ICS65.020.01

CCSB04

15

內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)

DB15/T4111—2025

洋蔥、大蒜病毒RT-PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

CodeofpracticeforRT-PCRdetectionofvirusesinonionandgarlic

2025-07-10發(fā)布2025-08-10實(shí)施

內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB15/T4111—2025

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)果蔬標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC25）歸口。

本文件起草單位：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心、內(nèi)蒙古中天現(xiàn)代農(nóng)牧業(yè)開

發(fā)有限責(zé)任公司、呼和浩特市農(nóng)牧技術(shù)推廣中心、烏拉特前旗農(nóng)牧和科技局。

本文件主要起草人：李正男、張磊、孫平平、張稱心、鄭莎、徐文俊、蘇敏、韓靜宇、曹海、云梅、

趙栓、郭孟澤。

I

DB15/T4111—2025

洋蔥、大蒜病毒鑒定技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了洋蔥、大蒜病毒檢測(cè)中的術(shù)語和定義、檢測(cè)對(duì)象、抽樣、取樣、檢測(cè)方法和判定規(guī)則

等內(nèi)容。

本文件適用于洋蔥、大蒜的病毒檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T34265Sanger法測(cè)序技術(shù)指南

GB/T40974核酸樣本質(zhì)量評(píng)價(jià)方法

SN/T2497.21進(jìn)出口危險(xiǎn)化學(xué)品安全試驗(yàn)方法第21部分：瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

RNA病毒RNAviruses

核糖核酸病毒，其遺傳物質(zhì)為RNA。

反轉(zhuǎn)錄Reversetranscription（RT）

以RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成DNA的過程。

互補(bǔ)DNAComplementaryDNA（cDNA）

由逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成的、與RNA模板互補(bǔ)的DNA。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)Polymerasechainreaction（PCR）

利用DNA聚合酶，對(duì)DNA或cDNA模板的特定區(qū)域進(jìn)行體外擴(kuò)增的技術(shù)。反應(yīng)混合物通常由DNA聚合酶、

脫氧核苷三磷酸、引物和緩沖液組成，反應(yīng)過程主要包括變性、退火和延伸三個(gè)步驟。

1

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引物primers

人工合成的具有一定長(zhǎng)度的單鏈DNA分子，與DNA模板鏈的特定區(qū)域互補(bǔ)，其3’末端在PCR過程中作

為復(fù)制延伸的起始位點(diǎn)。

4檢測(cè)對(duì)象

主要洋蔥RNA病毒

黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）。

韭蔥黃條病毒（Leekyellowstripevirus，LYSV）。

洋蔥黃矮病毒（Onionyellowdwarfvirus，OYDV）。

胡蔥黃條病毒（Shallotyellowstripevirus，SYSV）。

主要大蒜RNA病毒

黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）。

大蒜病毒A（GarlicvirusA，GarV-A）。

大蒜病毒B（GarlicvirusB，GarV-B）。

大蒜病毒D（GarlicvirusD，GarV-D）。

大蒜病毒E（GarlicvirusE，GarV-E）。

大蒜病毒X（GarlicvirusX，GarV-X）。

大蒜潛隱病毒（Garliclatentvirus，GLV）。

韭蔥黃條病毒（Leekyellowstripevirus，LYSV）。

洋蔥黃矮病毒（Onionyellowdwarfvirus，OYDV）。

5取樣

取樣方法

采用5點(diǎn)法抽樣。

種植面積小于667m2（含667m2），抽檢100株。種植面積為667m2到6670m2（含6670m2），首個(gè)

667m2抽100株，之后每增加667m2增檢50株。超過6670m2，前6670m2按上述方法抽樣，之后每增加667

m2增檢20株。

6取樣方法

對(duì)樣方內(nèi)的所有洋蔥、大蒜進(jìn)行采樣。折取地上部的葉、花苔等作為檢測(cè)樣品，折取的樣品應(yīng)立即

檢測(cè)或液氮速凍后置于-80℃超低溫保存箱保存。采樣點(diǎn)距離檢測(cè)點(diǎn)較遠(yuǎn)時(shí)，應(yīng)將洋蔥、大蒜整株挖出，

運(yùn)到檢測(cè)點(diǎn)。

7檢測(cè)方法

樣品核酸提取

2

DB15/T4111—2025

選擇市售的用于提取含有多糖多酚材料RNA的試劑盒，按照試劑盒自帶的說明書進(jìn)行操作。核酸質(zhì)

量評(píng)價(jià)按照GB/T40974執(zhí)行。

反轉(zhuǎn)錄

以提取的質(zhì)量合格的總RNA為模板，選擇市售的具有基因組DNA去除功能的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)

錄，合成cDNA。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按照試劑盒自帶的說明書進(jìn)行設(shè)置。

PCR擴(kuò)增

7.3.1PCR反應(yīng)體系

市售產(chǎn)品通常為預(yù)混液或單品，根據(jù)所選產(chǎn)品提供的說明書，進(jìn)行PCR反應(yīng)混合物配制，并按說明

書指示加入cDNA或DNA模板以及病毒檢測(cè)引物。各種病毒的特異性檢測(cè)引物見表1。

表1洋蔥、大蒜病毒的特異性檢測(cè)引物

目標(biāo)DNA片段大小

病毒名稱引物名稱引物序列/（5’→3’方向）寄主植物

/（bp）

CMVCMV-FaGTTTATTTACAAGAGCGTACGG650洋蔥、大蒜

CMVCMV-RbGGTTCGAARRWATAACCGGG650洋蔥、大蒜

GarV-AGarV-A-FCCATATGAACAATCCTGTTGATCC756大蒜

GarV-AGarV-A-RGGGATCCTTAGAACGTGATCATTGGAG756大蒜

GarV-BGarV-B-FCCATATGGGAGACAGGTCACAAGG735大蒜

GarV-BGarV-B-RGGGATCCCTAAAATGTGAGCATGAGCGG735大蒜

GarV-DGarV-D-FCCATATGAATGAACAAGGAAACAC753大蒜

GarV-DGarV-D-RGGGATCCTCAGAATGTGATCATTGGAGG753大蒜

GarV-EGarV-E-FCCATATGAACGACCCCACGAAC759大蒜

GarV-EGarV-E-RCGGATCCTTAGAATGTTATCATTGGGGG759大蒜

GarV-XGarV-X-FATGGGYGATCGGAACCAAGGA732大蒜

GarV-XGarV-X-RTYAGAATGTGAGCATAAGGGG732大蒜

GLVGLV-FGTGGTNTGGAATTAC308大蒜

GLVGLV-RCAACATCGATTYTCTC308大蒜

LYSVLYSV-FTCACTGCATATGCGCACCAT1020洋蔥、大蒜

LYSVLYSV-RGCACCATACAGTGAATTGAG1020洋蔥、大蒜

OYDVOYDV-FGTTACCATCCAGGCCAAACA225洋蔥、大蒜

OYDVOYDV-RAGTGATGCAGCTGAAGCATA225洋蔥、大蒜

SYSVSYSV-FCACCNTAYATAGCRGARACAGCTCT605洋蔥、大蒜

SYSVSYSV-RACTGAAATGCGCCATTATYTGYCTA605洋蔥、大蒜

aF表示上游引物。

bR表示下游引物。

7.3.2PCR反應(yīng)程序

95℃預(yù)變性2min。35個(gè)反應(yīng)循環(huán)：95℃變性20s；退火20s，退火溫度按引物合成報(bào)告設(shè)置，

兩個(gè)引物退火溫度不一致時(shí)，取較低溫度；72℃延伸，延伸時(shí)間根據(jù)所選產(chǎn)品說明書提供的參數(shù)進(jìn)行

計(jì)算。最后，72℃終延伸5min。

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DB15/T4111—2025

瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

7.4.1瓊脂糖凝膠制備

用Tris-乙酸緩沖液溶解瓊脂糖，制備質(zhì)量體積比為1%的瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠的制備按照SN/T

2497.21執(zhí)行。

7.4.2電泳檢測(cè)

用Tris-乙酸緩沖液，在水平板電泳槽中進(jìn)行電泳。上樣、電泳按照SN/T2497.21執(zhí)行。電泳結(jié)束

時(shí)，凝膠置于紫外燈或凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀測(cè)和拍照，獲取的圖片用于結(jié)果判定。

8結(jié)果判定

異常結(jié)果

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖，與圖中DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品相比，從陰性對(duì)照樣品擴(kuò)增到了預(yù)期大小

的DNA片段，或從陰性對(duì)