第三節(jié)病毒學(xué)研究的基本方法

內(nèi)容一、理化因素對(duì)病毒的作用二、標(biāo)本的采集和處理三、病毒的分離培養(yǎng)四、病毒的鑒定五、病毒定量的幾個(gè)概念

一、理化因素對(duì)病毒的作用理化因素包括熱、輻射、pH和化學(xué)試劑等對(duì)病毒的滅活作用，其作用的的結(jié)果是：改變和破壞病毒核酸，使其失去轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能；或者是改變和破壞病毒蛋白衣殼或脂質(zhì)等結(jié)構(gòu)，從而消除病毒的感染性。但是經(jīng)滅活的病毒可繼續(xù)保持其抗原性以及誘導(dǎo)產(chǎn)生干擾素。

了解各種理化因素對(duì)病毒的滅活作用，有著重要的實(shí)際意義。由于不同病毒對(duì)各種理化因子的敏感性不同，因此在消毒時(shí)必須針對(duì)該病毒特點(diǎn)，選擇最為有效的消毒劑。相反，在保存毒種或病毒材料時(shí)，則必須注意防止和避免各種滅活條件。病毒對(duì)不同理化因素的抵抗力，也是鑒定病毒的一個(gè)重要依據(jù)。

（一）溫度病毒喜冷怕熱。大多數(shù)病毒可在4℃以下良好地生存，特別是在干冰溫度(-70℃)和液氮(-196℃)下更可長(zhǎng)期保持其感染性。相反地，大多數(shù)病毒可在55～60℃條件下幾分鐘到十幾分鐘內(nèi)滅活，100℃可在幾秒鐘內(nèi)滅活。因此必須低溫保存病毒和疫苗等。

各種病毒對(duì)熱的抵抗力不同，甚至有著明顯的差異。例如：

黏病毒和RNA腫瘤病毒等具有包膜的病毒，感染半衰期為37℃1h

而痘病毒在干燥狀態(tài)下，卻可耐受100℃加熱5～10min熱對(duì)病毒的滅活作用，受周圍環(huán)境因素的影響。蛋白質(zhì)以及鈣、鎂等離子的存在，?？商岣吣承┎《緦?duì)熱的抵抗力。

長(zhǎng)期保存病毒一般采用下述兩種方法：1.快速低溫冷凍于病毒液中加入滅活的正常動(dòng)物血清或其他蛋白保護(hù)劑，最好再加入5％～10％的二甲基亞砜，并迅速冷凍和保存于-70℃～-196℃。對(duì)含病毒的組織材料可以直接低溫冷凍保存，如有些病毒可先浸入50％的甘油緩沖鹽水中，再行低溫保存，效果更好。

2.冷凍干燥在真空條件下使冰凍病毒懸液脫水（通常是冷凍真空干燥），可保存幾年甚至幾十年，毒力不變。毒種的保護(hù)劑：一般用脫脂牛乳、經(jīng)滅活的動(dòng)物血清、飽和蔗糖溶液等。真空干燥時(shí)，將病毒液加等量保護(hù)劑，每支裝0.2～0.5ml，放入凍干機(jī)內(nèi)冷凍。現(xiàn)代凍干機(jī)具有冷凍、干燥、抽真空等全部裝置，使用十分方便。

（二）pH值大多數(shù)病毒在pH6～8的范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。在pH5.0以下的酸性環(huán)境中，以及pH9.0以上的堿性環(huán)境中，病毒大多迅速滅活。酸、堿溶液是病毒學(xué)實(shí)踐中常用的消毒劑。貯存病毒，以中性或微堿性為宜，例如病毒病料置中性的50％甘油鹽水中保存。

但是必須指出，各種病毒對(duì)pH變化的穩(wěn)定性可能顯著不同。例如：

呼腸孤病毒能夠抵抗pH3.0；口蹄疫病毒在pH6.0～6.5及pH8.0～9.0迅速滅活；豬水泡病病毒在pH2.2條件下24h內(nèi)仍保持其感染性。因此pH的穩(wěn)定性，是鑒定某些病毒的一個(gè)重要指標(biāo)。

（三）輻射電離輻射中的γ射線和X射線以及非電離輻射紫外線，都對(duì)病毒呈現(xiàn)滅活作用。其原因是它們可以破壞病毒核酸的分子結(jié)構(gòu)，使其失去生物活性。

（四）超聲波和光動(dòng)力作用超聲波主要以強(qiáng)烈振蕩對(duì)細(xì)菌和其他微生物以及細(xì)胞等呈現(xiàn)破壞作用，但對(duì)病毒的滅活作用并不明顯。常用超聲波破壞細(xì)胞，使病毒粒子從細(xì)胞內(nèi)釋放，以便收獲和提純病毒。有些病毒核酸被染料（如甲苯胺藍(lán)、啶橙）作用后，就能被可見光滅活，稱為染料的光動(dòng)力作用。

（五）脂溶劑乙醚、氯仿和丙酮等脂溶劑對(duì)有包膜的病毒具有滅活作用。乙醚等滅活試驗(yàn)是鑒定病毒的一個(gè)重要指標(biāo)。

（六）甘油和抗生素應(yīng)用50％的甘油鹽水，病毒可以存活數(shù)日，甚至幾年。生產(chǎn)實(shí)踐中常用50％甘油鹽水保存病毒材料，同時(shí)采取冷藏措施，效果較為理想；一般的抗生素對(duì)病毒無(wú)作用，故常加入到含有病毒的材料中去，以殺死細(xì)菌而有利于病毒的分離與培養(yǎng)。近年來(lái)，人們已發(fā)現(xiàn)一些抗生素對(duì)病毒有作用，有的已用在病毒病的預(yù)防和治療上，如金剛銨、利福霉素、放線菌素D等。

二、標(biāo)本的采集和處理用于分離病毒的標(biāo)本應(yīng)含有足夠量的活病毒，因此必須根據(jù)病毒的生物學(xué)特性、病毒感染的特征、流行病學(xué)規(guī)律以及機(jī)體的免疫保護(hù)機(jī)制，來(lái)選擇所需要采集標(biāo)本的種類、確定最適采集時(shí)間和標(biāo)本處理的方法。標(biāo)本采集必須無(wú)菌操作，如有細(xì)菌污染，可通過(guò)加抗菌素、過(guò)濾和離心等方法處理。由于大多數(shù)病毒對(duì)熱不穩(wěn)定，所以標(biāo)本經(jīng)處理后一般應(yīng)立即接種。

若需要運(yùn)送或保存，數(shù)小時(shí)內(nèi)可置于50％中性甘油內(nèi)4℃保存，對(duì)需較長(zhǎng)時(shí)間凍存的標(biāo)本最好置于-20℃以下或干冰保存。以感染病毒的動(dòng)物病料采集為例，一般說(shuō)來(lái)，應(yīng)從病畜體內(nèi)存在病毒最多的器官或組織采取病料。例如上呼吸道疾病取鼻分泌物，腦炎取腦組織，痘癥取患部皮膚。采集病料的時(shí)間，以癥狀剛出現(xiàn)時(shí)為佳。檢查抗體時(shí)，則采取一個(gè)病畜的初期和恢復(fù)期的血清，以了解抗體滴度的變化。

三、病毒的分離培養(yǎng)病毒與細(xì)菌不同，病毒是嚴(yán)格的活細(xì)胞內(nèi)寄生的，因此分離培養(yǎng)病毒應(yīng)采用：寄主(易感動(dòng)）接種法雞胚培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)法而且還必須根據(jù)不同病毒的要求進(jìn)行選擇，才能得到滿意的結(jié)果。

（一）寄主接種法分離的標(biāo)本接種于實(shí)驗(yàn)寄主的種類和接種途徑主要取決于：

病毒寄主范圍組織嗜性同時(shí)還應(yīng)考慮操作、培養(yǎng)及結(jié)果判定的簡(jiǎn)便

動(dòng)物病毒標(biāo)本可接種于敏感動(dòng)物的特定部位：

嗜神經(jīng)病毒接種于動(dòng)物腦內(nèi)；嗜呼吸道病毒接種于動(dòng)物鼻腔；常用動(dòng)物有：

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：小白鼠、大白鼠、地鼠、家兔和猴子等。

本動(dòng)物：接種病毒后，隔離飼養(yǎng)，每日觀察動(dòng)物發(fā)病情況，根據(jù)動(dòng)物出現(xiàn)的癥狀，初步確定是否有病毒增殖。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培養(yǎng)病毒的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種病毒的用途2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的等級(jí)普通級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（conventionalanimals,CV）清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（cleananimals,CL）無(wú)特定病原動(dòng)物（specificpathogen-freeanimals,SPF）無(wú)菌動(dòng)物（germ-freeanimals,GF）悉生動(dòng)物（gnotobioticanimals,GA）

（二）雞胚培養(yǎng)法不同的病毒可選擇不同日齡的雞胚和不同的接種途徑，如：

痘病毒接種于10～12d的雞胚絨毛尿囊膜上；雞新城疫病毒宜接種在10d尿囊腔和羊膜腔內(nèi)；蟲媒病毒宜接種于5d卵黃囊。繼續(xù)培養(yǎng)觀察。

雞胚接種1、雞胚接種病毒的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)2、雞胚的構(gòu)造、接種途徑和方法雞胚培養(yǎng)法的缺點(diǎn)1、一般的病毒通常并不使雞胚產(chǎn)生特異性的感染指征；2、卵黃中常常含有抗家禽病原體的母源抗體；3、某些病原體可以從感染母雞向雞胚傳播；4、通常雞胚種含有白血病病毒；5、雞胚種可能有抗菌素殘留。雞胚構(gòu)造接種途徑1、絨毛尿囊膜接種：主要用于在絨毛尿囊膜上形成痘斑樣病變的病毒。接種日齡10－12日齡。2、尿囊腔接種：主要用于正粘病毒和副粘病毒的接種。接種日齡10－11日齡。3、卵黃囊接種：主要用于蟲媒披膜病毒、立克次氏體和衣原體的接種。接種日齡6－8日齡。4、羊膜腔接種：正粘病毒和副粘病毒的接種。接種日齡為10－12日齡雞胚接種后的結(jié)果判定1、24小時(shí)死亡雞胚棄去不用，不能認(rèn)為是因病毒增殖致死。2、尿囊液清涼3、雞胚死亡或雞胚出現(xiàn)病變等異常

（三）細(xì)胞培養(yǎng)法細(xì)胞培養(yǎng)是目前最常用的方法。用機(jī)械方法或胰蛋白酶等方法將離體的活組織分散成單個(gè)的細(xì)胞，在平皿中制成貼壁的單層細(xì)胞，然后鋪上動(dòng)物病毒懸液進(jìn)行培養(yǎng)。組織培養(yǎng)1、概念：原指動(dòng)物或植物組織小塊的體外培養(yǎng)，現(xiàn)已泛指體外的組織、器官和細(xì)胞培養(yǎng)。組織（塊)培養(yǎng)：將動(dòng)物組織切成小塊，在固定或懸浮條件下培養(yǎng)。該法是最早的組織培養(yǎng)方法。器官培養(yǎng)：取器官薄片（氣管環(huán)）進(jìn)行培養(yǎng)，使其基本保持原來(lái)的結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞培養(yǎng)：應(yīng)用胰酶等細(xì)胞分散劑將動(dòng)物組織消化成單個(gè)細(xì)胞懸液，加入細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)液，使其生長(zhǎng)繁殖。組織培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞類型不同1、原代細(xì)胞培養(yǎng)：直接從動(dòng)物組織制備的單細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：病毒對(duì)天然宿主細(xì)胞最敏感。適應(yīng)于病毒的分離缺點(diǎn):有時(shí)存在攜帶潛伏病毒無(wú)菌取動(dòng)物活組織洗滌數(shù)次剪碎組織消化組織洗滌消化組織機(jī)械吹打紗布濾過(guò)濾過(guò)細(xì)胞懸液細(xì)胞計(jì)數(shù)培養(yǎng)液稀釋所需細(xì)胞濃度分裝到培養(yǎng)瓶

37℃培養(yǎng)2、二倍體細(xì)胞養(yǎng)：

原代細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，經(jīng)胰蛋白酶或EDTA等細(xì)胞分散劑將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶玻面上消化下來(lái)，使細(xì)胞分散，加入培養(yǎng)液，重新分裝到培養(yǎng)瓶中，使細(xì)胞長(zhǎng)成細(xì)胞單層，如此傳代，細(xì)胞的染色體與原代細(xì)胞的染色體數(shù)相同，為二倍體，所以又叫二倍體細(xì)胞培養(yǎng)或叫繼代細(xì)胞培養(yǎng)。優(yōu)點(diǎn)：細(xì)胞碎片少，潛伏病毒容易發(fā)現(xiàn)，對(duì)病毒的敏感性和原代細(xì)胞相似。缺點(diǎn)：不能無(wú)限制的傳代下去，并不是所有的細(xì)胞都能繼代下去。組織培養(yǎng)3、傳代細(xì)胞系在體外可以無(wú)限制地傳代下去。這類細(xì)胞多屬癌變細(xì)胞，具有很高的生長(zhǎng)和增殖優(yōu)勢(shì)，這類細(xì)胞的染色體已經(jīng)發(fā)生改變，又稱為異倍體細(xì)胞。優(yōu)點(diǎn)：容易培養(yǎng)，生長(zhǎng)迅速，易于獲得和操作。缺點(diǎn)：對(duì)病毒分離不夠敏感，不能用這類細(xì)胞培養(yǎng)的病毒制備疫苗。組織培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)方法不同1、靜置培養(yǎng)培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單，產(chǎn)量少組織培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)方法不同2、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)（轉(zhuǎn)管培養(yǎng)）細(xì)胞懸液分裝到圓瓶中，培養(yǎng)時(shí)玻瓶不斷緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)（5－10轉(zhuǎn)/分鐘）細(xì)胞貼附于玻瓶四周，并長(zhǎng)成單層。細(xì)胞產(chǎn)量高，節(jié)省培養(yǎng)液，但需要一定的培養(yǎng)裝置。組織培養(yǎng)3、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)量高，適應(yīng)于傳代細(xì)胞，不適合原代細(xì)胞培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)方法不同組織培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)方法不同4、微載體細(xì)胞培養(yǎng)利用對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性的微小顆粒，按一定比例放入混懸的培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)液中，作為細(xì)胞附著增殖的載體。大大擴(kuò)大了細(xì)胞長(zhǎng)成單層的附著面，充分利用生長(zhǎng)空間和營(yíng)養(yǎng)液，達(dá)到了提高細(xì)胞產(chǎn)量的目的。常用的細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞圓縮：細(xì)胞的折光率增強(qiáng)，形態(tài)逐漸變圓，感染細(xì)胞由局部逐漸擴(kuò)散到整個(gè)單層，細(xì)胞死亡，有的從玻面上脫落下來(lái)。病毒感染細(xì)胞后的細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathiceffect,CPE)病毒感染細(xì)胞后的細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathiceffect,CPE)細(xì)胞聚集成叢：類似葡萄串狀。細(xì)胞與細(xì)胞之間常有細(xì)絲細(xì)胞間橋連接病毒感染細(xì)胞后的細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathiceffect,CPE)多核巨細(xì)胞的形成：感染病毒的細(xì)胞，膜發(fā)生融合，形成一個(gè)合胞體，內(nèi)有多個(gè)核病毒感染細(xì)胞后的細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathiceffect,CPE)細(xì)胞內(nèi)空泡形成：在病毒感染的細(xì)胞內(nèi)形成大的氣泡病毒感染細(xì)胞后的細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathiceffect,CPE)細(xì)胞脫落：病變細(xì)胞從玻面上脫落，進(jìn)入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，使貼壁細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞變得疏松病毒感染細(xì)胞后的細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathiceffect,CPE)包涵體（InclusionBodies）：病毒感染細(xì)胞后，在胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)的特殊結(jié)構(gòu)。核內(nèi)包涵體和胞漿內(nèi)包涵體

四、病毒的鑒定病毒鑒定是診斷病毒性疾病的可靠方法，也是病毒分類的前提。一般可通過(guò)以下方法確證病毒的存在：

(一)病毒的群體形態(tài)特征1.噬菌斑噬菌斑(plaque)測(cè)定一般采用雙層平板法，將一定量經(jīng)稀釋的噬菌體懸液與高濃度敏感菌懸液及半固體瓊脂培養(yǎng)基(1％瓊脂)混合均勻后，然后倒入含底層瓊脂培養(yǎng)基(2％瓊脂)的平板，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng)后，在細(xì)菌菌苔上會(huì)出現(xiàn)一個(gè)個(gè)圓形局部透明區(qū)域，即噬菌斑?？梢哉J(rèn)為，每個(gè)噬菌斑是一個(gè)噬菌體侵染的結(jié)果，一個(gè)噬菌斑中的噬菌體遺傳性都相同，故通過(guò)多次重復(fù)接種，可獲得純系噬菌體。因每種噬菌體的噬菌斑有一定的大小、形狀、邊緣和透明度，故可作為鑒定的指標(biāo)。此外，噬菌斑亦可用于病毒的定量。1.噬菌斑2.菌苔

2.空斑和感染病灶一些動(dòng)物病毒在動(dòng)物細(xì)胞或組織培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)時(shí)，由于病毒感染細(xì)胞裂解，出現(xiàn)與噬菌斑類似的空斑或稱蝕斑。如果是腫瘤病毒，細(xì)胞不是被溶解，而是生長(zhǎng)速率增加，導(dǎo)致受感染細(xì)胞堆積起來(lái)形成類似于菌落的感染病灶。3.枯斑一些植物病毒會(huì)在莖、葉等植物組織上形成一個(gè)個(gè)褪綠或壞死的斑塊稱枯斑或壞死斑。

（二）血凝現(xiàn)象及干擾現(xiàn)象血凝現(xiàn)象是指許多病毒能吸附于一定種類哺乳動(dòng)物或禽類的紅細(xì)胞表面而產(chǎn)生凝集的現(xiàn)象。如流感病毒、天花病毒等。可根據(jù)病毒凝集的血細(xì)胞種類及凝集條件不同而鑒定病毒。兩種不同的病毒同時(shí)或先后感染同一宿主細(xì)胞時(shí)，一種病毒抑制另外一種病毒增殖的現(xiàn)象，稱為病毒的干擾現(xiàn)象(interference)。如乙型腦炎病毒能干擾脊髓灰質(zhì)炎病毒，流感病毒能干擾西方型馬腦炎病毒的增殖等。若在某一組織細(xì)胞培養(yǎng)物中同時(shí)加入接種物及可被干擾的病毒，若后者被抑制，則可間接判斷接種物中存在可干擾后者的病毒。

（三）細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)是指病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖及其對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損害的明顯表現(xiàn)，例如: