IVIS小動物活體成像系統(tǒng)簡介及應(yīng)用目

錄01

成像系統(tǒng)與原理02操作流程03

具體應(yīng)用

01

PART

成像系統(tǒng)與原理活體光學(xué)成像系統(tǒng)--技術(shù)核心HUMAN無創(chuàng)性降低成本提升準確度長期連續(xù)動態(tài)高通量

提升效率分子影像HUMANHEALTHIENVIREMENTAL

HEALTHCurre

odology活體光學(xué)成像系統(tǒng)--技術(shù)優(yōu)勢HUMANLabeledProkaryoticCellsGeneticReportersSmartProbes是通過一定的方式對

研究對象進行光學(xué)標記，

使其具有發(fā)光的性質(zhì)，再通過成像技術(shù)及設(shè)備對光信號進行采集成像。HUMAN

HEALTHI

ENVIREMENTALHEALTH光學(xué)標記

成像技術(shù)及設(shè)備LabeledEukaryoticCellsLabeledProteins小動物活體光學(xué)成像活體光學(xué)成像系統(tǒng)HUMAN

主要采用生物發(fā)光(bioluminescence)與熒光(fluorescence)兩種技術(shù)。

生物發(fā)光是用熒光素酶基因標記細胞或DNA；

熒光技術(shù)則采用熒光報告基團(GFP、RFP、Cyt等)進行標記。

利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細胞活動和基因行為。熒光分子十激發(fā)光Bioluminescence熒光蛋白熒光探針

熒光染料熒光素酶熒光素酶十底物CARAd5encoding

luciferaseHUMAN

HEALTHIENVIREMENTALHEALTHlp:Substrate活體光學(xué)成像系統(tǒng)--標記方式HUMANHUMAN成像模式選擇-生物發(fā)光VS熒光熒光成像背景信號強度～9.5×103p/s光信號強度～7.1×107p/s信噪比～7500背景信號強度～1.0×10?p/s-光信號強度～7.8×10?p/s

-信噪比～7.83×106

PC3M-luc/DsRed

cells

injected

s.c.熒光成像靈敏度通常比生物發(fā)光成像低1000倍生物發(fā)光：靈敏度

熒光成像：信噪比T.L.Troy,et

al.(2004).Molecular

Imaging3:9-23.生物發(fā)光成像HUMAN成像模式選擇-生物發(fā)光VS熒光熒光素酶：

載體構(gòu)建

穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系

轉(zhuǎn)基因動物

熒光素酶底物：

成像設(shè)備：選擇螢光素酶種類

載體構(gòu)建

建立穩(wěn)定細胞系

細胞注射動物

注射底物

成像儀成像o

IVIS

Lumina

ⅢIo

IMIS

Lumina

S5

&X5o

IVIS

Spectrumo

IVISSpectrum

CT

cellsof

intereststablytransfect

withluciferaseconstructo

D-Lucuferino

Coelenterazine

ho

Inflammation

Probeo

………o

Firefly

Luciferaseo

Renilla

Luciferaseo

NanoLuc

LuciferaseInjectLuciferaseSubstrates生物發(fā)光活體成像試驗流程HUMANHUMAN三種常用熒光素酶差異o

Firefly

Luciferase螢火蟲熒光素酶發(fā)射波長560nm,體內(nèi)會紅移至610nm,

組織穿透性更好，適用于動物內(nèi)臟等較深部位的組織成像；o

Renilla

Luciferase海腎熒光素酶發(fā)射波長480nm,產(chǎn)生的藍光組織穿透能力較弱，適用于動物淺表組織成像；o

NanoLuc

Luciferase海蝦熒光素酶發(fā)射波長460nm,自然界提取光型號強度較弱，但有改良版本，適用于病毒等對報告基因片段大小有限制的標記場景。

Renilla….NanoLuc

FireflyHemoglobinμ?(cm1)Wavelength(nm)細胞生物發(fā)光效率測試-孔板定量HUMANHUMAN生物發(fā)光底物注射底

物

注

射

后10~20min

進入成像平臺期2h后信號消失底物注射后約2min

進入信號峰值強度數(shù)倍于腹腔注射

約30min

信號消失底物劑量：150mg

D-Luciferin/kg鼠體重對每個生物發(fā)光實驗動物模型，首先需測一條生物發(fā)光動力學(xué)曲線，得出最適成像時間點····

·尾靜脈注射腹腔注射·依據(jù)上述曲線選取最佳成像時間點?！ひ话闱闆r下，大多數(shù)實驗?zāi)Ｐ偷淖罴殉上駮r間點位于熒光素腹腔注射后10-20分鐘。1.

注射熒光素酶底物(建議在動物清醒時注射);2.

3min后，麻醉動物(建議使用氣體麻醉);3.

將麻醉后的動物放入成像倉中，在熒光素注射后約5min

時刻拍攝第一張圖片；4.

之后每2min

拍一張，持續(xù)拍攝60min,得到一條針對該實驗?zāi)Ｐ偷臒晒馑貏恿W(xué)曲線。原位和異位種植的Brain

tumor

的生物發(fā)光熒光素動力學(xué)曲線ROI

Flux(%)HUMAN生物發(fā)光動力學(xué)曲線HUMAN熒光-波長選擇（透過率和背景噪音）l=550nm[=610nm[=740nm[=840nmTissue

Autofluorescencehttp://www.drbio.cornell.edu300400500600700800errission

wavelength(nm)SNR=Signal/AutofluorescenceAlfalfa

Free

Rodent

FoodRegular

Foodexcitatiormuiltiphotonl=740nm1TPa1emine印

鳥

5TryptophanNADH,ElastinIipofuscinIrdolamineIndolaminescollagensFibrillinFlavinsdimers

Wavelength(nM)血紅蛋白和其他機體組分強烈吸收可見光。在近紅外區(qū)域，組織吸收顯著降低。Absorptioncoefficient

(cm--)

logscaleHUMAN熒光成像小鼠剃毛--降低光吸收Compromisedlocalzation

andquantifcation

offluorescenceDepilationrequiredNormal,haired

mouse

strains

BALB/c,C57BL/6etc...Depilation

not

requiredNudemiceSKH1-E剃毛作用：降低毛發(fā)光吸收和光散射；去除來自毛發(fā)的背景熒光實驗前一天剃毛

HUMAN生物發(fā)光成像小鼠剃毛--降低光吸收HUMAN小鼠剃毛方法·

c

使用剃毛器后的效果，基于剃毛刀頭的設(shè)計，有約1

mm

的體表絨毛無法剃除；·d

使用脫毛膏，可以將剩下的體表絨毛干凈地去除，用完脫毛膏后用紗布蘸溫水檫拭小鼠，避免脫毛膏的自發(fā)熒光干擾?！

剃毛前，體重16

g

(約4

week)Ballb/c雄性小鼠；·b

使用PerkinEImer剃毛器對小鼠進行剃毛；

02

PART

操作流程HUMAN小動物活體成像系統(tǒng)結(jié)構(gòu)組成HUMAN圖像獲取前期設(shè)置與機器降溫儀器需要進行自檢初始化HUMAN圖像獲取前期設(shè)置與機器預(yù)熱正在自動進行自檢初始化自檢通過表示儀器正常并為工作狀態(tài)HUMAN圖像獲取自動保存位置設(shè)置HUMAN生物發(fā)光圖像獲取HUMAN熒光圖像獲?。ㄩL波長熒光探針）HUMAN光譜分離技術(shù)不同探針信號光譜背景光分離結(jié)果

小動物活體熒光成像的一種關(guān)鍵技術(shù)，為了將探針信號與背景信號或不同探針信號區(qū)分開，實現(xiàn)對目標信號的觀測和定量分析。通過多光譜掃描成像獲取不同信號的光譜特征并利用分析算法對不同信號的光譜進行分離而實現(xiàn)。HUMAN熒光圖像獲?。ü庾V分離功能）HUMAN圖像處理-自適應(yīng)熒光背景扣除非特異性的光以一定角度從成像臺反射并通過濾光片漏光。HUMAN圖像處理-圖片加載成組將圖片設(shè)置為統(tǒng)一標尺HUMAN圖像處理-定量分析圖像調(diào)節(jié)亮度對比度透明度閾值調(diào)節(jié)標尺圖像保存HUMAN圖像處理-定量分析（生物發(fā)光）HUMAN圖像處理-定量分析（生物發(fā)光）生物發(fā)光標準統(tǒng)一單位平均信號強度HUMAN圖像處理-定量分析（熒光）熒光成像標準統(tǒng)一單位平均發(fā)光效率熒光成像標準統(tǒng)一單位

03

PART

具體應(yīng)用HUMAN應(yīng)用概述監(jiān)測疾病的發(fā)生發(fā)展及治療o

癌癥o

免疫性疾病o

感染性疾病o

代謝性疾病o

心血管疾病o

神經(jīng)疾病監(jiān)測細胞動態(tài)變化o

干細胞o

免疫細胞o

存活o

分布o

遷移o

靶向o

基因與疾病關(guān)系o

疾病信號通路o

細胞因子作用14探究疾病分子機制HUMANPhotons/sec101110101091081071061051048006004002000With

Bioware

Ultra

one

can

start

collecting

datafrom

Day0,while

with

caliper

measurementsone

has

to

wait

at

least

28

days

to

see

anytumorgrowth合理評價腫瘤的生長狀態(tài)——“看的早”高靈敏度：可監(jiān)測微量腫瘤

細胞和轉(zhuǎn)移位點Day0Day7Day

14Day21Day28Day35Day420

6

12

18

24

30

3642Days

postcell

implantBioware

Ultra:4T1-luc2TumorvolumeTumorvolumemm3Photons/sec5

cells腫瘤相關(guān)應(yīng)用HUMAN腫瘤相關(guān)應(yīng)用合理評價腫瘤的生長狀態(tài)——“看的準”Physicalmeasurement

(tumor

still

getting

bigger)Bio-photonic

imaging

(tumorcells

being

killed)瘤體雖然在變大，但實際內(nèi)部已經(jīng)凋亡壞死Mendeletal2003HUMAN抗腫瘤藥物評價Orthotopic

XenograftModel

ofLiver

Tumor(BLI)對入組進行實驗的造模動物進行腫瘤大小的篩查，剔除偏離均值過多的實驗對象46MICE為實驗分組提供合理依據(jù)HUMAN抗腫瘤藥物評價40MICECtrlLowMediumHighPositiveRandomizedGrouping為實驗分組提供合理依據(jù)HUMAN抗腫瘤藥物評價為實驗分組提供合理依據(jù)39

MICECtrlLowMediumHighPositiveAfterTreatmentHUMAN光譜分離的應(yīng)用hGem(1/110)hCdt(1/100)M

G2

G1Cell

cyclemiRFP670v1

miRFP709活體FUCCI監(jiān)測細胞周期

ExNATURE

COMMUNICATIONS,20167:12405Ratio

(miRFP670v1

channel)(miRFP70gchannel)去除組織背景熒光多標記熒光的拆分Shcherbakova

a