿菌的生長(zhǎng)速度較快，能夠在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的細(xì)胞密度。然而，過(guò)高的葡萄糖濃度可能會(huì)引起代謝副產(chǎn)物（如乙酸）的積累。乙酸是大腸桿菌在葡萄糖代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一種有機(jī)酸，當(dāng)培養(yǎng)基中乙酸濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)和外源蛋白的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用。乙酸會(huì)降低培養(yǎng)基的pH值，影響細(xì)胞內(nèi)的酸堿平衡，導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，甚至死亡。它還可能干擾蛋白質(zhì)的合成和折疊過(guò)程，降低谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量和活性。乳糖則是一種誘導(dǎo)型碳源，它可以作為IPTG的替代物用于誘導(dǎo)外源基因的表達(dá)。乳糖能夠誘導(dǎo)大腸桿菌產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，該酶可以將乳糖分解為葡萄糖和半乳糖。在含有乳糖的培養(yǎng)基中，乳糖可以與lac操縱子上的阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白從操縱子上解離下來(lái)，從而啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。與IPTG相比，乳糖誘導(dǎo)具有成本低、安全性高的優(yōu)點(diǎn)。使用乳糖誘導(dǎo)時(shí)，需要較長(zhǎng)的誘導(dǎo)時(shí)間才能達(dá)到較高的表達(dá)水平，且乳糖的濃度對(duì)誘導(dǎo)效果也有較大影響。甘油作為碳源時(shí)，大腸桿菌的生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢，但它能夠提供較為穩(wěn)定的能源供應(yīng)。甘油的代謝途徑與葡萄糖不同，它不會(huì)像葡萄糖那樣引起乙酸的大量積累。在以甘油為碳源的培養(yǎng)基中，大腸桿菌能夠維持較好的生長(zhǎng)狀態(tài)，有利于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的穩(wěn)定表達(dá)。有研究表明，在優(yōu)化的甘油培養(yǎng)基中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量比在葡萄糖培養(yǎng)基中提高了20%左右。氮源是構(gòu)成蛋白質(zhì)和核酸的重要元素，對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)同樣具有關(guān)鍵作用。常見(jiàn)的氮源包括蛋白胨、酵母提取物、銨鹽等。蛋白胨是一種由蛋白質(zhì)水解得到的混合物，含有多種氨基酸和多肽，能夠?yàn)榇竽c桿菌提供豐富的氮源和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在含有蛋白胨的培養(yǎng)基中，大腸桿菌的生長(zhǎng)和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)通常較好。酵母提取物富含多種維生素、氨基酸、核苷酸等營(yíng)養(yǎng)成分，它不僅能夠?yàn)榇竽c桿菌提供氮源，還能提供其他生長(zhǎng)必需的因子。將蛋白胨和酵母提取物配合使用，能夠顯著促進(jìn)大腸桿菌的生長(zhǎng)和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)。有研究通過(guò)優(yōu)化蛋白胨和酵母提取物的比例，使谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量提高了30%以上。銨鹽（如硫酸銨、氯化銨等）是一種無(wú)機(jī)氮源，其成本較低，但單獨(dú)使用時(shí)，可能無(wú)法滿足大腸桿菌生長(zhǎng)和外源蛋白表達(dá)的全部營(yíng)養(yǎng)需求。在某些情況下，適量添加銨鹽可以補(bǔ)充氮源，促進(jìn)大腸桿菌的生長(zhǎng)。但如果銨鹽濃度過(guò)高，可能會(huì)對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用。過(guò)高的銨鹽濃度會(huì)影響培養(yǎng)基的滲透壓，導(dǎo)致細(xì)胞失水，影響細(xì)胞的正常生理功能。無(wú)機(jī)鹽在大腸桿菌的生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中也起著不可或缺的作用。鎂離子（Mg2?）是許多酶的激活劑，參與細(xì)胞內(nèi)的多種代謝反應(yīng)。在谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)過(guò)程中，適量的鎂離子能夠提高酶的活性和穩(wěn)定性。研究表明，當(dāng)培養(yǎng)基中鎂離子濃度為0.5-1.0mM時(shí)，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的活性最高。鈣離子（Ca2?）雖然不是大腸桿菌生長(zhǎng)所必需的元素，但在谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的催化反應(yīng)中，鈣離子可以作為激活劑，增強(qiáng)酶的活性。在培養(yǎng)基中添加適量的鈣離子（如1-5mM），可以提高谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的活性。鐵離子（Fe3?或Fe2?）參與細(xì)胞內(nèi)的電子傳遞和氧化還原反應(yīng)，對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)和代謝也有重要影響。缺鐵會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌生長(zhǎng)緩慢，影響谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)。在培養(yǎng)基中添加適量的鐵離子（如0.1-0.5mM），能夠促進(jìn)大腸桿菌的生長(zhǎng)和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)。4.2.2誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)條件是影響谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在大腸桿菌中表達(dá)的關(guān)鍵因素之一，其中誘導(dǎo)劑的種類、濃度、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)以及誘導(dǎo)溫度都對(duì)表達(dá)水平有著顯著影響。誘導(dǎo)劑在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中起著啟動(dòng)外源基因表達(dá)的關(guān)鍵作用。目前，最常用的誘導(dǎo)劑是IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）。IPTG能夠與大腸桿菌中的lac操縱子上的阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白從操縱子上解離下來(lái)，從而解除對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的抑制，啟動(dòng)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。不同濃度的IPTG對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)有顯著影響。低濃度的IPTG（如0.1mM）可能無(wú)法充分誘導(dǎo)基因的表達(dá)，導(dǎo)致表達(dá)量較低。隨著IPTG濃度的增加，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量通常會(huì)逐漸提高。當(dāng)IPTG濃度達(dá)到0.5-1.0mM時(shí)，表達(dá)量可能達(dá)到較高水平。過(guò)高濃度的IPTG（如大于1.0mM）可能會(huì)對(duì)大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生毒性，抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝，反而導(dǎo)致谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量下降。過(guò)高濃度的IPTG會(huì)影響細(xì)胞膜的通透性，干擾細(xì)胞內(nèi)的離子平衡和代謝途徑，使細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，進(jìn)而影響外源蛋白的表達(dá)。除了IPTG，乳糖也可作為誘導(dǎo)劑用于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。乳糖能夠被大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶分解為葡萄糖和半乳糖，分解過(guò)程中會(huì)誘導(dǎo)lac操縱子啟動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的表達(dá)。與IPTG相比，乳糖誘導(dǎo)具有成本低、安全性高的優(yōu)點(diǎn)，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用中更具優(yōu)勢(shì)。乳糖誘導(dǎo)的表達(dá)水平相對(duì)較低，且誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)，需要更精確地控制誘導(dǎo)條件。誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)也至關(guān)重要。通常在大腸桿菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期（OD???值約為0.6-0.8）時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)，能夠獲得較高的表達(dá)量。在這個(gè)時(shí)期，大腸桿菌細(xì)胞代謝活躍，具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)合成能力，此時(shí)誘導(dǎo)外源基因表達(dá)，可以充分利用細(xì)胞的代謝資源，促進(jìn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的合成。如果誘導(dǎo)時(shí)機(jī)過(guò)早，大腸桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)尚未達(dá)到最佳狀態(tài)，代謝活性較低，可能無(wú)法有效地表達(dá)外源基因。而誘導(dǎo)時(shí)機(jī)過(guò)晚，大腸桿菌細(xì)胞進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期或衰退期，細(xì)胞內(nèi)的代謝活性下降，也不利于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的高效表達(dá)。誘導(dǎo)溫度是影響谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)的另一個(gè)重要因素。較低的誘導(dǎo)溫度（如16-25℃）通常有利于蛋白質(zhì)的正確折疊，減少包涵體的形成。在低溫條件下，蛋白質(zhì)的合成速度相對(duì)較慢，這使得蛋白質(zhì)有更充足的時(shí)間進(jìn)行正確折疊，從而提高可溶性蛋白的表達(dá)量。以16℃誘導(dǎo)時(shí)，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的可溶性表達(dá)量可能會(huì)顯著提高。然而，低溫誘導(dǎo)也會(huì)導(dǎo)致表達(dá)周期延長(zhǎng)，生產(chǎn)效率降低。較高的誘導(dǎo)溫度（如37℃）雖然能夠加快蛋白質(zhì)的合成速度，但容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊，增加包涵體的形成。在37℃誘導(dǎo)時(shí)，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶可能大部分以包涵體形式存在，活性較低。因此，需要根據(jù)具體情況選擇合適的誘導(dǎo)溫度，以平衡蛋白質(zhì)的表達(dá)量和活性。4.2.3培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)的影響不可忽視，其中培養(yǎng)溫度、pH值和溶氧是幾個(gè)關(guān)鍵的因素。培養(yǎng)溫度對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)有著顯著影響。大腸桿菌是嗜溫菌，其最適生長(zhǎng)溫度一般在37℃左右。在這個(gè)溫度下，大腸桿菌的代謝活性最高，生長(zhǎng)速度最快，能夠在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的細(xì)胞密度。當(dāng)培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)，大腸桿菌的代時(shí)（細(xì)胞分裂一次所需的時(shí)間）約為20分鐘。在37℃培養(yǎng)條件下，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯速度較快，但過(guò)高的溫度可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成過(guò)程中的錯(cuò)誤增加，蛋白質(zhì)折疊異常，從而使表達(dá)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶容易形成包涵體。包涵體是由錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集而成的不溶性顆粒，不具有生物活性，且難以溶解和復(fù)性。當(dāng)培養(yǎng)溫度降低至25℃左右時(shí)，大腸桿菌的生長(zhǎng)速度會(huì)有所減緩，代時(shí)可能延長(zhǎng)至30-40分鐘。較低的溫度有利于蛋白質(zhì)的正確折疊，減少包涵體的形成。這是因?yàn)樵谳^低溫度下，蛋白質(zhì)合成速度相對(duì)較慢，有更充足的時(shí)間進(jìn)行正確的折疊和組裝。一些研究表明，在25℃培養(yǎng)條件下，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的可溶性表達(dá)量相比37℃有顯著提高。然而，溫度過(guò)低（如低于20℃）也會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌的生長(zhǎng)和代謝受到抑制，基因表達(dá)水平降低。在16℃培養(yǎng)時(shí)，大腸桿菌的生長(zhǎng)極為緩慢，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量也會(huì)明顯下降。因此，需要根據(jù)具體情況選擇合適的培養(yǎng)溫度，以平衡大腸桿菌的生長(zhǎng)和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)。pH值是影響大腸桿菌生長(zhǎng)和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)的另一個(gè)重要因素。大腸桿菌生長(zhǎng)的最適pH值一般在7.0-7.5之間。在這個(gè)pH范圍內(nèi)，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的酶活性較高，細(xì)胞膜的穩(wěn)定性良好，有利于細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。當(dāng)培養(yǎng)基的pH值偏離最適范圍時(shí)，會(huì)影響大腸桿菌的生長(zhǎng)和外源基因的表達(dá)。如果pH值過(guò)低（如低于6.0），會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性改變，細(xì)胞內(nèi)的離子平衡失調(diào)，從而抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。低pH值還可能影響RNA聚合酶等關(guān)鍵酶的活性，進(jìn)而影響谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。相反，如果pH值過(guò)高（如高于8.0），也會(huì)對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)生不利影響。高pH值可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性，影響細(xì)胞的正常生理功能。在谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)過(guò)程中，合適的pH值不僅有利于大腸桿菌的生長(zhǎng)，還能影響酶的活性和穩(wěn)定性。一些研究表明，在pH值為7.2-7.4的培養(yǎng)基中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量和活性相對(duì)較高。因此，在培養(yǎng)過(guò)程中，需要通過(guò)添加緩沖液等方式，嚴(yán)格控制培養(yǎng)基的pH值，以保證大腸桿菌的生長(zhǎng)和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的高效表達(dá)。溶氧水平對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)同樣至關(guān)重要。大腸桿菌是好氧菌，在生長(zhǎng)和代謝過(guò)程中需要充足的氧氣供應(yīng)。溶氧不足會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌的生長(zhǎng)受到抑制，代謝途徑發(fā)生改變，從而影響谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)。在搖瓶培養(yǎng)中，通常通過(guò)控制搖床的轉(zhuǎn)速來(lái)調(diào)節(jié)溶氧水平。較高的搖床轉(zhuǎn)速（如200-250rpm）能夠增加培養(yǎng)基與空氣的接觸面積，提高溶氧水平。在高溶氧條件下，大腸桿菌的生長(zhǎng)速度加快，細(xì)胞代謝活性增強(qiáng)，有利于谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的合成。有研究表明，將搖床轉(zhuǎn)速?gòu)?50rpm提高到200rpm，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量可提高15%左右。然而，過(guò)高的溶氧水平也可能對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生負(fù)面影響。過(guò)高的溶氧會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過(guò)氧化氫等。這些活性氧會(huì)氧化細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸等，損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而影響谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)。在發(fā)酵罐培養(yǎng)中，可以通過(guò)調(diào)節(jié)通氣量、攪拌速度等參數(shù)來(lái)精確控制溶氧水平。通過(guò)優(yōu)化溶氧條件，能夠?yàn)榇竽c桿菌的生長(zhǎng)和谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)提供更適宜的環(huán)境。4.3宿主菌株因素4.3.1不同宿主菌株的選擇在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，宿主菌株的選擇對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)具有顯著影響。常見(jiàn)的大腸桿菌宿主菌株如BL21(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS和Origami(DE3)，它們?cè)谶z傳背景、蛋白質(zhì)折疊能力、稀有密碼子tRNA含量等方面存在差異，這些差異會(huì)導(dǎo)致谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在不同宿主菌株中的表達(dá)水平、可溶性表達(dá)程度以及活性表現(xiàn)各不相同。BL21(DE3)是一種廣泛應(yīng)用的大腸桿菌宿主菌株，其生長(zhǎng)迅速，能夠在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的細(xì)胞密度，這為外源基因的表達(dá)提供了大量的宿主細(xì)胞。它具有較高的表達(dá)效率，在合適的表達(dá)載體和培養(yǎng)條件下，能夠?qū)崿F(xiàn)外源基因的高效轉(zhuǎn)錄和翻譯。在谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)研究中，當(dāng)使用pET-28a(+)作為表達(dá)載體時(shí)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中，在適宜的誘導(dǎo)條件下，谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶能夠得到一定水平的表達(dá)。由于其缺乏某些蛋白質(zhì)折疊輔助因子，在表達(dá)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶時(shí)，容易形成包涵體。這是因?yàn)楣劝滨０忿D(zhuǎn)氨酶作為一種外源蛋白，在BL21(DE3)細(xì)胞內(nèi)快速表達(dá)時(shí)，缺乏足夠的幫助其正確折疊的機(jī)制，導(dǎo)致蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊并聚集形成包涵體。包涵體的形成會(huì)降低可溶性谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量，增加后續(xù)分離純化和復(fù)性的難度。研究表明，在37℃誘導(dǎo)條件下，BL21(DE3)表達(dá)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶大部分以包涵體形式存在，可溶性表達(dá)量較低，僅占總表達(dá)量的10%-20%左右。Rosetta(DE3)pLysS是BL21(DE3)的衍生菌株，它在表達(dá)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。該菌株能夠補(bǔ)充大腸桿菌中稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因中可能存在一些在大腸桿菌中使用頻率較低的稀有密碼子，這些稀有密碼子對(duì)應(yīng)的tRNA在普通大腸桿菌菌株中的含量較低，會(huì)影響基因的翻譯效率。Rosetta(DE3)pLysS通過(guò)攜帶額外的tRNA基因，提供了大腸桿菌稀有密碼子（如AGG、AGA、AUA、CUA、CCC、GGA）對(duì)應(yīng)的tRNA，解決了密碼子偏好性問(wèn)題，使得含有稀有密碼子的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶基因能夠在該菌株中高效翻譯。研究發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶時(shí)，Rosetta(DE3)pLysS菌株的表達(dá)量明顯高于BL21(DE3)菌株。在16℃、0.5mMIPTG誘導(dǎo)8h的條件下，Rosetta(DE3)pLysS菌株中谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的表達(dá)量占總蛋白的百分比約為25%，而B(niǎo)L21(DE3)菌株的表達(dá)量占總蛋白的百分比約為18%。Rosetta(DE3)pLysS菌株還攜帶了pLysS質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有表達(dá)T7溶菌酶的基因。T7溶菌酶能夠降解T7RNA聚合酶，從而降低目的基因的背景表達(dá)水平。這在表達(dá)一些對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)有毒性的蛋白時(shí)非常重要，能夠減少毒性蛋白對(duì)宿主細(xì)胞的影響，使宿主細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)和繁殖。在表達(dá)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶時(shí)，較低的背景表達(dá)水平有助于提高表達(dá)產(chǎn)物的純度和質(zhì)量。Origami(DE3)菌株則具有促進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵形成的能力。谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶是一種含有多個(gè)半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)，這些半胱氨酸殘基