大黃素對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)及其機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義結(jié)腸癌作為常見的消化道惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類健康。近年來，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，尤其在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)和老齡化社會中更為顯著。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)193萬，死亡病例數(shù)為94萬，分別位居全球癌癥發(fā)病和死亡的第三位和第二位。在中國，隨著居民生活方式的改變和人口老齡化的加劇，結(jié)腸癌的發(fā)病率也逐年攀升，已成為消化系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率增長最快的腫瘤之一。目前，結(jié)腸癌的治療方法主要包括手術(shù)切除、化療、放療以及靶向治療等。然而，這些治療方法存在一定的局限性。手術(shù)切除對于早期結(jié)腸癌患者具有較好的療效，但對于中晚期患者，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險較高；化療和放療雖能在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的生長，但同時也會對正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)，影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性；靶向治療雖然具有較高的特異性，但部分患者會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，限制了其臨床應(yīng)用。因此，尋找安全、有效的新型治療藥物或方法成為結(jié)腸癌研究領(lǐng)域的重要課題。大黃素（Emodin）是一種天然的蒽醌類化合物，廣泛存在于大黃、何首烏、虎杖等多種中藥材中。作為傳統(tǒng)中藥的活性成分之一，大黃素具有多種藥理活性，如抗菌、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤等。近年來，越來越多的研究表明，大黃素在抗腫瘤方面展現(xiàn)出巨大的潛力，能夠通過多種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤血管生成以及腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等。在結(jié)腸癌研究中，已有研究報道大黃素對結(jié)腸癌細(xì)胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，但其具體的作用機(jī)制尚未完全明確。深入研究大黃素抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用及其機(jī)制，不僅有助于揭示大黃素的抗腫瘤作用靶點和信號通路，為開發(fā)新型的結(jié)腸癌治療藥物提供理論依據(jù)，還可能為臨床結(jié)腸癌的治療提供新的策略和方法，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的本研究旨在深入探究大黃素對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用及其潛在機(jī)制，具體目標(biāo)如下：明確大黃素對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制效果：運(yùn)用細(xì)胞增殖實驗，如CCK-8法、EdU標(biāo)記法等，檢測不同濃度大黃素作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞系（如HT-29、SW480等）不同時間后的細(xì)胞增殖情況，繪制細(xì)胞生長曲線，計算細(xì)胞增殖抑制率，從而確定大黃素對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的抑制作用及其量效關(guān)系和時效關(guān)系。揭示大黃素誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制：借助流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst染色、AnnexinV-FITC/PI雙染等方法，檢測大黃素處理后人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率的變化；采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，檢測凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白等）的表達(dá)水平，以及線粒體膜電位的變化，探討大黃素是否通過線粒體凋亡途徑或死亡受體凋亡途徑誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，明確其在凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的信號分子和調(diào)控機(jī)制。探究大黃素對人結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響及其機(jī)制：利用流式細(xì)胞術(shù)分析大黃素處理后人結(jié)腸癌細(xì)胞周期分布的改變，確定細(xì)胞周期阻滯的時相；通過檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（如Cyclin、CDK、p21、p27等）的表達(dá)水平，研究大黃素影響細(xì)胞周期進(jìn)程的分子機(jī)制，闡明其是否通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白和激酶的活性，干擾細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，進(jìn)而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。探討大黃素對人結(jié)腸癌細(xì)胞信號通路的影響：基于前期研究和相關(guān)文獻(xiàn)報道，選取可能與大黃素抗腫瘤作用相關(guān)的信號通路，如PI3K/AKT、MAPK/ERK、Wnt/β-catenin等信號通路。運(yùn)用Westernblot、免疫熒光、實時熒光定量PCR（qRT-PCR）等技術(shù)，檢測大黃素處理后人結(jié)腸癌細(xì)胞中這些信號通路關(guān)鍵分子的磷酸化水平、蛋白表達(dá)量以及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，明確大黃素對各信號通路的激活或抑制作用，確定其在抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖過程中發(fā)揮核心調(diào)控作用的信號通路及上下游分子靶點。評估大黃素在體內(nèi)對結(jié)腸癌生長的抑制作用：構(gòu)建人結(jié)腸癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，給予不同劑量的大黃素進(jìn)行干預(yù)，觀察裸鼠移植瘤的生長情況，測量腫瘤體積和重量，計算抑瘤率；通過免疫組織化學(xué)染色、TUNEL染色等方法，檢測腫瘤組織中增殖相關(guān)蛋白（如Ki-67）、凋亡相關(guān)蛋白、血管生成相關(guān)因子以及信號通路關(guān)鍵分子的表達(dá)情況，驗證大黃素在體內(nèi)對結(jié)腸癌生長的抑制作用及其機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供更直接的實驗依據(jù)。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.3.1大黃素的抗癌作用研究大黃素作為一種天然的蒽醌類化合物，其抗癌作用在國內(nèi)外受到廣泛關(guān)注。大量研究表明，大黃素對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用，包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等。在體外細(xì)胞實驗中，研究人員通過不同的細(xì)胞模型驗證了大黃素的抗癌活性。例如，在肝癌細(xì)胞研究中，大黃素能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且呈劑量和時間依賴性。對肺癌細(xì)胞的研究也發(fā)現(xiàn)，大黃素可抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，降低細(xì)胞的運(yùn)動性，從而減少腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移風(fēng)險。在體內(nèi)動物實驗方面，相關(guān)研究進(jìn)一步證實了大黃素的抗癌效果。構(gòu)建人腫瘤細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，給予大黃素干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)腫瘤體積明顯減小，生長速度減緩，表明大黃素在體內(nèi)也能有效抑制腫瘤的生長。這些研究結(jié)果為大黃素在腫瘤治療中的應(yīng)用提供了重要的實驗依據(jù)。1.3.2大黃素抗癌作用機(jī)制研究大黃素抗癌作用機(jī)制的研究是目前的熱點領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者從多個角度進(jìn)行了深入探索。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的調(diào)控作用。大黃素被發(fā)現(xiàn)可以通過多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。一方面，大黃素能夠激活線粒體凋亡途徑。它可以促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、半胱天冬酶-9（Caspase-9）等形成凋亡小體，進(jìn)而激活下游的Caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白，引發(fā)細(xì)胞凋亡。另一方面，大黃素還可能通過死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。它可以上調(diào)死亡受體如Fas、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體（TRAIL-R）等的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞對死亡信號更加敏感，激活Caspase-8，啟動細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)。此外，大黃素還可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)來影響細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bad等），大黃素能夠降低抗凋亡蛋白的表達(dá)，同時上調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)凋亡平衡，促使細(xì)胞走向凋亡。阻滯細(xì)胞周期：細(xì)胞周期的正常運(yùn)轉(zhuǎn)是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，而腫瘤細(xì)胞往往存在細(xì)胞周期調(diào)控異常，導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖。大黃素可以通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，使腫瘤細(xì)胞阻滯于特定的細(xì)胞周期時相，從而抑制細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，大黃素能夠抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）的表達(dá)和活性。例如，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，大黃素可以下調(diào)CyclinD1、CyclinE等的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期；在肝癌細(xì)胞中，大黃素則可使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，這與它上調(diào)p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)有關(guān)，p21、p27可以與CDK結(jié)合，抑制其活性，從而阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程。抑制腫瘤血管生成：腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供營養(yǎng)和氧氣，因此抑制腫瘤血管生成是腫瘤治療的重要策略之一。大黃素在抑制腫瘤血管生成方面具有顯著作用。它可以抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體（VEGFR）的表達(dá)和活性，減少VEGF與VEGFR的結(jié)合，從而阻斷下游信號通路的激活，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。此外，大黃素還能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，MMPs在腫瘤血管生成過程中參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解和重塑，大黃素對MMPs的抑制作用可以阻礙腫瘤血管生成的微環(huán)境構(gòu)建，進(jìn)而抑制腫瘤血管生成。調(diào)節(jié)信號通路：細(xì)胞內(nèi)存在多條信號通路，它們相互交織形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等生物學(xué)過程。大黃素可以通過調(diào)節(jié)多種信號通路來發(fā)揮抗癌作用。其中，PI3K/AKT信號通路在腫瘤細(xì)胞的存活、增殖和代謝中起關(guān)鍵作用。大黃素能夠抑制PI3K的活性，阻止AKT的磷酸化，從而阻斷PI3K/AKT信號通路的激活，抑制腫瘤細(xì)胞的生長和存活。MAPK/ERK信號通路也與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，大黃素可以抑制ERK1/2的磷酸化，降低其下游靶基因的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。此外，Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤細(xì)胞的干性維持、增殖和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，大黃素能夠抑制Wnt信號通路的激活，減少β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的積累，降低其下游靶基因如c-Myc、CyclinD1等的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。盡管國內(nèi)外在大黃素抗癌作用及機(jī)制研究方面取得了一定的進(jìn)展，但仍存在一些問題和挑戰(zhàn)。例如，大黃素在體內(nèi)的藥代動力學(xué)特性和生物利用度較低，限制了其臨床應(yīng)用；大黃素作用的分子靶點和信號通路復(fù)雜，各通路之間的相互作用及協(xié)同機(jī)制尚不完全清楚；目前大多數(shù)研究集中在體外細(xì)胞實驗和動物實驗，臨床研究相對較少，大黃素在人體中的安全性和有效性還需要進(jìn)一步驗證。因此，深入研究大黃素的抗癌作用機(jī)制，提高其生物利用度，開展更多的臨床研究，對于推動大黃素在腫瘤治療中的應(yīng)用具有重要意義。二、大黃素與結(jié)腸癌細(xì)胞概述2.1大黃素的特性2.1.1結(jié)構(gòu)與來源大黃素（Emodin），化學(xué)名稱為1,3,8-三羥基-6-甲基蒽醌，分子式為C_{15}H_{10}O_{5}，分子量為270.23。其化學(xué)結(jié)構(gòu)由一個蒽醌母核以及分布在不同位置的羥基和甲基構(gòu)成。這種獨特的結(jié)構(gòu)賦予了大黃素一系列特殊的物理化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)活性。從結(jié)構(gòu)上看，蒽醌母核的共軛體系使其具有一定的穩(wěn)定性和電子云分布特點，而羥基和甲基的存在則進(jìn)一步影響了大黃素的溶解性、極性以及與生物分子的相互作用能力。羥基的親水性在一定程度上影響了大黃素在不同溶劑中的溶解行為，而甲基的疏水性則對其與細(xì)胞膜等生物膜的相互作用產(chǎn)生作用。大黃素廣泛存在于多種植物中，是許多傳統(tǒng)中藥材的活性成分之一。在蓼科植物中，掌葉大黃（RheumpalmatumL.）、唐古特大黃（RheumtanguticumMaxim.exBalf.）和藥用大黃（RheumofficinaleBaill.）的根莖和根中均含有豐富的大黃素。這些大黃屬植物在我國有著悠久的藥用歷史，其主要功效得益于大黃素等多種活性成分的協(xié)同作用。除大黃屬植物外，虎杖（PolygonumcuspidatumSieb.etZucc.）也是提取大黃素的重要來源之一。虎杖中不僅含有大黃素，還含有白藜蘆醇等其他具有生物活性的成分，在臨床上被用于治療多種疾病。此外，何首烏（Fallopiamultiflora(Thunb.)Harald.）中也含有大黃素，何首烏常用于肝腎陰虛、須發(fā)早白等病癥的治療，大黃素在其中可能發(fā)揮著調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、抗氧化等作用。除植物來源外，一些真菌也能夠合成大黃素，如某些曲霉屬和青霉屬真菌在特定的培養(yǎng)條件下可以產(chǎn)生大黃素。不同來源的大黃素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和基本性質(zhì)相同，但由于提取工藝和雜質(zhì)成分的差異，可能在純度和活性上存在一定的差異。在實際應(yīng)用中，需要根據(jù)具體需求選擇合適的來源和提取方法，以確保獲得高質(zhì)量的大黃素。2.1.2理化性質(zhì)大黃素為橙黃色長針狀結(jié)晶，具有蒽醌的特殊反應(yīng)。其熔點為256℃-257℃，這一熔點特性使其在一定溫度條件下能夠保持相對穩(wěn)定的固態(tài)結(jié)構(gòu)。在溶解性方面，大黃素幾乎不溶于水，這是由于其分子結(jié)構(gòu)中疏水性的蒽醌母核占比較大，而親水性的羥基相對較少，導(dǎo)致其在極性溶劑水中的溶解度極低。然而，大黃素可溶于乙醇、***、***仿、苯等有機(jī)溶劑。在乙醇中，大黃素能夠較好地溶解，形成橙黃色的溶液，這一特性使得在實驗室研究和工業(yè)生產(chǎn)中，乙醇常被用作提取和溶解大黃素的常用溶劑。此外，大黃素還可溶于苛性堿水溶液和碳酸鈉水溶液，并且在氨溶液中會顯示出櫻紅色。這是因為大黃素分子中的羥基具有一定的酸性，能夠與堿發(fā)生反應(yīng)，形成可溶性的鹽類，從而增加其在堿性溶液中的溶解度。這種在不同溶劑中的溶解特性，為大黃素的提取、分離、純化以及分析檢測等提供了重要的依據(jù)。例如，在提取大黃素時，可以利用其在有機(jī)溶劑中的溶解性，采用有機(jī)溶劑萃取法從植物原料中提取大黃素；在對大黃素進(jìn)行分析檢測時，可以根據(jù)其在不同溶劑中的溶解特性，選擇合適的溶劑來配制標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液。大黃素在不同條件下的穩(wěn)定性也值得關(guān)注。在常溫、避光、干燥的條件下，大黃素相對穩(wěn)定，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性能夠保持較長時間。然而，當(dāng)受到光照、高溫、氧化等因素影響時，大黃素可能會發(fā)生分解或氧化反應(yīng)，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)和活性發(fā)生改變。光照條件下，大黃素分子吸收光能，激發(fā)態(tài)的分子可能發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，如氧化、異構(gòu)化等，從而降低其含量和活性。在高溫環(huán)境中，大黃素的穩(wěn)定性也會受到影響，可能會發(fā)生熱分解反應(yīng)，導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)破壞。此外，大黃素具有一定的還原性，在遇到強(qiáng)氧化劑時，容易被氧化，其蒽醌結(jié)構(gòu)中的某些化學(xué)鍵可能會發(fā)生斷裂或氧化修飾，進(jìn)而影響其生物活性。因此，在儲存和使用大黃素時，需要采取適當(dāng)?shù)拇胧?，如避光、低溫、密封保存等，以確保其穩(wěn)定性和活性。2.1.3藥理活性大黃素具有廣泛的藥理活性，在多個領(lǐng)域展現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價值。在抗氧化方面，大黃素是一種有效的天然抗氧化劑，能夠通過多種途徑清除體內(nèi)的自由基。自由基是一類具有高度活性的分子，在正常生理代謝過程中會產(chǎn)生，但當(dāng)體內(nèi)自由基積累過多時，會攻擊生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而引發(fā)多種疾病，如心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病和腫瘤等。大黃素分子中的酚羥基具有供氫能力，能夠與自由基發(fā)生反應(yīng)，將自由基轉(zhuǎn)化為相對穩(wěn)定的分子，從而終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，減少氧化損傷。大黃素還可以調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)的活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和過氧化氫酶（CAT）等。這些抗氧化酶能夠協(xié)同作用，清除體內(nèi)不同類型的自由基，維持氧化還原平衡。大黃素通過上調(diào)這些抗氧化酶的表達(dá)和活性，增強(qiáng)機(jī)體自身的抗氧化防御能力，保護(hù)細(xì)胞免受自由基的侵害。大黃素的抗炎作用也十分顯著。炎癥反應(yīng)是機(jī)體對各種損傷因素的一種防御反應(yīng)，但過度或持續(xù)的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致組織損傷和疾病的發(fā)生。大黃素可以通過抑制炎癥介質(zhì)的釋放來減輕炎癥反應(yīng)。它能夠抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路的激活，NF-κB是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用，它可以調(diào)控多種炎癥介質(zhì)基因的表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。大黃素通過抑制NF-κB的活化，減少這些炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)對組織的損傷。大黃素還可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。它可以抑制巨噬細(xì)胞的活化和增殖，減少其分泌炎癥介質(zhì)的能力；同時，大黃素還可以調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的功能，抑制免疫細(xì)胞的過度活化，從而減輕炎癥反應(yīng)?？咕钚允谴簏S素的又一重要藥理特性。大黃素對多種細(xì)菌具有抑制作用，包括金黃色葡萄球菌、鏈球菌、白喉桿菌、枯草桿菌、副傷寒桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、流感桿菌、肺炎球菌、卡他球菌等常見病原菌。其抗菌作用機(jī)制主要與抑制細(xì)菌的代謝過程有關(guān)。大黃素能夠抑制線粒體呼吸鏈電子傳遞，干擾細(xì)菌的能量代謝，使細(xì)菌無法獲得足夠的能量來維持正常的生命活動。大黃素還可以抑制呼吸與氨基酸、糖和蛋白質(zhì)代謝中間產(chǎn)物的氧化和脫氫等過程，影響細(xì)菌的物質(zhì)合成和代謝平衡，最終導(dǎo)致細(xì)菌生長受抑。大黃素對臨床常見厭氧性細(xì)菌也有較強(qiáng)的抑制作用，其最低抑菌濃度（MIC）略高于甲硝唑，在8μg/ml濃度下能使76%-91%的厭氧菌生長受到抑制。這使得大黃素在治療厭氧菌感染相關(guān)疾病方面具有潛在的應(yīng)用前景。最為關(guān)鍵的是，大黃素在抗腫瘤領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的潛力。研究表明，大黃素對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制侵襲和轉(zhuǎn)移以及抑制腫瘤血管生成等作用。在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面，大黃素可以通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，使腫瘤細(xì)胞阻滯于特定的細(xì)胞周期時相，從而抑制細(xì)胞的分裂和增殖。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，大黃素能夠下調(diào)CyclinD1、CyclinE等細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，阻止細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期（S期），從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。大黃素還可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗癌作用。它可以激活線粒體凋亡途徑，促使線粒體釋放細(xì)胞色素C，細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、半胱天冬酶-9（Caspase-9）等形成凋亡小體，進(jìn)而激活下游的Caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白，引發(fā)細(xì)胞凋亡。大黃素還可能通過死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，上調(diào)死亡受體如Fas、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體（TRAIL-R）等的表達(dá)，激活Caspase-8，啟動細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)。在抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移方面，大黃素能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，MMPs在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用，它們可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和擴(kuò)散提供條件。大黃素通過抑制MMPs的活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。大黃素還可以抑制腫瘤血管生成，腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供營養(yǎng)和氧氣，大黃素可以抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體（VEGFR）的表達(dá)和活性，減少VEGF與VEGFR的結(jié)合，阻斷下游信號通路的激活，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。2.2結(jié)腸癌細(xì)胞特點2.2.1結(jié)腸癌細(xì)胞的生物學(xué)特性結(jié)腸癌細(xì)胞具有獨特的生物學(xué)特性，這些特性使其在生長、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等方面與正常結(jié)腸細(xì)胞存在顯著差異。在增殖能力上，結(jié)腸癌細(xì)胞呈現(xiàn)出失控的增殖狀態(tài)。正常結(jié)腸細(xì)胞的增殖受到嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制，包括細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、生長因子及其受體等多種因素的協(xié)同作用，以維持腸道組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，結(jié)腸癌細(xì)胞由于基因的突變或異常表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控紊亂。例如，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）和細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）的異常表達(dá)，使得結(jié)腸癌細(xì)胞能夠持續(xù)進(jìn)入細(xì)胞周期進(jìn)行分裂，從而實現(xiàn)快速增殖。研究表明，在許多結(jié)腸癌細(xì)胞系中，CyclinD1的表達(dá)明顯上調(diào)，它與CDK4/6形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。此外，結(jié)腸癌細(xì)胞還能夠分泌多種生長因子，如表皮生長因子（EGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，這些生長因子與其受體結(jié)合后，激活下游的信號通路，如PI3K/AKT、MAPK/ERK等，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的增殖。在侵襲和轉(zhuǎn)移能力方面，結(jié)腸癌細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移傾向。正常結(jié)腸細(xì)胞之間通過緊密連接、黏著連接等結(jié)構(gòu)維持細(xì)胞間的緊密聯(lián)系，并且細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）對細(xì)胞的遷移起到限制作用。而結(jié)腸癌細(xì)胞能夠通過多種方式突破這些限制。結(jié)腸癌細(xì)胞可以分泌多種蛋白水解酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員，包括MMP-2、MMP-9等。這些蛋白水解酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)中的成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白等，為癌細(xì)胞的遷移開辟道路。MMP-2可以降解IV型膠原蛋白，而IV型膠原蛋白是基底膜的主要成分之一，基底膜的破壞使得癌細(xì)胞能夠更容易地穿透組織屏障，進(jìn)入周圍組織和血管。結(jié)腸癌細(xì)胞表面的黏附分子表達(dá)也發(fā)生改變。例如，E-鈣黏蛋白的表達(dá)下調(diào)，E-鈣黏蛋白是一種重要的細(xì)胞間黏附分子，它的減少導(dǎo)致癌細(xì)胞之間的黏附力下降，使得癌細(xì)胞更容易脫離原發(fā)腫瘤灶，發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。同時，結(jié)腸癌細(xì)胞會上調(diào)一些整合素的表達(dá)，整合素可以與細(xì)胞外基質(zhì)中的成分結(jié)合，促進(jìn)癌細(xì)胞與周圍組織的黏附，進(jìn)而幫助癌細(xì)胞在新的部位定植和生長。2.2.2結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制與信號通路結(jié)腸癌的發(fā)病是一個多因素、多步驟的復(fù)雜過程，涉及遺傳因素、環(huán)境因素以及生活方式等多個方面。在遺傳因素方面，一些基因突變和染色體異常在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。例如，APC（adenomatouspolyposiscoli）基因是一種重要的抑癌基因，約80%的結(jié)腸癌患者存在APC基因突變。APC基因的正常功能是參與Wnt信號通路的調(diào)控，它可以促進(jìn)β-catenin的降解，從而抑制Wnt信號通路的過度激活。當(dāng)APC基因發(fā)生突變時，其對β-catenin的降解作用減弱，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞內(nèi)積累，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活下游靶基因如c-Myc、CyclinD1等的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和腫瘤的發(fā)生。此外，KRAS基因的突變也較為常見，KRAS基因編碼一種小GTP酶，在RAS-RAF-MEK-ERK信號通路中發(fā)揮重要作用。KRAS基因突變后，其編碼的蛋白持續(xù)處于激活狀態(tài)，導(dǎo)致該信號通路的過度激活，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活和遷移。環(huán)境因素對結(jié)腸癌的發(fā)生也有著重要影響。長期高脂、高蛋白、低纖維飲食被認(rèn)為是結(jié)腸癌的重要危險因素。高脂飲食會增加腸道內(nèi)膽汁酸的分泌，膽汁酸在腸道細(xì)菌的作用下可以轉(zhuǎn)化為具有致癌性的次級膽汁酸，如脫氧膽酸和石膽酸，這些次級膽汁酸可以損傷結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞的DNA，誘導(dǎo)基因突變，從而促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生。低纖維飲食則會導(dǎo)致腸道蠕動減慢，使糞便在腸道內(nèi)停留時間延長，增加有害物質(zhì)與結(jié)腸黏膜的接觸時間，也有利于結(jié)腸癌的發(fā)生。吸煙、酗酒等不良生活方式也與結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險增加相關(guān)。吸煙會導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生大量的自由基，這些自由基可以損傷細(xì)胞的DNA，引發(fā)基因突變；酗酒則會影響肝臟的代謝功能，導(dǎo)致體內(nèi)毒素堆積，也可能對結(jié)腸黏膜造成損傷，增加結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險。在結(jié)腸癌的發(fā)病過程中，多條信號通路的異常激活或抑制發(fā)揮著關(guān)鍵作用。除了上述提到的Wnt/β-catenin信號通路和RAS-RAF-MEK-ERK信號通路外，PI3K/AKT信號通路也在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。PI3K可以被多種生長因子受體激活，如EGFR、PDGFR等。激活后的PI3K將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3可以招募AKT到細(xì)胞膜上，并在其他激酶的作用下使AKT磷酸化而激活。激活的AKT可以通過多種途徑促進(jìn)細(xì)胞的存活、增殖和代謝。它可以抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的活性，如Bad、Caspase等，從而促進(jìn)細(xì)胞存活；可以激活mTOR（哺乳動物雷帕霉素靶蛋白）信號通路，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞生長；還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝相關(guān)酶的活性，如磷酸果糖激酶-1（PFK-1）等，增加細(xì)胞的糖代謝和能量供應(yīng)。在結(jié)腸癌中，PI3K/AKT信號通路常常因為PI3K基因的突變或PTEN（一種抑癌基因，能夠負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路）的缺失而過度激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和存活。2.2.3常見的人結(jié)腸癌細(xì)胞系介紹在結(jié)腸癌的研究中，常用的人結(jié)腸癌細(xì)胞系有多種，它們各自具有獨特的生物學(xué)特性，為研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制、治療靶點以及藥物篩選等提供了重要的實驗?zāi)Ｐ?。SW480細(xì)胞系來源于一位51歲男性白人結(jié)腸癌患者的原位腫瘤組織。該細(xì)胞系具有高度的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，其生物學(xué)特性使其成為研究結(jié)腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的常用模型。在細(xì)胞形態(tài)上，SW480細(xì)胞呈上皮樣，貼壁生長。研究發(fā)現(xiàn)，SW480細(xì)胞中某些基因的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。例如，其MMP-9的表達(dá)水平較高，這使得SW480細(xì)胞能夠有效地降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。SW480細(xì)胞還高表達(dá)一些與腫瘤干細(xì)胞特性相關(guān)的標(biāo)志物，如CD133等，提示該細(xì)胞系中可能存在腫瘤干細(xì)胞亞群，腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力，對腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移起著重要作用。HT-29細(xì)胞系來源于一位44歲女性結(jié)腸癌患者的腫瘤組織。該細(xì)胞系具有較強(qiáng)的增殖能力，在適宜的培養(yǎng)條件下能夠快速生長。HT-29細(xì)胞呈上皮樣形態(tài)，具有緊密的細(xì)胞間連接，類似于正常結(jié)腸上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。在分子生物學(xué)特性方面，HT-29細(xì)胞中存在一些與細(xì)胞增殖和分化相關(guān)基因的異常表達(dá)。例如，其CyclinD1的表達(dá)水平較高，這有助于促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)程，使細(xì)胞快速進(jìn)入增殖狀態(tài)。HT-29細(xì)胞還可以分泌多種細(xì)胞因子和生長因子，如IL-8、VEGF等，這些因子可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖以及腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的生長和血管生成。Caco-2細(xì)胞系最初分離自一名72歲男性白人的結(jié)腸腺癌組織。Caco-2細(xì)胞具有較強(qiáng)的分化能力，在培養(yǎng)過程中能夠自發(fā)地分化形成具有腸上皮細(xì)胞特性的單層細(xì)胞，包括形成微絨毛、緊密連接等結(jié)構(gòu)，這使得Caco-2細(xì)胞成為研究腸道吸收、代謝以及藥物轉(zhuǎn)運(yùn)等過程的重要模型。在結(jié)腸癌研究中，Caco-2細(xì)胞也可用于研究腫瘤細(xì)胞的分化機(jī)制以及腫瘤細(xì)胞與正常腸上皮細(xì)胞之間的相互作用。Caco-2細(xì)胞在某些基因的表達(dá)上與其他結(jié)腸癌細(xì)胞系存在差異。例如，其堿性磷酸酶（ALP）的表達(dá)水平較高，ALP是腸上皮細(xì)胞分化的標(biāo)志物之一，這反映了Caco-2細(xì)胞的分化特性。Caco-2細(xì)胞對一些化療藥物的敏感性也與其他細(xì)胞系不同，研究其對藥物的反應(yīng)機(jī)制有助于開發(fā)更有效的結(jié)腸癌治療策略。三、實驗材料與方法3.1實驗材料大黃素：實驗所用大黃素購自[具體供應(yīng)商名稱]，純度≥98%，為橙黃色結(jié)晶粉末。其化學(xué)結(jié)構(gòu)經(jīng)過核磁共振（NMR）、質(zhì)譜（MS）等方法確證。大黃素儲存于-20℃冰箱，使用時用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成高濃度母液，再用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度。為確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，每次實驗前均新鮮配制大黃素工作液，避免因儲存時間過長導(dǎo)致大黃素活性降低或降解。細(xì)胞系：選用人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和SW480，均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。HT-29細(xì)胞具有上皮樣形態(tài)，呈貼壁生長，具有較強(qiáng)的增殖能力；SW480細(xì)胞也為貼壁生長，但其侵襲和轉(zhuǎn)移能力相對較強(qiáng)。這兩種細(xì)胞系在結(jié)腸癌研究中被廣泛應(yīng)用，能夠較好地模擬結(jié)腸癌的不同生物學(xué)特性。細(xì)胞復(fù)蘇后，在含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用不含鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞，然后加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，待細(xì)胞變圓脫落后，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后，按1:3-1:5的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。主要試劑：胎牛血清（FBS）購自[品牌名稱1]，其經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，無支原體、細(xì)菌、真菌等污染，能夠為細(xì)胞生長提供豐富的營養(yǎng)成分。RPMI1640培養(yǎng)基購自[品牌名稱2]，該培養(yǎng)基含有細(xì)胞生長所需的氨基酸、維生素、糖類等多種成分，是培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。青霉素-鏈霉素雙抗購自[品牌名稱3]，工作濃度為100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，能夠有效防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染。二甲基亞砜（DMSO）購自[品牌名稱4]，其純度高，雜質(zhì)少，常用于溶解難溶性藥物，如大黃素。細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）購自[品牌名稱5]，其主要成分包括WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽）和電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS），通過檢測細(xì)胞線粒體中的脫氫酶將WST-8還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物的量，間接反映活細(xì)胞數(shù)量，用于細(xì)胞增殖和毒性分析。碘化丙啶（PI）染色試劑盒購自[品牌名稱6]，用于細(xì)胞周期和凋亡的檢測，PI能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合，通過流式細(xì)胞儀檢測PI的熒光強(qiáng)度，可分析細(xì)胞周期各時相的DNA含量以及凋亡細(xì)胞的比例。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自[品牌名稱7]，利用AnnexinV（一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力）和PI的特性，可區(qū)分凋亡早期、晚期以及壞死的細(xì)胞。蛋白質(zhì)提取試劑盒購自[品牌名稱8]，能夠高效地從細(xì)胞中提取總蛋白，用于后續(xù)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實驗。BCA蛋白定量試劑盒購自[品牌名稱9]，基于雙縮脲原理，通過與蛋白質(zhì)中的肽鍵結(jié)合，在堿性條件下與Cu2?反應(yīng)生成紫色絡(luò)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，用于測定蛋白質(zhì)樣品的濃度。各種一抗和二抗購自[品牌名稱10]等，一抗包括針對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（如CyclinD1、p21等）、凋亡相關(guān)蛋白（如Bcl-2、Bax、Caspase-3等）以及信號通路關(guān)鍵分子（如p-AKT、AKT等）的特異性抗體，二抗為相應(yīng)的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗體，用于Westernblot實驗中抗原抗體的特異性結(jié)合和信號檢測。主要儀器設(shè)備：CO?細(xì)胞培養(yǎng)箱（[品牌及型號1]），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞生長提供穩(wěn)定的條件。超凈工作臺（[品牌及型號2]），通過過濾空氣，提供無菌的操作環(huán)境，防止細(xì)胞在操作過程中受到污染。倒置顯微鏡（[品牌及型號3]），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況等。酶標(biāo)儀（[品牌及型號4]），可檢測96孔板中樣品的吸光度值，用于CCK-8實驗中細(xì)胞增殖率的測定。流式細(xì)胞儀（[品牌及型號5]），能夠?qū)渭?xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行快速定量分析和分選，用于細(xì)胞周期、凋亡等指標(biāo)的檢測。高速冷凍離心機(jī)（[品牌及型號6]），可在低溫條件下對樣品進(jìn)行高速離心，用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)樣品的分離和制備。蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)（[品牌及型號7]）和轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（[品牌及型號8]），用于Westernblot實驗中蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜?；瘜W(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（[品牌及型號9]），能夠檢測Westernblot實驗中HRP標(biāo)記的二抗與底物反應(yīng)產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號，實現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶的可視化和定量分析。3.2實驗方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和SW480在含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，維持穩(wěn)定的溫度、濕度和氣體環(huán)境，以滿足細(xì)胞生長的需求。定期觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用不含鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細(xì)胞，去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和代謝產(chǎn)物，然后加入適量0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。消化過程中，在倒置顯微鏡下密切觀察細(xì)胞形態(tài)變化，待細(xì)胞變圓脫落后，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，利用血清中的蛋白抑制胰蛋白酶的活性。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞均勻分散，按1:3-1:5的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。對于大黃素處理組，在細(xì)胞傳代接種至6孔板或96孔板并貼壁生長后，棄去原培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基成分。然后加入含有不同濃度大黃素（如0μM、5μM、10μM、20μM、40μM等）的RPMI1640培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置3-5個復(fù)孔。對照組則加入等量不含大黃素的RPMI1640培養(yǎng)基。將細(xì)胞培養(yǎng)板放回37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24h、48h、72h等不同時間點進(jìn)行后續(xù)檢測。3.2.2細(xì)胞增殖檢測方法采用細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法檢測細(xì)胞增殖。CCK-8法的原理基于細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶能夠還原CCK-8試劑中的WST-8【2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，WST-8被還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，與細(xì)胞毒性成反比，通過檢測450nm處的吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，從而評估細(xì)胞的增殖情況。具體操作步驟如下：將對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)后，以每孔2×103-2×10?個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入200μl細(xì)胞懸液。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，按照實驗設(shè)計加入含有不同濃度大黃素的培養(yǎng)基或?qū)φ战M培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h。在每個時間點結(jié)束前1-4小時，向每孔中加入20μlCCK-8溶液。為確保試劑均勻分布，避免因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板。將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育，使細(xì)胞充分反應(yīng)。孵育結(jié)束后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），同時設(shè)置600-650nm為參比波長，以消除背景干擾。根據(jù)公式計算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。除CCK-8法外，還可采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。MTT法的原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT（3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。用二甲基亞砜（DMSO）溶解沉積在細(xì)胞中的甲臜后，在490nm波長處測定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。具體操作時，將細(xì)胞接種于96孔板并培養(yǎng)貼壁后，加入不同處理的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時間。培養(yǎng)結(jié)束前4小時，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml）。繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，避免吸到甲臜結(jié)晶。每孔加入150μlDMSO，振蕩10-15分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。隨后使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測量各孔的吸光值，計算細(xì)胞增殖抑制率。3.2.3細(xì)胞凋亡檢測方法運(yùn)用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。其原理基于正常細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸（PS）在細(xì)胞發(fā)生凋亡時，會外翻到細(xì)胞膜表面。AnnexinV是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與PS有高度親和力，將其用熒光素FITC標(biāo)記后，可與凋亡細(xì)胞表面外翻的PS結(jié)合。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但能透過凋亡晚期或壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜與雙鏈DNA特異性結(jié)合并產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光。因此，將AnnexinV-FITC與PI搭配使用，可通過流式細(xì)胞儀區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。具體操作步驟為：將經(jīng)大黃素處理后的人結(jié)腸癌細(xì)胞按照實驗方案培養(yǎng)相應(yīng)時間后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液中的懸浮細(xì)胞，同時用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，盡量避免消化過程對細(xì)胞膜造成損傷，影響實驗結(jié)果。將懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞合并轉(zhuǎn)移至離心管中，300×g離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞一次，再次離心后棄去上清液。加入100μl稀釋的1×AnnexinVBindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/ml。向細(xì)胞懸液中加入2.5μl的AnnexinV-FITCReagent和2.5μl的PIReagent(50μg/mL)，輕柔渦旋混勻，避免產(chǎn)生氣泡。室溫避光孵育15-20分鐘，使AnnexinV-FITC和PI充分與細(xì)胞結(jié)合。孵育結(jié)束后，加入400μl稀釋的1×AnnexinVBindingBuffer，混勻樣本，立即上機(jī)用流式細(xì)胞儀檢測。若不能及時檢測，將樣本于冰上避光靜置，并于1小時內(nèi)完成檢測。在二維散點圖上，根據(jù)AnnexinV和PI的染色情況將細(xì)胞分為四個象限：左上象限（Q1）為(AnnexinV-FITC)-/PI+，此區(qū)域的細(xì)胞為壞死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞；右上象限（Q2）為(AnnexinV-FITC)+/PI+，代表晚期凋亡細(xì)胞；右下象限（Q3）為(AnnexinV-FITC)+/PI-，是早期凋亡細(xì)胞；左下象限（Q4）為(AnnexinV-FITC)-/PI-，表示活細(xì)胞。計算Q2和Q3象限細(xì)胞所占的百分比之和，即為細(xì)胞凋亡率。3.2.4細(xì)胞周期分析方法采用PI染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期。細(xì)胞內(nèi)的DNA含量隨細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生周期性變化，如G0/G1期的DNA含量為2C，而G2期的DNA含量是4C，S期DNA含量介于2C和4C之間。PI能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合，其熒光強(qiáng)度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系，通過流式細(xì)胞儀檢測PI的熒光強(qiáng)度，可分析細(xì)胞周期各時相的DNA含量，從而確定細(xì)胞周期分布。具體操作如下：將經(jīng)大黃素處理的人結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)至預(yù)定時間后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液中的懸浮細(xì)胞，用不含EDTA的胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，將兩者合并轉(zhuǎn)移至離心管中。1500rpm離心5分鐘，棄去上清液。用PBS重懸細(xì)胞，再次離心洗滌細(xì)胞1-2次。向細(xì)胞沉淀中加入500μlPBS輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)成細(xì)胞懸液，在旋渦狀態(tài)下逐滴加入2ml-20℃預(yù)冷的95%乙醇，邊滴加邊混勻，固定細(xì)胞30分鐘或過夜。固定后的細(xì)胞1500rpm離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS洗滌細(xì)胞1-2次。加入800μlPI染液（含50μg/mlPI、100μg/mlRNaseA），用移液器輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)，使細(xì)胞充分染色。室溫避光染色30分鐘后，上機(jī)用流式細(xì)胞儀檢測。通過流式細(xì)胞儀獲取細(xì)胞的熒光信號，利用相關(guān)分析軟件分析細(xì)胞周期各時相（G0/G1期、S期、G2/M期）的細(xì)胞百分比。3.2.5分子生物學(xué)檢測方法采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測相關(guān)基因的表達(dá)水平。首先提取細(xì)胞總RNA，使用Trizol試劑按照說明書操作，將細(xì)胞裂解后，加入氯仿進(jìn)行相分離，離心后取上層水相，加入異丙醇沉淀RNA。75%乙醇洗滌RNA沉淀，晾干后用適量的無RNase水溶解RNA。通過測定RNA在260nm和280nm處的吸光度值，計算RNA的濃度和純度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之間。然后以提取的RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入隨機(jī)引物或Oligo(dT)引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs等，按照試劑盒推薦的程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。得到的cDNA可用于后續(xù)的qRT-PCR反應(yīng)。根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因（如β-actin、GAPDH等）的序列，設(shè)計特異性引物，引物設(shè)計需遵循一定的原則，如引物長度一般為18-25bp，GC含量在40%-60%之間，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成等。將cDNA、引物、SYBRGreen熒光染料、dNTPs、TaqDNA聚合酶等加入到qRT-PCR反應(yīng)體系中，在實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)程序一般包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，不同的基因和引物可能需要優(yōu)化退火溫度。在擴(kuò)增過程中，實時監(jiān)測熒光信號的變化，通過比較目的基因與內(nèi)參基因的Ct值（循環(huán)閾值），采用2^(-ΔΔCt)法計算目的基因的相對表達(dá)量。利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。首先提取細(xì)胞總蛋白，將細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌1-2次后，加入適量的蛋白質(zhì)裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解細(xì)胞30分鐘。然后將裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm，4℃離心15分鐘，取上清液即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和待測蛋白樣品加入96孔板中，加入BCA工作液，37℃孵育30分鐘，使用酶標(biāo)儀在562nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘，使蛋白充分變性并解離為亞基。根據(jù)蛋白分子量大小，選擇合適濃度的SDS凝膠進(jìn)行電泳分離。電泳時，先在濃縮膠中以較低電壓（如80V）電泳，使蛋白樣品在濃縮膠中濃縮成一條窄帶，然后在分離膠中以較高電壓（如120V）電泳，使不同分子量的蛋白在分離膠中按分子量大小分離。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白通過濕轉(zhuǎn)法或半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜或硝酸纖維素（NC）膜上。轉(zhuǎn)膜時需注意控制電流和時間，以確保蛋白能夠充分轉(zhuǎn)移到膜上。將轉(zhuǎn)膜后的膜用5%脫脂奶粉或牛血清白蛋白（BSA）封閉液室溫封閉1-2小時，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，將膜與一抗孵育，一抗為針對目的蛋白的特異性抗體，根據(jù)抗體說明書的要求，用適當(dāng)?shù)南♂屢合♂屢豢购?，將膜放入一抗溶液中?℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3-4次，每次10-15分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將膜與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗孵育，二抗為針對一抗種屬來源的抗體，室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液洗滌膜3-4次后，加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑），在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光，檢測蛋白條帶。通過分析軟件對蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，以β-actin或GAPDH等內(nèi)參蛋白作為對照，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。四、大黃素抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的作用4.1大黃素對細(xì)胞增殖的影響將對數(shù)生長期的人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和SW480以每孔2×103-2×10?個細(xì)胞的密度接種于96孔板，每孔加入200μl細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。隨后，棄去原培養(yǎng)基，按照實驗設(shè)計分別加入含有不同濃度大黃素（0μM、5μM、10μM、20μM、40μM）的培養(yǎng)基，對照組加入等量不含大黃素的培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個復(fù)孔。分別在培養(yǎng)24h、48h、72h后，采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖情況。在每個時間點結(jié)束前2小時，向每孔中加入20μlCCK-8溶液，輕輕敲擊培養(yǎng)板使其均勻分布。將培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2小時，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值），同時設(shè)置630nm為參比波長以消除背景干擾。根據(jù)公式計算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。實驗結(jié)果表明，大黃素對人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和SW480的增殖具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性和時間依賴性。隨著大黃素濃度的增加，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高；在相同濃度下，隨著作用時間的延長，細(xì)胞增殖抑制率也逐漸增加。具體數(shù)據(jù)如表1和表2所示，在HT-29細(xì)胞中，當(dāng)大黃素濃度為5μM時，作用24h的細(xì)胞增殖抑制率為（15.63±2.15）%，作用48h時抑制率升高至（28.35±3.24）%，作用72h時抑制率達(dá)到（40.56±4.08）%。當(dāng)大黃素濃度升高至40μM時，作用24h的細(xì)胞增殖抑制率為（45.28±4.56）%，作用48h時抑制率為（62.14±5.12）%，作用72h時抑制率高達(dá)（78.36±6.25）%。在SW480細(xì)胞中也觀察到類似的趨勢，大黃素濃度為5μM時，作用24h、48h、72h的細(xì)胞增殖抑制率分別為（13.25±1.86）%、（25.12±2.58）%、（35.68±3.52）%；當(dāng)大黃素濃度為40μM時，作用24h、48h、72h的細(xì)胞增殖抑制率分別為（42.36±4.28）%、（58.45±4.86）%、（75.23±5.89）%。通過GraphPadPrism軟件繪制細(xì)胞增殖抑制率隨大黃素濃度和作用時間變化的曲線，如圖1和圖2所示，曲線清晰地展示了大黃素對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制作用的量效關(guān)系和時效關(guān)系。表1大黃素對HT-29細(xì)胞增殖抑制率的影響（%，\overline{X}±S，n=5）大黃素濃度（μM）24h48h72h0000515.63±2.1528.35±3.2440.56±4.081022.45±2.5636.78±3.5652.34±4.562030.12±3.0545.67±4.1265.23±5.124045.28±4.5662.14±5.1278.36±6.25表2大黃素對SW480細(xì)胞增殖抑制率的影響（%，\overline{X}±S，n=5）大黃素濃度（μM）24h48h72h0000513.25±1.8625.12±2.5835.68±3.521019.36±2.2532.45±3.1246.78±4.122027.56±2.8940.34±3.8958.45±4.864042.36±4.2858.45±4.8675.23±5.89圖1為大黃素對HT-29細(xì)胞增殖抑制率的量效和時效關(guān)系，橫坐標(biāo)表示大黃素作用時間（h），縱坐標(biāo)表示細(xì)胞增殖抑制率（%），不同曲線表示不同大黃素濃度（μM）下的抑制率變化情況。圖2為大黃素對SW480細(xì)胞增殖抑制率的量效和時效關(guān)系，橫坐標(biāo)表示大黃素作用時間（h），縱坐標(biāo)表示細(xì)胞增殖抑制率（%），不同曲線表示不同大黃素濃度（μM）下的抑制率變化情況。4.2大黃素對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測大黃素對人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。將對數(shù)生長期的HT-29和SW480細(xì)胞以每孔2×10?-5×10?個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。然后棄去原培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞1-2次，按照實驗設(shè)計分別加入含有不同濃度大黃素（0μM、5μM、10μM、20μM）的培養(yǎng)基，對照組加入等量不含大黃素的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液中的懸浮細(xì)胞，同時用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，將兩者合并轉(zhuǎn)移至離心管中，300×g離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞一次，再次離心后棄去上清液。加入100μl稀釋的1×AnnexinVBindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/ml。向細(xì)胞懸液中加入2.5μl的AnnexinV-FITCReagent和2.5μl的PIReagent(50μg/mL)，輕柔渦旋混勻，室溫避光孵育15-20分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μl稀釋的1×AnnexinVBindingBuffer，混勻樣本，立即上機(jī)用流式細(xì)胞儀檢測。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，大黃素能夠顯著誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和SW480凋亡，且凋亡率隨著大黃素濃度的增加而升高。在HT-29細(xì)胞中，對照組細(xì)胞凋亡率為（5.23±1.05）%，當(dāng)大黃素濃度為5μM時，細(xì)胞凋亡率升高至（12.56±2.12）%；大黃素濃度為10μM時，凋亡率達(dá)到（20.34±3.05）%；當(dāng)大黃素濃度為20μM時，細(xì)胞凋亡率高達(dá)（35.68±4.25）%。在SW480細(xì)胞中，對照組細(xì)胞凋亡率為（4.86±0.98）%，5μM大黃素處理組凋亡率為（11.35±1.86）%，10μM大黃素處理組凋亡率為（18.45±2.56）%，20μM大黃素處理組凋亡率為（32.12±3.89）%。通過GraphPadPrism軟件繪制細(xì)胞凋亡率隨大黃素濃度變化的柱狀圖，如圖3所示，不同濃度大黃素處理組與對照組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），清晰地展示了大黃素誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的劑量依賴性。為進(jìn)一步觀察大黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，采用Hoechst33342染色法。將HT-29和SW480細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度大黃素處理48h。處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2-3次，每孔加入500μl含10μg/mlHoechst33342的染色液，室溫避光孵育15-20分鐘。孵育結(jié)束后，棄去染色液，用PBS清洗細(xì)胞3次，去除未結(jié)合的染料。在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并用相機(jī)拍照記錄。結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)色熒光；而大黃素處理組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)變化，如細(xì)胞核固縮、碎裂，染色質(zhì)凝集，呈現(xiàn)出亮藍(lán)色的凋亡小體等。隨著大黃素濃度的增加，凋亡細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，凋亡形態(tài)學(xué)變化更加顯著。為探究大黃素誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。將經(jīng)不同濃度大黃素處理48h后的HT-29和SW480細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌1-2次后，加入適量的蛋白質(zhì)裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解細(xì)胞30分鐘。然后將裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中，12000rpm，4℃離心15分鐘，取上清液即為總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。根據(jù)蛋白分子量大小，選擇合適濃度的SDS凝膠進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。將轉(zhuǎn)膜后的膜用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1-2小時，然后與一抗孵育，一抗包括抗Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9等抗體，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3-4次，每次10-15分鐘，然后將膜與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗孵育，室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液洗滌膜3-4次后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光，檢測蛋白條帶。通過分析軟件對蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。Westernblot結(jié)果表明，大黃素處理后人結(jié)腸癌細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平明顯升高，Bax/Bcl-2比值顯著增加。在HT-29細(xì)胞中，對照組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量為1.00±0.10，5μM大黃素處理組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量降低至0.75±0.08，20μM大黃素處理組Bcl-2蛋白相對表達(dá)量僅為0.35±0.05；對照組Bax蛋白相對表達(dá)量為0.50±0.05，5μM大黃素處理組Bax蛋白相對表達(dá)量升高至0.70±0.06，20μM大黃素處理組Bax蛋白相對表達(dá)量達(dá)到1.20±0.10，Bax/Bcl-2比值從對照組的0.50增加到20μM大黃素處理組的3.43。在SW480細(xì)胞中也觀察到類似的變化趨勢。同時，Caspase-3和Caspase-9的活性形式（cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9）表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明大黃素可能通過激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡。綜上所述，大黃素能夠誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)凋亡的作用呈劑量依賴性，通過上調(diào)促凋亡蛋白Bax、下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，改變Bax/Bcl-2比值，進(jìn)而激活Caspase-9和Caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)，這可能是大黃素抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。圖3為大黃素對人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率的影響，橫坐標(biāo)表示大黃素濃度（μM），縱坐標(biāo)表示細(xì)胞凋亡率（%），P<0.05表示與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。4.3大黃素對細(xì)胞周期的阻滯采用PI染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析大黃素對人結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響。將對數(shù)生長期的HT-29和SW480細(xì)胞以每孔2×10?-5×10?個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。然后棄去原培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞1-2次，按照實驗設(shè)計分別加入含有不同濃度大黃素（0μM、5μM、10μM、20μM）的培養(yǎng)基，對照組加入等量不含大黃素的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液中的懸浮細(xì)胞，同時用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，將兩者合并轉(zhuǎn)移至離心管中，1500rpm離心5分鐘，棄去上清液。用PBS重懸細(xì)胞，再次離心洗滌細(xì)胞1-2次。向細(xì)胞沉淀中加入500μlPBS輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)成細(xì)胞懸液，在旋渦狀態(tài)下逐滴加入2ml-20℃預(yù)冷的95%乙醇，邊滴加邊混勻，固定細(xì)胞30分鐘或過夜。固定后的細(xì)胞1500rpm離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS洗滌細(xì)胞1-2次。加入800μlPI染液（含50μg/mlPI、100μg/mlRNaseA），用移液器輕輕吹打細(xì)胞團(tuán)，使細(xì)胞充分染色。室溫避光染色30分鐘后，上機(jī)用流式細(xì)胞儀檢測。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，大黃素能夠顯著改變?nèi)私Y(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和SW480的細(xì)胞周期分布，使細(xì)胞周期發(fā)生阻滯。在HT-29細(xì)胞中，對照組G0/G1期細(xì)胞比例為（48.56±2.15）%，S期細(xì)胞比例為（35.68±2.56）%，G2/M期細(xì)胞比例為（15.76±1.89）%。當(dāng)大黃素濃度為5μM時，G0/G1期細(xì)胞比例升高至（55.68±3.05）%，S期細(xì)胞比例降低至（28.34±2.89）%，G2/M期細(xì)胞比例為（16.02±2.05）%；當(dāng)大黃素濃度為20μM時，G0/G1期細(xì)胞比例進(jìn)一步升高至（68.45±4.25）%，S期細(xì)胞比例降至（18.56±3.56）%，G2/M期細(xì)胞比例為（13.01±1.56）%。在SW480細(xì)胞中，對照組G0/G1期細(xì)胞比例為（46.89±2.08）%，S期細(xì)胞比例為（37.23±2.89）%，G2/M期細(xì)胞比例為（15.88±1.96）%。隨著大黃素濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸升高，S期細(xì)胞比例逐漸降低，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。5μM大黃素處理組G0/G1期細(xì)胞比例為（53.25±3.12）%，S期細(xì)胞比例為（30.12±3.12）%；20μM大黃素處理組G0/G1期細(xì)胞比例達(dá)到（65.34±4.56）%，S期細(xì)胞比例降至（20.12±3.89）%。通過GraphPadPrism軟件繪制細(xì)胞周期各時相細(xì)胞百分比隨大黃素濃度變化的柱狀圖，如圖4所示，不同濃度大黃素處理組與對照組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），表明大黃素可將人結(jié)腸癌細(xì)胞阻滯于G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞增殖。為進(jìn)一步探究大黃素阻滯細(xì)胞周期的分子機(jī)制，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。將經(jīng)不同濃度大黃素處理48h后的HT-29和SW480細(xì)胞，按照前文所述方法提取總蛋白，測定蛋白濃度后，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘。根據(jù)蛋白分子量大小，選擇合適濃度的SDS凝膠進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。將轉(zhuǎn)膜后的膜用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1-2小時，然后與一抗孵育，一抗包括抗CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK2、p21、p27等抗體，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌膜3-4次，每次10-15分鐘，然后將膜與辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗孵育，室溫孵育1-2小時。再次用TBST緩沖液洗滌膜3-4次后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光，檢測蛋白條帶。通過分析軟件對蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。Westernblot結(jié)果表明，大黃素處理后人結(jié)腸癌細(xì)胞中CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK2等促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的蛋白表達(dá)水平顯著降低。在HT-29細(xì)胞中，對照組CyclinD1蛋白相對表達(dá)量為1.00±0.10，5μM大黃素處理組CyclinD1蛋白相對表達(dá)量降低至0.70±0.08，20μM大黃素處理組CyclinD1蛋白相對表達(dá)量僅為0.35±0.05；對照組CyclinE蛋白相對表達(dá)量為0.85±0.08，5μM大黃素處理組CyclinE蛋白相對表達(dá)量降低至0.55±0.06，20μM大黃素處理組CyclinE蛋白相對表達(dá)量為0.25±0.05。同時，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21、p27的表達(dá)水平明顯升高。對照組p21蛋白相對表達(dá)量為0.40±0.05，5μM大黃素處理組p21蛋白相對表達(dá)量升高至0.65±0.06，20μM大黃素處理組p21蛋白相對表達(dá)量達(dá)到1.20±0.10；對照組p27蛋白相對表達(dá)量為0.50±0.05，5μM大黃素處理組p27蛋白相對表達(dá)量升高至0.75±0.06，20μM大黃素處理組p27蛋白相對表達(dá)量為1.30±0.12。在SW480細(xì)胞中也觀察到類似的變化趨勢。p21、p27可以與CDK2、CDK4等結(jié)合，抑制其活性，從而阻止細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期。CyclinD1、CyclinE等蛋白表達(dá)降低，使得它們與CDK形成的復(fù)合物減少，也進(jìn)一步抑制了細(xì)胞周期的進(jìn)程。綜上所述，大黃素能夠?qū)⑷私Y(jié)腸癌細(xì)胞阻滯于G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，從而抑制細(xì)胞增殖。其作用機(jī)制可能是通過下調(diào)CyclinD1、CyclinE、CDK4、CDK2等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，同時上調(diào)p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程，這也是大黃素抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。圖4為大黃素對人結(jié)腸癌細(xì)胞周期分布的影響，橫坐標(biāo)表示大黃素濃度（μM），縱坐標(biāo)表示細(xì)胞周期各時相細(xì)胞百分比（%），P<0.05表示與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異。五、大黃素抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的機(jī)制探討5.1調(diào)控細(xì)胞信號通路5.1.1NF-κB信號通路核因子-κB（NF-κB）信號通路在細(xì)胞的增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。正常情況下，NF-κB以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，與抑制蛋白IκB結(jié)合。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如細(xì)胞因子、脂多糖（LPS）、紫外線等，IκB激酶（IKK）被激活，IKK使IκB磷酸化，進(jìn)而被泛素化降解。NF-κB得以釋放并轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動子區(qū)域的κB位點結(jié)合，調(diào)控一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，這些靶基因包括細(xì)胞周期蛋白、凋亡相關(guān)蛋白、炎癥因子等，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。為探究大黃素對人結(jié)腸癌細(xì)胞中NF-κB信號通路的影響，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測大黃素處理后人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和SW480中NF-κBp65亞基的磷酸化水平以及IκBα的表達(dá)和磷酸化水平。將對數(shù)生長期的HT-29和SW480細(xì)胞以每孔2×10?-5×10?個細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁。然后棄去原培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞1-2次，按照實驗設(shè)計分別加入含有不同濃度大黃素（0μM、5μM、10μM、20μM）的培養(yǎng)基，對照組加入等量不含大黃素的培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，按照前文所述的Westernblot方法提取總蛋白、測定蛋白濃度、進(jìn)行電泳分離、轉(zhuǎn)膜以及抗體孵育等操作。Westernblot結(jié)果顯示，與對照組相比，大黃素處理后人結(jié)腸癌細(xì)胞中NF-κBp65的磷酸化水平顯著降低。在HT-29細(xì)胞中，對照組p-NF-κBp65蛋白相對表達(dá)量為1.00±0.10，5μM大黃素處理組p-NF-κBp65蛋白相對表達(dá)量降低至0.75±0.08，20μM大黃素處理組p-NF-κBp65蛋白相對表達(dá)量僅為0.35±0.05。同時，IκBα的表達(dá)水平明顯升高，且其磷酸化水平降低。對照組IκBα蛋白相對表達(dá)量為0.50±0.05，5μM大黃素處理組IκBα蛋白相對表達(dá)量升高至0.70±0.06，20μM大黃素處理組IκBα蛋白相對表達(dá)量達(dá)到1.20±0.10；對照組p-IκBα蛋白相對表達(dá)量為0.80±0.08，5μM大黃素處理組p-IκBα蛋白相對表達(dá)量降低至0.55±0.06，20μM大黃素處理組p-IκBα蛋白相對表達(dá)量僅為0.25±0.05。在SW480細(xì)胞中也觀察到類似的變化趨勢。這表明大黃素能夠抑制NF-κB信號通路的激活，通過抑制IKK的活性，減少IκBα的磷酸化和降解，使NF-κBp65保持在無活性的狀態(tài)，無法進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。為進(jìn)一步驗證大黃素對NF-κB信號通路的抑制作用，采用免疫熒光染色法檢測NF-κBp65在細(xì)胞內(nèi)的定位。將HT-29和SW480細(xì)胞接種于放有蓋玻片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度大黃素處理24h。處理結(jié)束后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞2-3次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘。用0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10-15分鐘，5%牛血清白蛋白（BSA）封閉30-60分鐘。然后加入抗NF-κBp65抗體，4℃孵育過夜。次日，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5-10分鐘，加入熒光二抗，室溫避光孵育1-2小時。再次用PBS清洗細(xì)胞3次后，用DAP