X42DB3403蚌埠市市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB3403/T02—2020本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由蚌埠市疾病預(yù)防控制中心提出。本標(biāo)準(zhǔn)由蚌埠市衛(wèi)生健康委員會(huì)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：蚌埠市疾病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)參與起草單位：安徽省疾病預(yù)防控制中心、北京市疾病預(yù)防控制中心、蕪湖市疾病預(yù)防控制中心、廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：常洪、袁明珠、張世滿(mǎn)。DB3403/T02—20201食品中合成著色劑的測(cè)定固相萃取-高效液相色譜法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中合成著色劑的固相萃取-高效液相色譜法測(cè)定的原理、試劑耗材、儀器設(shè)備、分析步驟、結(jié)果計(jì)算、精密度、檢出限。本標(biāo)準(zhǔn)適用于飲料、調(diào)味品、果汁、配制酒、糖果、蜜餞、果凍、罐頭、雜糧面粉、肉制品、糕點(diǎn)等食品中合成著色劑的測(cè)定。2規(guī)范性引用文件GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)和定義3.1合成著色劑人工合成的能夠使食品著色，從而改善食品色調(diào)和色澤的可食用物質(zhì)。本標(biāo)準(zhǔn)中是指常用的檸檬黃、莧菜紅、酸性靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)和赤蘚紅等八種合成著色劑。4原理食品中的合成著色劑用氨化甲醇溶液提取，弱陰離子固相萃取柱凈化，經(jīng)反相液相色譜分離，二極管陣列檢測(cè)器或紫外檢測(cè)器測(cè)定，保留時(shí)間定性和外標(biāo)峰面積法定量。5試劑耗材5.1試劑：5.1.1甲醇（CH3OH）色譜純。5.1.5乙酸銨（CH3COONH4）優(yōu)級(jí)純。2DB3403/T02—20205.1.7磷酸氫二鉀（K2HPO4）。5.1.8石油醚（沸程30℃~60℃)。5.2試劑配制：5.2.1乙酸鋅溶液（1.0mol/L）：稱(chēng)取22g乙酸鋅，用水溶解并定容至100mL，混勻。5.2.2草酸鉀/磷酸氫二鉀溶液：稱(chēng)取3.0g草酸鉀和7.0g磷酸氫二鉀，用水溶解并定容至100mL，5.2.3檸檬酸溶液：稱(chēng)取20g檸檬酸，用水溶解并定容至100mL，混勻。5.2.4氨水溶液（1+9）：取10mL氨水加入90ml水中，混勻。5.2.5pH4水溶液：水加檸檬酸溶液調(diào)pH值至4。5.2.6pH6水溶液：水加檸檬酸溶液調(diào)pH值至6。5.2.7氨化甲醇溶液（3+97）：取3mL氨水加入到97mL甲醇中，混勻。5.2.8乙酸銨溶液（0.02mol/L稱(chēng)取1.54g乙酸銨，用水溶解并定容至1000mL，混勻，過(guò)0.455.3標(biāo)準(zhǔn)品5.3.1檸檬黃（CAS：1934-21-0）。5.3.2莧菜紅（CAS：19168-23-1）。5.3.3胭脂紅（CAS：15876-47-8）。5.3.4日落黃（CAS：2783-94-0）。5.3.5誘惑紅（CAS：25956-17-6）。5.3.6亮藍(lán)（CAS：6104-59-2）。5.3.7酸性靛藍(lán)（CAS：860-22-0）。5.3.8赤蘚紅（CAS：12227-78-0）。5.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制5.4.1合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1000μg/mL）：準(zhǔn)確稱(chēng)取按其純度折算為100%質(zhì)量的檸檬黃、莧菜紅、酸性靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)和赤蘚紅各0.1g（精確至0.0001g），置于100ml容量瓶中，加水至刻度。5.4.2合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)使用液：臨用時(shí)將標(biāo)準(zhǔn)貯備液加水稀釋10倍，配制成100μg/mL。5.4.3合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確移取適量合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)使用液，用水配制成0.2μg/mL、DB3403/T02—202030.5μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10μg/mL和20μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列。5.5耗材5.5.1固相萃取柱：弱陰離子（N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯苯共聚物-三(亞甲胺)）固相萃取柱（150mg/6mL）或相當(dāng)者。5.5.20.45um微孔濾膜。6儀器設(shè)備6.1高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測(cè)器或者紫外檢測(cè)器；6.2天平：感量0.001g和0.0001g。6.3均質(zhì)機(jī)。6.4漩渦混勻器。6.5超聲波提取器。6.6氮吹儀。6.7恒溫水浴鍋。6.8固相萃取裝置。6.9高速冷凍離心機(jī)，轉(zhuǎn)速不低于10000r/min。6.10移液管：1ml、5ml。6.11玻璃燒杯：50mL。6.12容量瓶：10mL、25mL、100ml。7分析步驟7.1試樣制備7.1.1液體飲料、液體調(diào)味料和果汁等：稱(chēng)取2～5g樣品（精確至0.001g于50mL玻璃燒杯中，加5mL水，用氨水溶液調(diào)pH至6左右，用水定容至10mL，4000r/min離心10min，上清液待凈化。7.1.2配制酒類(lèi)：稱(chēng)取2～5g樣品（精確至0.001g于50mL玻璃燒杯中，加熱除去乙醇，用氨水溶液調(diào)pH至6左右，用水定容至10mL，4000r/min離心10min，上清液待凈化。7.1.3蜜餞、糖果、果凍和水果罐頭等：稱(chēng)取2～5g（精確至0.001g）均質(zhì)后樣品，于50mL玻璃燒杯中，加20mL水，加熱溶解樣品，加1mL乙酸鋅溶液和1mL草酸鉀/磷酸氫二鉀溶液，充分漩渦混勻，加水定容至25mL，4000r/min離心10min，上清液待凈化。DB3403/T02—202047.1.4玉米粉、小米和小米粉等：稱(chēng)取2～5g（精確至0.001g）粉碎后樣品，于50mL玻璃燒杯中，加10mL氨化甲醇溶液，漩渦混勻1min，超聲提取15min，4000r/min離心3min，上清液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中；試樣殘?jiān)冒被状既芤褐貜?fù)提取至提取液無(wú)色，合并提取液于60℃水浴蒸發(fā)近干，用水定容至10mL，10000r/min離心3min，上清液待凈化。7.1.5番茄醬等調(diào)味品：稱(chēng)取2～5g（精確至0.001g）試樣，于50mL玻璃燒杯中，加10mL氨化甲醇溶液，漩渦混勻1min，超聲提取15min，4000r/min離心3min，上清液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中；試樣殘?jiān)冒被状既芤褐貜?fù)提取至提取液無(wú)色，合并提取液于60℃水浴蒸發(fā)近干，用水定容至10mL，10000r/min離心3min，上清液待凈化。7.1.6肉制品：稱(chēng)取2～5g（精確至0.001g）均質(zhì)后樣品，于50mL玻璃燒杯中，加20mL石油醚，漩渦混勻1min，10000r/min離心3min，棄去石油醚層，殘?jiān)貜?fù)上述過(guò)程去脂3次；向試樣殘?jiān)屑?0mL氨化甲醇溶液，漩渦混勻1min，4000r/min離心3min，上清液轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中；試樣殘?jiān)冒被状既芤褐貜?fù)提取至提取液無(wú)色，合并提取液于60℃水浴蒸發(fā)近干，用水定容至10mL，10000r/min離心3min，上清液待凈化。7.2試樣凈化7.2.1預(yù)先用6mL甲醇和6mL水活化固相萃取柱；7.2.2取5.0mL試樣提取液，以1mL/min的速度通過(guò)預(yù)先活化過(guò)的固相萃取柱。7.2.3分別用6mLpH4水溶液、6mLpH6水溶液和6mL甲醇淋洗固相萃取柱，將固相萃取柱吹干。7.2.4用6mL氨化甲醇洗脫并收集，60℃恒溫水浴氮?dú)獯到?，?.0mL水復(fù)溶，混勻，若溶液渾濁，可用10000r/min離心5min，上清液待上機(jī)測(cè)定。7.3儀器參考條件7.3.1色譜柱：C18（4.6×250mm，5μm）。7.3.2流動(dòng)相：A：乙酸銨溶液；B：甲醇。7.3.3流動(dòng)相梯度洗脫程序：見(jiàn)表1。7.3.4流速：1.0mL/min。7.3.5柱溫：30℃。7.3.6進(jìn)樣量：20μL。7.3.7檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器（PDA）或者紫外檢測(cè)器（UV）。7.3.8檢測(cè)波長(zhǎng)：見(jiàn)表2。DB3403/T02—20205表1梯度洗脫程序時(shí)間（min）A（%）B（%）10.02345620.0表2八種合成著色劑檢測(cè)波長(zhǎng)著色劑檸檬黃莧菜紅酸性靛藍(lán)胭脂紅誘惑紅赤蘚紅檢測(cè)波長(zhǎng)4286084836257.4測(cè)定將試樣凈化提取液和合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別注入高效液相色譜儀，根據(jù)保留時(shí)間定性，外標(biāo)峰面積法定量。8結(jié)果計(jì)算試樣中，八種人工合成著色劑的含量（g/kg），按式（1）計(jì)算：X=×f…………（1）式中：X——試樣中目標(biāo)化合物含量，單位為克每千克（g/kgc——由標(biāo)準(zhǔn)的線性方程得到的上機(jī)試樣溶液中目標(biāo)化合物含量，單位為微克每毫升）；V——試樣的最終定容體積，單位為毫升（mL）；m——試樣的質(zhì)量，單位為克（gf——試樣稀釋倍數(shù)；1000——換算系數(shù)。以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字（或小數(shù)點(diǎn)后兩位）。DB3403/T02—202069精密度在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。10檢出限本方法中檸檬黃、莧菜紅、酸性靛藍(lán)、胭脂紅、日落黃、誘惑紅、亮藍(lán)和赤蘚紅的檢出限為：0.05mg/kg，定量限為：0.15mg/kg。DB3