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流式細胞儀實驗操作及應(yīng)用目

錄01

流式基本原理02樣本制備03

上機檢測04

流式具體應(yīng)用

01

PART

流式基本原理1.1流式細胞術(shù)簡介（FlowCytometry）HUMANLargerSmallerPartec儀器的檢測范圍

0.05um-200um。流式細胞術(shù)（FlowCytometry，F(xiàn)CM）是以流式細胞儀為檢測手段，在流動狀態(tài)下，對單個細胞(或生物學(xué)顆粒)的理化特性進行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。1.1流式細胞術(shù)簡介（FlowCytometry）HUMAN1.1流式細胞術(shù)簡介（FlowCytometry）HUMAN分析型流式細胞儀細胞樣本分析后最終進入廢液桶，不能回收利用。分選型流式細胞儀既能流式分析，還能對分析的目的細胞進行分選；進樣管道較長，還需要保持無菌狀態(tài)，所以分選型流式細胞儀一般只用于分選。1.1流式細胞術(shù)簡介（FlowCytometry）HUMAN1.2流式細胞流體學(xué)系統(tǒng)HUMAN流動室(flowcell,flowchamber)是流式細胞儀的核心部件。流動室中，被測細胞逐個通過，并在此與激光正交。進樣孔熒光信號激光束鞘液Sheath流動室結(jié)構(gòu)圖：單細胞發(fā)生器1.3.光學(xué)系統(tǒng)——散射光的作用HUMANHUMAN實驗中，常利用FSC和SSC這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細胞群體，去除碎片、死細胞和粘連細胞的干擾。粒細胞單核細胞淋巴細胞紅細胞、死細胞和碎片1.3.1散射光的作用1.3.2熒光信號檢測HUMAN1.3.3熒光信號通道選擇HUMAN通道(channel)

一個光電檢測器就是一個通道，有多少個光電二極管/倍增管，就有多少個通道：散射光通道:FSC通道和SSC通道；熒光通道通道命名方式：以FL(fluorescence)加數(shù)字命名，如FL1、FL2、FL3等。以該通道接收的主要熒光素命名，如FITC通道、PE通道、APC通道等。Forexample：CyFlow?Cube6有488nm和638nm兩根激光器，488nm能檢測FSC、SSC、FL1(FITC)、FL2(PE)、FL3(PerCP)，638能檢測FL4(APC)，代表Cube6有6個通道，最多能同時檢測4個熒光，6種參數(shù)。1.3.4常用熒光素HUMAN<499nm藍色熒光（Blue）；

500-549nm，綠色熒光（Green）；550-584nm，黃色熒光（Yellow）；

585-615nm，橙色熒光（Orange）；616-700nm，紅色熒光（Red）；

≥700nm，遠紅外熒光（Far-Red）。標(biāo)記抗體的熒光素?zé)晒馑胤肿蛹ぐl(fā)光波長（nm）發(fā)射光波長（nm）通道選擇中文名FITC490520FL1異硫氰酸熒光素PE488575FL2藻紅蛋白PerCP490675FL3多甲藻葉綠素蛋白APC650660FL4別藻青蛋白PE-Cy5496/546670FL4藻紅蛋白-花青素5PE-Cy7496/546767FL4藻紅蛋白-花青素71.4電子學(xué)系統(tǒng)HUMAN

02

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樣本制備2.1單細胞懸液制備HUMAN2.2免疫熒光染色HUMAN熒光素偶聯(lián)抗體抗體上偶聯(lián)熒光素(FITC、PE等)，通過抗原抗體反應(yīng)讓目標(biāo)細胞特異性的帶上熒光。染色過程即抗原抗體反應(yīng)過程。熒光染料/熒光化合物PI、DAPI等插入核酸鏈中；CFSE和蛋白質(zhì)共價結(jié)合；AnnexinV-FITC檢測凋亡。熒光蛋白如GFP，不需要染色，直接檢測。2.2免疫熒光染色HUMAN一般檢測時，獲取1～2萬個細胞，標(biāo)記0.5～1×106細胞即可。下述情況細胞量需相應(yīng)增加：檢測胞內(nèi)/核內(nèi)抗原，離心次數(shù)多；細胞周期乙醇固定損失細胞多；檢測細胞在標(biāo)本中比例低0.5～1×106個細胞孵育體積50-100ul上機體積200-500ul終濃度約1×106個/ml加染料洗滌后補加液體

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流式上機檢測3.1調(diào)節(jié)電壓/增益HUMAN3.2閾值設(shè)定HUMAN閾值Threshold：排除雜質(zhì)、細胞碎片或體積較小的死細胞。FSC反映細胞體積的大小，F(xiàn)CM應(yīng)用時常選取FSC設(shè)定閾值。5%32%默認閾值升高閾值后3.3

圈門HUMAN死細胞或碎片粘連細胞腫瘤細胞株FSC/SSC散點圖死細胞加藥處理后FSC/SSC散點圖通過FSC/SSC散點圖，gate出目標(biāo)細胞進行分析3.4調(diào)補償HUMAN不同熒光染料發(fā)射峰值不同，但發(fā)射譜范圍有一定的重疊，因而少量的熒光信號會被另一通道檢測到，這種現(xiàn)象就是光譜重疊(spectraloverlap)。FL1530/30FL2585/42發(fā)射波長FITC發(fā)射譜PE發(fā)射譜HUMAN實驗操作中，常利用電子技術(shù)和計算機軟件設(shè)置的方法將串入相鄰熒光通道的信號扣除，這種技術(shù)稱為熒光補償(fluorescencecompensation)。FL-1(FITC)FL-2(PE)FL-1(FITC)FL-2(PE)FL2-%FL1FL-1(FITC)FL-2(-)FL-1(-)FL-2(PE)FL1-%FL2通過單標(biāo)調(diào)節(jié)補償補償前補償后3.4調(diào)補償HUMAN未補償正確補償FITC-PE補償太大PE-FITC補償太大補償調(diào)節(jié)要合適3.4調(diào)補償3.5數(shù)據(jù)分析-畫圖HUMAN3.5數(shù)據(jù)分析-坐標(biāo)軸HUMAN由于光信號比較弱，需將其等比例放大，方便計算機分析處理，一般信號的放大可以使用線性或?qū)?shù)兩種方式。

線性(linear;lin)對數(shù)(logarithmic;log)一般FSC和SSC變異范圍較小，故使用線性放大；熒光信號變異范圍較大，多使用對數(shù)放大。

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具體應(yīng)用4.1周期檢測HUMAN4.1周期檢測HUMANHUMAN4.2細胞凋亡檢測和分析4.2細胞凋亡檢測和分析——對照設(shè)置HUMAN空白對照：設(shè)置空白對照（未染色的細胞），用以區(qū)分細胞的自發(fā)熒光和特異性熒光，避免假陽性的結(jié)果。Annexin-V單染組：調(diào)節(jié)補償，避免熒光信號串聯(lián)PI單染組：調(diào)節(jié)補償，避免熒光信號串聯(lián)雙染對照組雙染實驗組HUMAN1.用正常細胞摸索合適消化酶濃度和消化時間；2.盡量避免使用含EDTA的消化酶；如果使用了還有EDTA的消化酶需要充分洗滌3.需要收集上清中已經(jīng)浮起來的細胞，再用胰酶消化貼壁細胞；4.凋亡洗滌和染色都應(yīng)該用含鈣離子的專門緩沖液；5.當(dāng)樣本表達GFP時，禁用AnnexinV-FITC,推薦使用AnnexinV-APC/7-AAD染色6.與抗體結(jié)合不同，AnnexinV的結(jié)合不穩(wěn)定，所以在標(biāo)記結(jié)束后1-3小時內(nèi)必須要上機檢測；7.PI對細胞有一定的毒性，可在上機前5-10分鐘加入Pl染料：8.上機檢測前用300目篩過濾細胞懸液4.3Annexin-V/PI檢測細胞凋亡注意事項4.4數(shù)據(jù)分析處理HUMAN計算機進行數(shù)據(jù)的存儲CyView為Sysmex-Partec的獨有軟件，可對數(shù)據(jù)進行分析數(shù)據(jù)分析軟件：FC