PAGEPAGEI酒酒球菌酸脅迫抗性突變菌株UVa32、UVas35特性分析摘要酒酒球菌是革蘭氏陽性細菌，屬于酒球菌屬，是引起并完成蘋果酸-乳酸發(fā)酵的主要微生物，在釀酒方面起著重要的作用，而蘋果酸-乳酸發(fā)酵能夠提高葡萄酒品質(zhì)，有降低酸度、修飾風味、增加生物穩(wěn)定性。但是酒精發(fā)酵結束后的葡萄酒生存環(huán)境是極其惡劣和復雜的，低pH值、高酒精濃度和高SO2等均會對酒酒球菌的生長和代謝造成影響[1]，因此酒酒球菌既需要具有良好的發(fā)酵能力，又應當具有良好的抗脅迫能力[2]。本實驗以酒酒球菌SD-2a、酸脅迫抗性突變菌株UVa32、UVas35為研究對象，將其培養(yǎng)在pH值不同的培養(yǎng)基中，通過檢測菌株SD-2a、UVa32和UVas35的生長情況、蘋果酸乳酸發(fā)酵速率，氨基酸代謝情況和β-葡萄糖苷酶活力變化，分析菌株SD-2a、UVa32和UVas35的特性并比較菌株間的特性差異。關鍵詞：酒酒球菌蘋果酸-乳酸發(fā)酵酸脅迫

Characteristicsofacidstressresistantmutantsuva32anduvas35ofOenococcusoeniAbstractAsagram-positivebacteriumbelongingtothegenusdioscococcus,Oenococcusoeniplaysanimportantroleinwinemakingandisthemainmicroorganismthatcausesandcompletesmalolacticfermentation，Andmalolacticfermentationcanimprovethequalityofthewine,hasaloweracidity,modifyflavor,increasethestabilityofthebiologicaleffects.Thelivingenvironmentofwineafteralcoholfermentationisextremelyharshandcomplex,andlowpHvalue,highalcoholconcentrationandhighSO2willaffectthegrowthandmetabolismofOenococcusoeni.ThisexperimentbyOenococcusoeniSD-2a,acidstressresistancemutationstrainsUVa32,UVas35astheresearchobject,itscultivationinthepHofthemedium,bydetectingstrainSD-2a,UVa32andUVas35growthsituation,malolacticfermentationrateandaminoacidmetabolismandβ-glycosidaseenzymeactivitychange,analysisofstrainSD-2a,UVa32andUVas35characteristicsandcomparethecharacteristicsofthedifferencesbetweenstrains.Keywords:Oenococcusoeni；Malolacticfermentation；Acidstress目錄文獻綜述 11.1蘋果酸-乳酸發(fā)酵 11.2酒酒球菌 2第二章材料與方法 32.1實驗材料與儀器 32.1.1實驗材料 3 2.1.2儀器與設備 32.2試驗方法 32.2.1生長曲線的測定 32.2.2β-葡萄糖苷酶活力測定 42.2.3蘋果酸測定 42.2.4氨基酸測定 4第三章結果與分析 53.1實驗結果及分析 53.1.1菌株生長曲線 53.1.2蘋果酸乳酸含量曲線 83.1.3β-葡萄糖苷酶活力 93.1.4氨基酸含量 93.2結論 103.3展望 11參考文獻 12謝辭 13第一章文獻綜述1.1蘋果酸-乳酸發(fā)酵蘋果酸-乳酸發(fā)酵，又被叫做MLF（MalolacticFermentation），是葡萄酒釀造過程中不可缺少的環(huán)節(jié)，當酒精發(fā)酵結束后，L-蘋果酸在蘋果酸乳酸酶的催化作用下直接轉變?yōu)長-乳酸，并且釋放出CO2，這個過程主要是由酒類酒球菌引起[3]。大多數(shù)紅葡萄酒、白葡萄酒和一些汽酒最終的質(zhì)量與蘋果酸-乳酸發(fā)酵緊密相連。在葡萄酒的釀造過程中，生葡萄酒的酸澀和粗糙感可以通過\t"/item/%E8%8B%B9%E6%9E%9C%E9%85%B8-%E4%B9%B3%E9%85%B8%E5%8F%91%E9%85%B5/_blank"蘋果酸-乳酸發(fā)酵降低，使葡萄酒的口感變得柔和、圓潤，并增加了葡萄酒的感官質(zhì)量和生物穩(wěn)定性，因此蘋果酸乳酸發(fā)酵成為許多優(yōu)質(zhì)紅葡萄酒甚至一些佐餐紅葡萄酒不可或缺的環(huán)節(jié)。因為地域氣候不同，不同地區(qū)的葡萄酒釀造過程也存在差異。在寒冷干燥的北方地區(qū)生長的水果酸度較高，釀造出的果酒口感較酸澀，因此需要進行蘋果酸乳酸發(fā)酵來改善其風味。而在溫和濕潤的南方地區(qū)生長的水果酸度較低，則不用進行蘋果酸乳酸發(fā)酵。pH、乙醇、氧和二氧化碳、溫度、SO2等是影響蘋果酸-乳酸發(fā)酵的因素，其中主要的因素是pH，它提供了質(zhì)子梯度，對哪些種類的乳酸菌出現(xiàn)也起到了決定作用，對微生物生長的速率也造成了一定的影響，當pH降低至一定程度時，就會抑制微生物的生長[4]。另外微生物的代謝也會被pH值的大小影響，當pH值處于3.2以下時蘋果酸被許多乳酸菌分解，當pH值為3.5時則開始糖的分解。當pH值為3.8時，蘋果酸-乳酸發(fā)酵的速率則高于pH3.8以下時的速率，當pH值為3.2時比當pH值為3.8時慢10倍。有些菌株耐酸性較強，在pH3.5以下的葡萄酒中，酒類酒球菌可以較好的生存和生長，而在較高的pH環(huán)境下片球菌和乳桿菌才可以生存和生長。蘋果酸-乳酸發(fā)酵對葡萄酒的品質(zhì)也有著很重要的作用，例如葡萄酒的酸度降低、微生物的穩(wěn)定性提高，以及葡萄酒的口感、色澤、香氣等發(fā)生改變都與蘋果酸-乳酸發(fā)酵有著巨大的關系。葡萄酒中的乳酸菌，尤其是酒酒球菌代謝產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶對葡萄酒香氣品質(zhì)的提升效果尤為顯著[5]。葡萄酒中經(jīng)蘋果酸-乳酸發(fā)酵后，含有氨基酸、益生菌、有機酸、多酚類物質(zhì)、高級醇和脂類等活性成分。1.2酒酒球菌一般將從葡萄酒中分離出來并自然存在的蘋果酸-乳酸菌分為四個屬，這四個屬分別為片球菌屬、明串珠菌屬、酒球菌屬和乳桿菌屬[6]，約包括40種菌。在葡萄酒中處于主導地位的是酒球菌屬，一般片球菌和乳桿菌的生長在低于pH3.5的環(huán)境中受到威脅，目前用于接種的乳酸菌幾乎均為酒球菌屬細菌。酒酒球菌屬是一種具有成對或成鏈排布的球型或者橢圓型細胞，革蘭氏陽性、兼性厭氧的化能有機營養(yǎng)型細菌，20℃～30℃是其最適生長溫度，可以在乙醇濃度為10%（v/v）的培養(yǎng)基中生長。酒酒球菌喜好偏酸性環(huán)境，pH值為4.8~5.5時為生長最適pH值[7]，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，酒酒球菌的細胞膜結構和成分會在低pH值環(huán)境下發(fā)生改變，進而抑制了菌株的生長[8-9]，但酒酒球菌一般在pH3.5～3.8葡萄汁和果酒中生長，其在起始pH4.8的條件下生長更好。葡萄酒中pH值一般低于3.5，因此對于酒酒球菌來說，葡萄酒是一個酸脅迫環(huán)境,pH值的高低限制了蘋果酸-乳酸發(fā)酵能否順利進行。酒酒球菌是導致并完成蘋果酸-乳酸發(fā)酵的重要菌種，但酒精發(fā)酵結束后的葡萄酒生存環(huán)境是具有威脅性的,酒酒球菌的生長和代謝會被低pH值、高酒精濃度和高SO2等所影響[1]。因此，酒酒球菌在葡萄酒生存環(huán)境中的抗脅迫能力及糖苷酶的活性，對蘋果酸-乳酸發(fā)酵的引發(fā)、終止以及葡萄酒的感官品質(zhì)產(chǎn)生很大影響，由此我們得出良好的發(fā)酵能力,以及具有良好的抗脅迫能力是優(yōu)良的酒酒球菌應具有的特性。篩選得到良好抗脅迫能力的菌株對于葡萄酒的發(fā)展具有重要意義。濱州學院本科畢業(yè)設計（論文）PAGE3第二章材料與方法2.1實驗材料與儀器2.1.1實驗材料菌種：酒酒球菌SD-2a，酸脅迫抗性突變菌株UVa32、UVas35FMATB培養(yǎng)基:主要用于菌株的配養(yǎng)，成分如下（1L）：FMATB培養(yǎng)基成分成分含量酵母浸粉5g蛋白胨10g葡萄糖2g果糖3gL-蘋果酸5gMnSO4·4H2O0.05gMgSO4·7H2O0.2g鹽酸半胱氨酸0.5g番茄汁250mL蒸餾水750mL番茄汁的制備：將番茄放入沸水中進行蒸煮，蒸煮一段時間后，將番茄撈出，把番茄的皮去除，用紗布擠汁過濾，過濾后放入離心管中，進行離心，離心結束后倒入絲口瓶中于高壓蒸汽鍋中滅菌（121℃，20min）后以備使用。2.1.2儀器與設備電子天平、超凈工作臺、培養(yǎng)箱、離心機、酶標儀、96孔板、pH計、高壓蒸汽滅菌鍋、高效液相色譜儀、恒溫水浴鍋、超聲波細胞粉碎儀、酒精燈、移液槍、冰箱等2.2實驗方法2.2.1生長曲線的測定器材準備：取三角瓶和試管，進行清洗，滅菌，以備使用。按照相應配比關系制備FMATB液體培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中加入鹽酸溶液，將pH調(diào)至2.8，分裝到三角瓶和試管中，每只三角瓶中裝入150mL，每支試管中裝入10mL；將剩下的培養(yǎng)基液體，加入NaOH溶液將pH調(diào)至3.0，分裝到三角瓶和試管中，每只三角瓶中裝入150mL，每支試管中裝入10mL；然后再將剩下的培養(yǎng)基液體，利用NaOH溶液分別調(diào)至3.2、4.8，再進行上述同樣操作。將裝有液體培養(yǎng)基的三角瓶和試管放入高壓蒸汽滅菌鍋中，于121℃下滅菌20min，滅菌后將其放涼。將斜面保存菌種接種活化于三角瓶和試管中,放入培養(yǎng)箱中于28℃下培養(yǎng)4d。將試管取出，在每支試管中吸取200μL菌液放入96孔板中，利用酶標儀在600nm下測量吸光度，連續(xù)測量7天左右，另取100μL菌液放入離心管中，保藏于冰箱中，待測量蘋果酸含量時使用。取出菌液后，將試管放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，記錄吸光度值，以菌株培養(yǎng)時間為橫坐標，菌懸液的光密度（OD600nm）值繪制生長曲線圖。2.2.2β-葡萄糖苷酶活力測定取1mL菌體放入離心管中進行離心，然后用1mL0.85%NaCl洗滌沉淀兩次，最后使菌體及破碎殘體分別懸浮于0.5mL的0.85%NaCl溶液中，再加入0.5mL的2×檸檬酸磷酸緩沖液/對硝基苯-β-葡萄糖苷，將其放入恒溫水浴鍋中在37℃條件下處理1h，待其反應停止后立即加入二倍體積的1.0MNa2CO3溶液使反應停止。在8000rpm，4℃，15min的條件下進行離心，離心結束后各吸取上清液200μL于96孔板上，在400nm下測定吸光度。根據(jù)公式Abs(600nm)=OD600nm/2.6168計算得到菌體干重。酶活定義：在上述反應條件下，每克細菌（干重）每分鐘生成pNP的量。酶活力單位：對硝基苯酚μmol/（g·min）。2.2.3蘋果酸測定取出存放于冰箱中裝有100μL菌液的離心管，將其放入離心機中進行離心，待離心結束后，取10μL上清液放入另一支離心管中，向其加入90μL清水進行十倍稀釋，利用高效液相色譜儀測量蘋果酸含量。2.2.4氨基酸測定將三角瓶中的菌液進行離心，利用1mL清水進行洗滌沉淀將沉淀轉移到另一只離心管中，再加入4mL清水，利用超聲波細胞粉碎儀粉碎細胞，細胞粉碎完成后，將菌液混勻，吸取10μL菌液于小離心管中，加入90μL清水進行十倍稀釋，利用高效液相色譜儀測量氨基酸含量，將相應數(shù)據(jù)記錄下來，利用SPSS分析軟件處理相應數(shù)據(jù)。第三章結果與分析3.1實驗結果與分析3.1.1菌株生長曲線將每天利用酶標儀測量的酒酒球菌SD-2a、UVa32和UVas35的OD600nm值記錄和整理，并將其繪制成菌株生長曲線。生長曲線如下圖：圖1：酒酒球菌SD-2a、UVas35、UVa32處于pH2.8時的生長曲線圖2：酒酒球菌SD-2a、UVas35、UVa32處于pH3.0時的生長曲線圖3：酒酒球菌SD-2a、UVas35、UVa32處于pH3.2時的生長曲線圖4：酒酒球菌SD-2a、UVas35、UVa32處于pH4.8時的生長曲線圖5：酒酒球菌SD-2a、UVas35、UVa32在模擬酒環(huán)境中生長曲線圖1中，菌株SD-2a、UVas35隨著培養(yǎng)時間的增長，菌株濃度并無明顯的增加，而菌株UVa32在第五天時，其生長濃度有了明顯增加；圖2中，菌株UVa32在第三天時濃度開始增加，在第七天時生長濃度基本達到最高峰，菌株SD-2a在第六天時濃度快速增加，在第八天時基本達到最高峰，菌株UVas35濃度無明顯變化；圖3中，菌株UVa32在第二天后菌株濃度快速增長，菌株SD-2a隨著培養(yǎng)時間增長，其濃度也隨之增長，UVas35菌株濃度無明顯變化；圖4中，菌株SD-2a，UVa32、UVas35在第二天后，其濃度迅速增長，且在第三天后基本達到最高峰；圖5中，菌株UVa32濃度增加迅速，UVas35第五天后明顯增長，而菌株SD-2a其增長并不明顯。對比表1、表2、表3和表4中的生長曲線，隨著pH值的減小，菌株UVa32的生長濃度逐漸減小，但其生長濃度仍比在模擬酒中大且其濃度仍大于菌株SD-2a；菌株UVas35生長基本停滯，其濃度比在模擬酒中?。痪闟D-2a生長濃度逐漸減小。3.1.2蘋果酸乳酸含量曲線以利用高效液相色譜儀測得的蘋果酸濃度為縱坐標，菌株生長時間為橫坐標繪制蘋果酸含量消耗曲線（下列圖6）；另外以測得的乳酸濃度為縱坐標，菌株生長時間為橫坐標繪制乳酸生長曲線（下列圖7）,觀察各菌株的蘋果酸-乳酸發(fā)酵情況。圖6：酒酒球菌SD-2a、UVas35、UVa32蘋果酸消耗圖7：酒酒球菌SD-2a、UVas35、UVa32乳酸生成根據(jù)圖6可以看出，蘋果酸濃度從大到小依次為，菌株UVa32、菌株UVas35、酒酒球菌SD-2a，且菌株SD-2a蘋果酸濃度隨培養(yǎng)時間增長其變化并不明顯；根據(jù)圖7可以看出，菌株UVa32中乳酸濃度逐步增加，但在第六天以后乳酸濃度開始下降；菌株UVas35乳酸濃度逐漸增大，第六天后，其乳酸濃度高于菌株UVa32；菌株SD-2a乳酸濃度有不明顯變化。3.1.3β-葡萄糖苷酶活力菌株編號酶活力μmol/（g·min）模擬酒pH3.0pH4.8Uva320.996024161.0857761780.245408359Uvas352.0444321451.5972171850.337029249SD-2a2.6784754212.3782699670.272452058表8：酒酒球菌SD-2a、UVas35、UVa32酶活力變化根據(jù)上表可以看出，菌株UVa32、UVas35和SD-2a在pH3.0時的酶活力均要大于pH4.8時的酶活力，但菌株UVas35、SD-2a在pH3.0時的酶活力小于在模擬酒中的酶活力，菌株UVa32在pH3.0時的酶活力要大于在模擬酒中的酶活力。3.1.4氨基酸含量以下兩個圖表表示pH3.0、pH4.8時酒酒球菌中各種氨基酸濃度：同菌株小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05），下同。圖9：pH3.0時，菌株SD-2a、UVas35、UVa32氨基酸含量圖10：pH4.8時，菌株SD-2a、UVas35、UVa32氨基酸含量根據(jù)圖9和圖10，菌株中含量較多的氨基酸有谷氨酸甘氨酸，精氨酸，丙氨酸，氯化銨，隨著pH值改變，各氨基酸的濃度都發(fā)生了一定的改變。3.2討論為了研究菌株UVa32、UVas35的特性，該實驗檢測了不同pH值下菌株的生長濃度，β-葡萄糖苷酶活力和菌株中蘋果酸乳酸、氨基酸濃度，得出了以下結論：（1）根據(jù)上述5個生長曲線圖，可以看出在低pH值時，菌株UVa32具有更好的酸耐受性；菌株UVas35在pH值小于3.0時，其生長受到了抑制作用，酸耐受性較差；菌株SD-2a在pH值處于2.8時，其生長受到了抑制作用，而當pH值大于2.8時，其生長略小于菌株UVa32，菌株SD-2a的酸耐受性較差于菌株UVa32。根據(jù)上述蘋果酸消耗和乳酸生成圖，可以看出蘋果酸-乳酸發(fā)酵能力強度大小從大到小依次為菌株UVa32、菌株UVas35、菌株SD-2a，菌株UVa32具有很好的酸耐受性。在pH3.0時，菌株SD-2a、UVas35的酶活力與在模擬酒中的酶活力相比較弱，說明其酶的活性受到了抑制，而菌株UVa32的酶活力與在模擬酒中的酶活力相比強一點，說明菌株UVa32的酸耐受性要強于菌株UVas35和菌株SD-2a；在pH4.8時，三種菌株酶活力均降低，說明此時酶的活性均受到抑制。綜上所述，可得到菌株UVa32具有良好的酸耐受性，而菌株UVas35則對酸具有一定的敏感性，但菌株UVas35在酸性環(huán)境下形成酶活性強一些，對葡萄酒香味的形成具有一定意義。3.3展望葡萄酒的品質(zhì)與蘋果酸-乳酸發(fā)酵有著密切的聯(lián)系，降低葡萄酒的酸度、提高微生物的穩(wěn)定性，以及改變葡萄酒的口感、色澤、香氣都是蘋果酸-乳酸發(fā)酵的。是引起并完成蘋果酸-乳酸發(fā)酵的重要菌種是酒酒球菌，但葡萄酒中的環(huán)境威脅著酒酒球菌的生長和生存，因此具有良好抗脅迫能力的酒酒球菌對葡萄酒產(chǎn)業(yè)有很大影響。本實驗中的酸脅迫抗性突變菌株UVa32具有較好的酸耐受性，將其投入到葡萄酒生產(chǎn)中，對葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。參考文獻[1]謝昉書,文向圓,劉樹文.酒酒球菌(Oenococcusoeni)耐酸突變株蘋果酸-乳酸發(fā)酵能力分析[J].食品科學,2019,40(02):93-101.謝昉書.誘變酒酒球菌菌株蘋果酸—乳酸發(fā)酵及其對葡萄酒香氣的影響[D].西北農(nóng)林科技大學,2018.任曉寧,張宇,陳其玲,劉樹文.不同發(fā)酵條件對模擬葡萄酒中酒酒球菌檸檬酸代謝的影響[J].食品工業(yè)科技,2017,38(04):180-185+190.劉曉嬌.不同因素對酒酒球菌蘋果酸—乳酸發(fā)酵的影響[D].西北農(nóng)林科技大學,2011.楊世玲.酒酒球菌β-葡萄糖苷酶活性及其對葡萄酒香氣的影響研究[D].西北農(nóng)林科技大學,2015.孫煒寧,張巧格,李興興,韓燁.葡萄酒釀造過程中微生物多樣性的研究現(xiàn)狀[J].食品研究與開發(fā),2014,35(18):365-368.趙紅玉,李華,劉龍祥,彭帥,王華.酒酒球菌脅迫適應性機制的研究進展[J].中國食品學報,2019,19(07):292-299.BetteridgeAlice,GrbinPaul,JiranekVladimir.ImprovingOenococcusoenitoovercomechallengesofwinemalolacticfermentation.[J].Pubmed,2015,33(9).SumbyKristaM,GrbinPaulR,JiranekVladimir.Implicationsofnewresearchandt