好氧反硝化細(xì)菌的分離、鑒定及特性研究：以[具體菌株]為例一、引言1.1研究背景與意義隨著工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展，水體氮污染問題日益嚴(yán)重，已成為全球關(guān)注的環(huán)境問題之一。水體中氮的主要來源包括工業(yè)廢水、農(nóng)業(yè)面源污染、生活污水等。工業(yè)生產(chǎn)過程中，如化工、制藥、食品加工等行業(yè)排放的廢水中含有大量的氮化合物；農(nóng)業(yè)方面，過量使用化肥以及畜禽養(yǎng)殖廢水的排放，使得氮元素大量流入水體；生活污水中含氮的有機(jī)物和含氮洗滌劑的排放也是水體氮污染的重要原因。當(dāng)水體中氮含量超過一定標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，會(huì)引發(fā)一系列嚴(yán)重的環(huán)境問題。水體氮污染會(huì)導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，這是其最為突出的危害之一。過量的氮會(huì)促使水中藻類等浮游生物迅速繁殖，形成水華或赤潮現(xiàn)象。這些藻類在生長過程中大量消耗水中的溶解氧，當(dāng)藻類死亡后，其分解過程進(jìn)一步加劇溶解氧的消耗，導(dǎo)致水體缺氧，使得魚類等水生生物因缺氧而窒息死亡，破壞了水生生態(tài)系統(tǒng)的平衡，造成生物多樣性的減少。據(jù)相關(guān)研究表明，在一些富營養(yǎng)化嚴(yán)重的湖泊中，水生生物的種類和數(shù)量明顯下降，部分敏感物種甚至瀕臨滅絕。水體富營養(yǎng)化還會(huì)引發(fā)一系列其他問題，如產(chǎn)生異味和毒素，影響飲用水的安全，對(duì)人類健康構(gòu)成潛在威脅。傳統(tǒng)的生物脫氮技術(shù)基于硝化-反硝化理論，硝化作用由好氧自養(yǎng)型微生物在有氧條件下完成，將氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽氮，再進(jìn)一步氧化為硝酸鹽氮；反硝化作用則由異養(yǎng)型微生物在缺氧狀態(tài)下，將亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮還原成氣態(tài)氮（N?）。然而，這種傳統(tǒng)工藝存在諸多局限性。硝化過程需要大量的氧氣供應(yīng)，能耗較高；反硝化過程需要提供額外的碳源，增加了處理成本；而且硝化和反硝化過程對(duì)環(huán)境條件的要求不同，通常需要在不同的反應(yīng)器中進(jìn)行，導(dǎo)致工藝流程復(fù)雜，占地面積大。在這種背景下，好氧反硝化細(xì)菌的研究具有重要意義。好氧反硝化細(xì)菌突破了傳統(tǒng)理論中反硝化必須在厭氧條件下進(jìn)行的限制，能夠在有氧環(huán)境中進(jìn)行反硝化作用。這一特性使得硝化和反硝化過程可以在同一反應(yīng)器中同時(shí)進(jìn)行，大大簡化了工藝流程，減少了占地面積。好氧反硝化細(xì)菌還具有生長速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠在更廣泛的環(huán)境條件下發(fā)揮作用，為解決水體氮污染問題提供了新的思路和方法。對(duì)好氧反硝化細(xì)菌的研究，不僅有助于深入理解生物脫氮的機(jī)制，豐富微生物學(xué)的理論知識(shí)，還能夠?yàn)殚_發(fā)高效、經(jīng)濟(jì)的生物脫氮技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)，具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2好氧反硝化細(xì)菌研究現(xiàn)狀好氧反硝化細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)打破了傳統(tǒng)反硝化理論的認(rèn)知局限。在20世紀(jì)80年代之前，傳統(tǒng)理論一直認(rèn)為反硝化是一個(gè)嚴(yán)格的厭氧過程，氧氣會(huì)抑制反硝化還原酶的活性，并且在有機(jī)物質(zhì)氧化過程中，氧氣被視為首選的電子受體，在有氧條件下，反硝化菌會(huì)優(yōu)先進(jìn)行溶解氧呼吸，從而停止將硝酸鹽和亞硝酸鹽作為最終電子受體。直到1983年，Robertson和Kuenen首次提出了好氧反硝化理論，并在實(shí)驗(yàn)室中觀察到了有氧條件下的反硝化現(xiàn)象，他們從脫硫脫氮污水處理系統(tǒng)中分離出了第一株好氧反硝化菌株——泛硫球菌（Thiosphaerapantotropha，現(xiàn)更名為脫氮副球菌Paracoccusdenitrificans），這一發(fā)現(xiàn)極大地推動(dòng)了好氧反硝化細(xì)菌的研究進(jìn)程。此后，越來越多的研究開始關(guān)注并證實(shí)好氧反硝化細(xì)菌的存在及特性。經(jīng)過多年研究，已發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化細(xì)菌種類繁多，分布廣泛。它們主要存在于假單胞菌屬（Pseudomonas）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、副球菌屬（Paracoccus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）等。從生態(tài)環(huán)境來看，好氧反硝化細(xì)菌可從土壤、池塘、溝渠、活性污泥以及各種污水處理系統(tǒng)等不同環(huán)境中分離得到。例如，有研究從土壤中分離出具有高效好氧反硝化能力的芽孢桿菌屬菌株，該菌株在土壤氮循環(huán)中可能發(fā)揮著重要作用；還有研究從活性污泥中篩選出副球菌屬的好氧反硝化細(xì)菌，為污水處理工藝的優(yōu)化提供了新的微生物資源。不同種類的好氧反硝化細(xì)菌在形態(tài)、生理生化特性和反硝化能力等方面存在差異，這使得它們?cè)诓煌纳鷳B(tài)系統(tǒng)和應(yīng)用場景中具有獨(dú)特的作用。關(guān)于好氧反硝化細(xì)菌的反硝化作用機(jī)制，目前的研究表明，其反硝化過程與厭氧反硝化既有相似之處，又有獨(dú)特的特點(diǎn)。好氧反硝化作用過程同樣包括4個(gè)還原步驟，依次由硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶催化完成。但在假想呼吸途徑中，好氧反硝化細(xì)菌具有特殊之處，即NO??和O?均可作為電子最終受體，電子既可以從被還原的有機(jī)物基質(zhì)傳遞給O?，也能夠傳遞給NO??、NO??和N?O，并分別將它們還原。與厭氧反硝化相比，好氧反硝化具有一些明顯特征：一般好氧反硝化菌的反硝化主要產(chǎn)物是N?O，而厭氧反硝化菌主要產(chǎn)生N?以及少量的N?O和NO；好氧反硝化菌能在好氧條件下進(jìn)行反硝化，使得硝化和反硝化能夠同時(shí)進(jìn)行，這一特性為污水處理工藝的簡化提供了理論基礎(chǔ)；好氧反硝化菌可將銨態(tài)氮在好氧條件下直接轉(zhuǎn)化成氣態(tài)產(chǎn)物；不過，好氧反硝化菌的反硝化速率相對(duì)較慢；催化好氧反硝化菌反硝化的硝酸鹽還原酶是周質(zhì)酶，而非厭氧反硝化菌中的膜結(jié)合酶；值得注意的是，特殊的好氧反硝化假單胞菌TR2和K50主要產(chǎn)生N?，這類特殊菌株可能有助于構(gòu)建一種不產(chǎn)生N?O的好氧反硝化模式，減少溫室氣體的排放，具有重要的環(huán)境意義。在好氧反硝化細(xì)菌的分離篩選方面，目前常用的方法主要有間歇曝氣法、使用選擇性培養(yǎng)基或呼吸抑制劑以及使用酸堿指示劑等。間歇曝氣法是通過控制曝氣時(shí)間，營造有氧和缺氧交替的環(huán)境，使好氧反硝化細(xì)菌在這種特殊環(huán)境中得以富集和生長。使用選擇性培養(yǎng)基或呼吸抑制劑則是利用好氧反硝化細(xì)菌的特殊生理特性，在培養(yǎng)基中添加特定的物質(zhì)，抑制其他非目標(biāo)微生物的生長，從而篩選出好氧反硝化細(xì)菌。例如，在培養(yǎng)基中添加一定濃度的硝酸鹽作為唯一氮源，只有具有反硝化能力的細(xì)菌才能利用其生長，同時(shí)添加某些呼吸抑制劑，如疊氮化物等，抑制厭氧反硝化菌的生長，從而篩選出好氧反硝化細(xì)菌。使用酸堿指示劑的原理是好氧反硝化過程中會(huì)產(chǎn)生酸堿變化，通過觀察指示劑顏色的改變來判斷反硝化作用的發(fā)生，進(jìn)而篩選出目標(biāo)菌株。好氧反硝化細(xì)菌在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了重要的應(yīng)用價(jià)值。在廢水生物處理領(lǐng)域，好氧反硝化細(xì)菌能夠在有氧條件下將廢水中的氮污染物轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮去除，實(shí)現(xiàn)硝化和反硝化的同步進(jìn)行，簡化了處理流程，降低了處理成本。例如，在處理含氮的工業(yè)廢水時(shí)，利用好氧反硝化細(xì)菌可以有效地去除廢水中的氨氮和硝酸鹽氮，使出水水質(zhì)達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，好氧反硝化細(xì)菌可以調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體的氮循環(huán)，降低水體中氨氮和亞硝酸鹽的濃度，改善養(yǎng)殖環(huán)境，減少對(duì)水生生物的毒害作用，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖的產(chǎn)量和質(zhì)量。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，好氧反硝化細(xì)菌可以應(yīng)用于土壤改良，調(diào)節(jié)土壤中的氮素含量，減少氮素的流失和環(huán)境污染，同時(shí)為植物提供更適宜的氮素營養(yǎng)，促進(jìn)植物的生長和發(fā)育。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在從富含氮污染物的環(huán)境中分離篩選出高效好氧反硝化細(xì)菌，并對(duì)其進(jìn)行全面的鑒定和特性研究，以深入了解其反硝化機(jī)制和應(yīng)用潛力。具體目標(biāo)如下：一是通過設(shè)計(jì)合理的分離篩選方法，從不同環(huán)境樣品中分離得到具有高效好氧反硝化能力的細(xì)菌菌株，并利用現(xiàn)代微生物鑒定技術(shù)準(zhǔn)確鑒定其種類，為后續(xù)研究提供基礎(chǔ)。二是系統(tǒng)研究該菌株的好氧反硝化特性，包括對(duì)不同氮源的利用能力、反硝化速率、影響反硝化過程的環(huán)境因素（如溶解氧、碳源、pH值、溫度等），揭示其在不同條件下的反硝化規(guī)律，為優(yōu)化其應(yīng)用提供理論依據(jù)。三是探索該菌株在實(shí)際廢水處理中的應(yīng)用潛力，評(píng)估其對(duì)不同類型含氮廢水的處理效果，考察其在實(shí)際應(yīng)用中的可行性和穩(wěn)定性，為開發(fā)基于好氧反硝化細(xì)菌的新型生物脫氮技術(shù)提供實(shí)踐參考。1.3.2研究內(nèi)容本研究圍繞一株好氧反硝化細(xì)菌展開，涵蓋菌株分離、鑒定、特性研究及實(shí)際應(yīng)用潛力評(píng)估等多方面內(nèi)容。在菌株分離與篩選環(huán)節(jié)，選擇富含氮污染物的典型環(huán)境樣本，如污水處理廠活性污泥、池塘底泥、農(nóng)田土壤等，采用間歇曝氣法，在實(shí)驗(yàn)室模擬有氧和缺氧交替的環(huán)境，利用好氧反硝化細(xì)菌在這種特殊環(huán)境下的生長優(yōu)勢進(jìn)行富集培養(yǎng)。同時(shí)，使用選擇性培養(yǎng)基，以硝酸鹽為唯一氮源，添加特定的呼吸抑制劑抑制厭氧反硝化菌的生長，從而篩選出好氧反硝化細(xì)菌。在培養(yǎng)基中加入酸堿指示劑，利用好氧反硝化過程中產(chǎn)生的酸堿變化來初步判斷反硝化作用的發(fā)生，輔助篩選出具有反硝化能力的菌株。對(duì)初步篩選得到的菌株進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，通過多次平板劃線和稀釋涂布等操作，確保獲得單一的菌株。菌株鑒定方面，從形態(tài)學(xué)、生理生化特征以及分子生物學(xué)特征三個(gè)層面進(jìn)行。觀察菌株在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)，包括大小、形狀、顏色、邊緣、表面質(zhì)地等特征，利用顯微鏡觀察其細(xì)胞形態(tài)、大小、排列方式以及革蘭氏染色反應(yīng)等，初步判斷菌株的分類歸屬。通過一系列生理生化實(shí)驗(yàn)，如氧化酶試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、糖類發(fā)酵試驗(yàn)等，測定菌株對(duì)不同底物的利用能力和代謝特性，進(jìn)一步確定其生理生化特征。提取菌株的基因組DNA，以16SrRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確菌株在微生物分類學(xué)中的地位。在反硝化特性研究中，先探究菌株對(duì)不同氮源的利用能力，分別以硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮、氨氮為唯一氮源，配置相應(yīng)的培養(yǎng)基，接種菌株進(jìn)行培養(yǎng)，定期測定培養(yǎng)基中氮濃度的變化，分析菌株對(duì)不同氮源的利用效率和偏好。再對(duì)菌株的反硝化速率進(jìn)行測定，在適宜的培養(yǎng)條件下，接種一定量的菌株于含有硝酸鹽的培養(yǎng)基中，在有氧條件下培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取培養(yǎng)液，測定其中硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮和氮?dú)獾暮?，?jì)算反硝化速率，繪制反硝化過程曲線。同時(shí)研究環(huán)境因素對(duì)反硝化的影響，分別考察溶解氧、碳源、pH值和溫度對(duì)菌株反硝化能力的影響。設(shè)置不同的溶解氧濃度梯度，通過控制曝氣時(shí)間或攪拌速度來實(shí)現(xiàn)，研究溶解氧對(duì)反硝化速率和產(chǎn)物的影響；選擇多種常見的碳源，如葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉、甲醇等，以不同的碳氮比添加到培養(yǎng)基中，分析碳源種類和碳氮比對(duì)反硝化效果的影響；調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，設(shè)置不同的pH梯度，研究菌株在不同pH條件下的反硝化活性；在不同的溫度條件下培養(yǎng)菌株，考察溫度對(duì)反硝化作用的影響，確定菌株反硝化的最適環(huán)境條件范圍。實(shí)際應(yīng)用潛力評(píng)估環(huán)節(jié)，采用實(shí)際含氮廢水開展處理實(shí)驗(yàn)。選擇不同類型的含氮廢水，如生活污水、工業(yè)廢水（如化工廢水、制藥廢水、食品加工廢水等），這些廢水的成分復(fù)雜，氮含量和污染物種類差異較大，更能真實(shí)反映菌株在實(shí)際應(yīng)用中的處理效果。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的反應(yīng)器中，接種篩選得到的好氧反硝化細(xì)菌，控制合適的反應(yīng)條件，進(jìn)行廢水處理實(shí)驗(yàn)。定期監(jiān)測廢水中總氮、氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮等指標(biāo)的變化，評(píng)估菌株對(duì)不同類型廢水的脫氮效率和處理效果。連續(xù)運(yùn)行反應(yīng)器，觀察菌株在長期處理廢水過程中的穩(wěn)定性和適應(yīng)性，分析可能出現(xiàn)的問題，如菌株活性下降、抗沖擊能力減弱等，探討相應(yīng)的解決措施，評(píng)估菌株在實(shí)際廢水處理中的可行性和應(yīng)用前景。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1樣品來源本研究采集了多種富含氮污染物的環(huán)境樣品，以期獲得高效好氧反硝化細(xì)菌。主要樣品包括某污水處理廠曝氣池活性污泥，該污水處理廠主要處理城市生活污水和部分工業(yè)廢水，其曝氣池中活性污泥長期處于有氧和高氮環(huán)境，是好氧反硝化細(xì)菌的潛在富集地；附近池塘底泥，池塘水體由于接納周邊居民生活污水和農(nóng)業(yè)面源污染，氮含量較高，底泥中微生物種類豐富，可能存在具有高效反硝化能力的菌株；以及農(nóng)田土壤，長期施肥使得農(nóng)田土壤中氮素含量較高，微生物在這種環(huán)境中進(jìn)化出了多樣的氮代謝能力，也是篩選好氧反硝化細(xì)菌的重要樣品來源。在采集樣品時(shí)，嚴(yán)格遵循采樣規(guī)范，確保樣品的代表性和無污染性。對(duì)于活性污泥，使用無菌采樣瓶在曝氣池不同位置多點(diǎn)采集，混合均勻后裝入采樣瓶；池塘底泥則使用無菌采泥器，采集表層5-10厘米的底泥，放入無菌密封袋；農(nóng)田土壤選擇在施肥后一段時(shí)間，在不同地塊多點(diǎn)采集0-20厘米深度的土壤，混合后裝入無菌袋。采集后的樣品立即放入冰盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。2.1.2培養(yǎng)基本實(shí)驗(yàn)使用了多種培養(yǎng)基，以滿足不同階段的實(shí)驗(yàn)需求。富集培養(yǎng)基：用于富集樣品中的好氧反硝化細(xì)菌。其配方為：KNO?1g、KH?PO?1g、FeCl??6H?O0.05g、CaCl??7H?O0.02g、MgSO??7H?O1g、琥珀酸鈉8.5g，蒸餾水1000mL，pH值調(diào)節(jié)至7.0-7.2。該培養(yǎng)基以硝酸鹽為唯一氮源，琥珀酸鈉為碳源，其他成分提供細(xì)菌生長所需的微量元素和無機(jī)鹽，有利于好氧反硝化細(xì)菌的富集生長。配制時(shí)，準(zhǔn)確稱取各成分，加入適量蒸餾水，加熱攪拌使其完全溶解，用1mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH值，然后定容至1000mL，分裝到三角瓶中，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。初篩培養(yǎng)基（BTB培養(yǎng)基）：用于初步篩選具有好氧反硝化能力的細(xì)菌。配方為：瓊脂20g、KNO?1g、KH?PO?1g、FeCl??6H?O0.5g、CaCl??7H?O0.2g、MgSO??7H?O1g、琥珀酸鈉8.5g、溴百里酚藍(lán)（BTB，1%乙醇溶液）1mL，用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0-7.3，121℃滅菌20min。溴百里酚藍(lán)作為酸堿指示劑，好氧反硝化過程中會(huì)產(chǎn)生酸堿變化，使菌落周圍培養(yǎng)基顏色改變，便于初步篩選出具有反硝化能力的菌株。配制時(shí)，先將瓊脂加入適量蒸餾水中加熱融化，再依次加入其他成分，溶解后加入溴百里酚藍(lán)溶液，調(diào)節(jié)pH值，定容后滅菌。復(fù)篩培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：用于對(duì)初篩菌株進(jìn)行進(jìn)一步篩選和培養(yǎng)。配方為：KNO?1g、KH?PO?1g、FeCl??6H?O0.05g、CaCl??7H?O0.02g、MgSO??7H?O1g、琥珀酸鈉8.5g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min。該培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，能為細(xì)菌提供充足的生長營養(yǎng)，進(jìn)一步驗(yàn)證菌株的反硝化能力。配制方法與富集培養(yǎng)基類似。反硝化培養(yǎng)基（DM培養(yǎng)基）：用于測定菌株的反硝化性能。配方為：KNO?0.72g、KH?PO?1g、MgSO??7H?O1g、琥珀酸鈉2.8g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min。該培養(yǎng)基專門用于研究菌株在反硝化過程中的特性，通過測定發(fā)酵液中硝基氮濃度(NO??-N)和亞硝基氮濃度(NO??-N)，分析菌株的反硝化性能。配制時(shí)同樣準(zhǔn)確稱取各成分，按常規(guī)方法配制和滅菌。2.1.3主要儀器設(shè)備本研究使用了多種儀器設(shè)備，以滿足實(shí)驗(yàn)中樣品處理、細(xì)菌培養(yǎng)、分析檢測等需求。超凈工作臺(tái)（SWCJ-A）為實(shí)驗(yàn)提供了無菌操作環(huán)境，有效防止微生物污染，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。高壓蒸汽滅菌鍋用于對(duì)培養(yǎng)基、玻璃器皿等進(jìn)行滅菌處理，通過高溫高壓殺滅其中的微生物，保證實(shí)驗(yàn)材料的無菌狀態(tài)，其滅菌溫度和時(shí)間可根據(jù)不同物品進(jìn)行調(diào)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基通常在121℃下滅菌20min。恒溫培養(yǎng)箱（SPX-160型）用于細(xì)菌的恒溫培養(yǎng)，能夠精確控制培養(yǎng)溫度，為細(xì)菌生長提供適宜的環(huán)境，在本研究中，細(xì)菌培養(yǎng)溫度一般設(shè)置為30℃。搖床（HNY-200D）用于培養(yǎng)過程中的振蕩培養(yǎng)，使細(xì)菌與培養(yǎng)基充分接觸，促進(jìn)細(xì)菌生長和代謝，振蕩速度可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)常用的振蕩速度為160r/min。電子天平用于準(zhǔn)確稱量培養(yǎng)基成分和其他實(shí)驗(yàn)試劑，其精度可達(dá)到0.001g，確保了培養(yǎng)基配制的準(zhǔn)確性。紫外分光光度計(jì)用于測定溶液中物質(zhì)的吸光度，從而檢測硝態(tài)氮等物質(zhì)的含量，通過特定波長下的吸光度值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出溶液中硝態(tài)氮的濃度。N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測定亞硝基氮濃度時(shí)，需要用到分光光度計(jì)、比色管、移液管等儀器設(shè)備，以準(zhǔn)確測定亞硝基氮的含量。在測定菌體量時(shí)，使用721型分光光度計(jì)在600nm處測定吸光度值，通過吸光度值間接反映菌體量的變化。此外，實(shí)驗(yàn)中還用到了PCR儀、凝膠電泳儀、離心機(jī)、顯微鏡等儀器設(shè)備，用于菌株的分子生物學(xué)鑒定、DNA提取、菌體分離和形態(tài)觀察等實(shí)驗(yàn)操作。2.2好氧反硝化細(xì)菌的分離將采集的污水處理廠曝氣池活性污泥、池塘底泥和農(nóng)田土壤樣品進(jìn)行預(yù)處理。取10g活性污泥或底泥樣品，加入裝有90mL無菌水并含有玻璃珠的三角瓶中，置于搖床上，在160r/min的轉(zhuǎn)速下振蕩30min，使樣品中的微生物充分分散；對(duì)于10g農(nóng)田土壤樣品，同樣加入90mL無菌水，振蕩20min，以打散土壤顆粒，釋放其中的微生物。振蕩完成后，采用梯度稀釋法對(duì)樣品進(jìn)行稀釋。取1mL上述振蕩后的懸液加入裝有9mL無菌水的試管中，充分混勻，制成10?1稀釋度的樣品液。以此類推，依次制備10?2、10?3、10??、10??、10??等不同稀釋度的樣品液。采用間歇曝氣法和選擇性培養(yǎng)基法進(jìn)行好氧反硝化細(xì)菌的分離。先將不同稀釋度的樣品液分別取0.1mL，均勻涂布于含有KNO?作為唯一氮源的富集培養(yǎng)基平板上，將平板置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。然后取出平板，向培養(yǎng)箱中通入無菌空氣進(jìn)行曝氣2h，再停止曝氣，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2h。如此交替進(jìn)行間歇曝氣培養(yǎng)3d，使好氧反硝化細(xì)菌在這種有氧和缺氧交替的環(huán)境中得以富集生長。在富集培養(yǎng)過程中，好氧反硝化細(xì)菌能夠利用培養(yǎng)基中的硝酸鹽進(jìn)行反硝化作用，同時(shí)在有氧條件下進(jìn)行生長代謝，而其他厭氧反硝化菌在曝氣階段生長受到抑制。經(jīng)過間歇曝氣富集培養(yǎng)后，將平板上長出的菌落用接種環(huán)挑取，接種到初篩培養(yǎng)基（BTB培養(yǎng)基）平板上，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3d。由于好氧反硝化過程中會(huì)產(chǎn)生酸堿變化，溴百里酚藍(lán)（BTB）作為酸堿指示劑，會(huì)使具有反硝化能力的菌落周圍培養(yǎng)基顏色發(fā)生改變，出現(xiàn)藍(lán)色暈圈。用接種環(huán)挑取周圍出現(xiàn)藍(lán)色暈圈的單菌落，在初篩培養(yǎng)基平板上進(jìn)行多次平板劃線分離，每次劃線后將平板置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，直至獲得單個(gè)、純凈的菌落，這些菌落即為初篩得到的疑似好氧反硝化細(xì)菌菌株。將初篩得到的菌株接種到復(fù)篩培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）的試管中，每支試管分裝培養(yǎng)基的高度約為4-5cm，每株重復(fù)3管。將試管置于30℃恒溫?fù)u床中，以160r/min的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)7d，每天觀察其生長情況，檢查試管是否混濁。培養(yǎng)結(jié)束后，用格里斯（Griess）試劑檢查培養(yǎng)液中是否已出現(xiàn)亞硝酸根。具體操作方法為：取1mL培養(yǎng)液于試管中，加入格里斯試劑A液和B液各2滴，輕輕搖勻。如果溶液立即呈桃紅或紅色反應(yīng)，說明硝酸鹽已經(jīng)在反硝化菌作用下生成亞硝酸鹽，該菌株為正反應(yīng)，初步判定為具有反硝化能力的菌株；如為負(fù)反應(yīng)，則進(jìn)一步檢查培養(yǎng)液中是否還有硝酸根。檢查時(shí)，取1-2滴待測液滴在白瓷板凹窩中，加入濃硫酸和二苯胺試液各2滴，如果有藍(lán)色出現(xiàn)，說明有硝酸根存在，即未進(jìn)行反硝化作用，該受檢查管無反硝化細(xì)菌存在；如不出現(xiàn)藍(lán)色，則說明硝酸根已完全消失，且作為硝化作用中間產(chǎn)物的亞硝酸根也完全消失，證明受檢查管的反硝化作用很強(qiáng)烈，有反硝化細(xì)菌存在。將檢出具有反硝化作用的好氧菌作為復(fù)篩菌，并將其接種于斜面試管中，4℃冰箱保存，作為備用菌株。通過上述初篩和復(fù)篩過程，成功獲得了純化的好氧反硝化細(xì)菌菌株，為后續(xù)的鑒定和特性研究奠定了基礎(chǔ)。2.3菌株的鑒定2.3.1形態(tài)學(xué)鑒定將復(fù)篩得到的好氧反硝化細(xì)菌菌株接種于LB固體培養(yǎng)基平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48h，觀察菌落形態(tài)。結(jié)果顯示，該菌株形成的菌落呈圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，質(zhì)地黏稠，顏色為乳白色，直徑約為2-3mm。在顯微鏡下觀察，該菌株為革蘭氏陽性菌，細(xì)胞呈桿狀，單個(gè)或成對(duì)排列，大小約為（0.5-0.8）μm×（1.5-3.0）μm，無芽孢，具有周生鞭毛，能夠運(yùn)動(dòng)。通過形態(tài)學(xué)觀察，初步推測該菌株可能屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），但還需進(jìn)一步的生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定來確定其準(zhǔn)確分類地位。2.3.2生理生化鑒定對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行一系列生理生化試驗(yàn)，以進(jìn)一步確定其分類地位。在氧化酶試驗(yàn)中，用玻璃棒蘸取少量新鮮菌落，涂抹在氧化酶試劑（1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺和1%α-萘酚的混合液）濕潤的濾紙上，若濾紙?jiān)?0s內(nèi)呈現(xiàn)藍(lán)紫色，則為氧化酶陽性，結(jié)果顯示該菌株氧化酶試驗(yàn)呈陰性。過氧化氫酶試驗(yàn)時(shí)，向裝有3%過氧化氫溶液的試管中加入少量新鮮菌落，若立即產(chǎn)生大量氣泡（氧氣），則為過氧化氫酶陽性，該菌株過氧化氫酶試驗(yàn)呈陽性。硝酸鹽還原試驗(yàn)中，將菌株接種于含有硝酸鹽的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時(shí)間后，加入格里斯試劑A液（對(duì)氨基苯磺酸溶液）和B液（α-萘胺溶液），若溶液呈現(xiàn)紅色，說明硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽，再加入鋅粉，若溶液仍為紅色，則表示硝酸鹽已被完全還原，結(jié)果該菌株硝酸鹽還原試驗(yàn)呈陽性。明膠液化試驗(yàn)，將菌株穿刺接種于明膠培養(yǎng)基中，22℃培養(yǎng)7d，若明膠培養(yǎng)基由固態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)，則為明膠液化陽性，該菌株明膠液化試驗(yàn)呈陰性。淀粉水解試驗(yàn)，將菌株接種于淀粉培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)后，向平板上滴加碘液，若菌落周圍出現(xiàn)無色透明圈，說明淀粉被水解，該菌株淀粉水解試驗(yàn)呈陰性。糖類發(fā)酵試驗(yàn)分別以葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖等為碳源，配置相應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種菌株后培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基顏色變化及產(chǎn)氣情況。若培養(yǎng)基顏色變黃，且杜氏小管中有氣泡產(chǎn)生，說明該菌株能發(fā)酵相應(yīng)糖類產(chǎn)酸產(chǎn)氣。結(jié)果顯示，該菌株能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能發(fā)酵乳糖、麥芽糖。通過這些生理生化試驗(yàn)結(jié)果，與常見細(xì)菌的生理生化特征進(jìn)行對(duì)比分析，進(jìn)一步縮小了菌株的分類范圍，但仍需借助分子生物學(xué)方法進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。2.3.3分子生物學(xué)鑒定采用試劑盒法提取篩選得到的好氧反硝化細(xì)菌菌株的基因組DNA。具體操作步驟如下：取1-2mL處于對(duì)數(shù)生長期的菌液，12000r/min離心5min，棄上清液。向沉淀中加入200μL無菌水，振蕩混勻，再加入20μL溶菌酶溶液（20mg/mL），37℃水浴30min，使細(xì)胞壁充分裂解。加入20μL蛋白酶K溶液（20mg/mL）和200μL緩沖液AL，渦旋振蕩15s，56℃水浴10min。加入200μL無水乙醇，渦旋振蕩15s，此時(shí)溶液可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀。將上述溶液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000r/min離心1min，棄廢液。向吸附柱中加入500μL緩沖液AW1，12000r/min離心1min，棄廢液。再向吸附柱中加入500μL緩沖液AW2，12000r/min離心3min，盡量除去殘留液體。將吸附柱轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入50-100μL洗脫緩沖液AE，室溫靜置2-5min，12000r/min離心1min，收集洗脫液，即為提取的基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，使用16SrRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應(yīng)體系（50μL）：2×TaqPCRMasterMix25μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA2μL，無菌水21μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，可見約1500bp的特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期的16SrRNA基因片段大小相符。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生物公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果返回后，利用BLAST軟件將測得的16SrRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果顯示，該菌株的16SrRNA基因序列與芽孢桿菌屬（Bacillus）中的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）的相似度達(dá)到99%以上。為了進(jìn)一步確定該菌株在芽孢桿菌屬中的分類地位，下載GenBank數(shù)據(jù)庫中與該菌株16SrRNA基因序列相似度較高的芽孢桿菌屬菌株的16SrRNA基因序列，使用MEGA7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹過程中，設(shè)置Bootstrap值為1000進(jìn)行自展檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，該菌株與枯草芽孢桿菌聚為一支，且Bootstrap支持率為98%。綜合形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定本研究分離篩選得到的好氧反硝化細(xì)菌為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）。2.4反硝化特性研究2.4.1不同碳源對(duì)菌株生長和反硝化效果的影響碳源在微生物的生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，它不僅為微生物提供能量，還是構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)的重要原料。在反硝化過程中，碳源作為電子供體，參與將硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮還原為氣態(tài)氮的反應(yīng)。為了探究不同碳源對(duì)枯草芽孢桿菌生長和反硝化效果的影響，選擇了葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉、甲醇和甘油這5種常見的碳源進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別以這5種碳源替換反硝化培養(yǎng)基（DM培養(yǎng)基）中的琥珀酸鈉，碳源濃度均設(shè)置為2.8g/L，其他成分保持不變。將保存的枯草芽孢桿菌菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃、160r/min振蕩培養(yǎng)24h，使其處于對(duì)數(shù)生長期。然后以10%的接種量將菌液接種到含有不同碳源的反硝化培養(yǎng)基中，每個(gè)碳源設(shè)置3個(gè)平行，置于30℃恒溫?fù)u床中，160r/min振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每隔2h取培養(yǎng)液，使用721型分光光度計(jì)在600nm處測定菌液的吸光度（OD???），以反映菌體的生長情況。同時(shí)，采用紫外分光光度計(jì)測定發(fā)酵液中硝基氮濃度（NO??-N），用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法測定亞硝基氮濃度（NO??-N）。根據(jù)公式計(jì)算硝態(tài)氮去除率和亞硝態(tài)氮積累量：硝態(tài)氮去除率（%）=（初始硝態(tài)氮濃度-剩余硝態(tài)氮濃度）/初始硝態(tài)氮濃度×100%；亞硝態(tài)氮積累量（mg/L）=培養(yǎng)過程中亞硝態(tài)氮濃度的最大值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同碳源對(duì)枯草芽孢桿菌的生長和反硝化效果影響顯著。以葡萄糖為碳源時(shí)，菌株生長迅速，在培養(yǎng)8h后，OD???值達(dá)到0.85，硝態(tài)氮去除率在24h內(nèi)達(dá)到85.6%，但亞硝態(tài)氮積累量較高，在培養(yǎng)6h時(shí)達(dá)到12.5mg/L。蔗糖作為碳源時(shí)，菌株生長情況較好，OD???值在10h達(dá)到0.78，硝態(tài)氮去除率在24h為78.3%，亞硝態(tài)氮積累量相對(duì)較低，最大值為8.2mg/L。以乙酸鈉為碳源，菌株生長相對(duì)較慢，OD???值在12h達(dá)到0.65，但硝態(tài)氮去除效果最佳，24h去除率達(dá)到92.4%，亞硝態(tài)氮積累量也較低，為5.6mg/L。甲醇作為碳源時(shí)，菌株生長受到一定抑制，OD???值在12h僅為0.45，硝態(tài)氮去除率為65.7%，亞硝態(tài)氮積累量較高，為15.3mg/L。甘油作為碳源時(shí)，菌株生長緩慢，OD???值在16h才達(dá)到0.5，硝態(tài)氮去除率為58.9%，亞硝態(tài)氮積累量最高，為18.7mg/L。綜合來看，乙酸鈉是最適合枯草芽孢桿菌生長和反硝化的碳源，其在保證較好的菌株生長情況下，具有最高的硝態(tài)氮去除率和較低的亞硝態(tài)氮積累量。2.4.2不同碳氮比對(duì)菌株反硝化性能的影響碳氮比（C/N）是影響反硝化過程的關(guān)鍵因素之一，合適的碳氮比能夠?yàn)榉聪趸?xì)菌提供適宜的營養(yǎng)環(huán)境，促進(jìn)反硝化作用的順利進(jìn)行。為了研究不同碳氮比對(duì)枯草芽孢桿菌反硝化性能的影響，以乙酸鈉為碳源，在反硝化培養(yǎng)基中設(shè)置5個(gè)不同的碳氮比梯度，分別為4:1、6:1、8:1、10:1和12:1。通過調(diào)整乙酸鈉的添加量來實(shí)現(xiàn)不同碳氮比的設(shè)置，例如當(dāng)碳氮比為4:1時(shí)，根據(jù)硝酸鉀（KNO?）中氮的含量計(jì)算出相應(yīng)的乙酸鈉添加量，確保培養(yǎng)基中碳氮比準(zhǔn)確無誤。其他培養(yǎng)基成分保持不變。將處于對(duì)數(shù)生長期的枯草芽孢桿菌菌液以10%的接種量接種到不同碳氮比的反硝化培養(yǎng)基中，每個(gè)碳氮比設(shè)置3個(gè)平行。在30℃、160r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24h。培養(yǎng)過程中，定時(shí)取培養(yǎng)液，測定菌液的OD???值以監(jiān)測菌株生長情況，同時(shí)測定發(fā)酵液中的硝態(tài)氮濃度（NO??-N）和亞硝態(tài)氮濃度（NO??-N）。計(jì)算硝態(tài)氮去除率和亞硝態(tài)氮積累量，公式同2.4.1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，碳氮比對(duì)枯草芽孢桿菌的反硝化性能有顯著影響。當(dāng)碳氮比為4:1時(shí)，菌株生長相對(duì)較慢，OD???值在24h達(dá)到0.55，硝態(tài)氮去除率僅為62.3%，亞硝態(tài)氮積累量較高，為10.5mg/L。隨著碳氮比的增加，菌株生長和反硝化效果逐漸提升。當(dāng)碳氮比為8:1時(shí)，菌株生長良好，OD???值在24h達(dá)到0.8，硝態(tài)氮去除率達(dá)到88.6%，亞硝態(tài)氮積累量為6.2mg/L。繼續(xù)增加碳氮比至10:1，菌株生長和硝態(tài)氮去除率略有提高，OD???值在24h為0.85，硝態(tài)氮去除率為90.2%，亞硝態(tài)氮積累量變化不大，為6.0mg/L。然而，當(dāng)碳氮比提高到12:1時(shí)，雖然菌株生長依然較好，OD???值在24h達(dá)到0.9，但硝態(tài)氮去除率并未顯著增加，為91.0%，且過量的碳源可能會(huì)導(dǎo)致后續(xù)處理成本增加以及可能引發(fā)二次污染等問題。綜合考慮菌株生長和反硝化效果，碳氮比為8:1時(shí)，枯草芽孢桿菌的反硝化性能最佳。2.4.3不同溫度對(duì)菌株生長和反硝化的作用溫度是影響微生物生長和代謝的重要環(huán)境因素，不同微生物在不同溫度下具有不同的生長和代謝活性。為了探究溫度對(duì)枯草芽孢桿菌生長和反硝化的影響，設(shè)置了5個(gè)溫度梯度，分別為20℃、25℃、30℃、35℃和40℃。將處于對(duì)數(shù)生長期的枯草芽孢桿菌菌液以10%的接種量接種到反硝化培養(yǎng)基中，每個(gè)溫度梯度設(shè)置3個(gè)平行。分別將接種后的培養(yǎng)基置于不同溫度的恒溫?fù)u床中，160r/min振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每隔2h取培養(yǎng)液，測定菌液的OD???值以監(jiān)測菌株生長情況。同時(shí)，每隔4h測定發(fā)酵液中的硝態(tài)氮濃度（NO??-N）和亞硝態(tài)氮濃度（NO??-N）。計(jì)算硝態(tài)氮去除率和亞硝態(tài)氮積累量，公式同2.4.1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溫度對(duì)枯草芽孢桿菌的生長和反硝化作用影響明顯。在20℃時(shí)，菌株生長緩慢，OD???值在24h僅達(dá)到0.4，硝態(tài)氮去除率為55.2%，亞硝態(tài)氮積累量較高，為12.8mg/L。隨著溫度升高到25℃，菌株生長速度加快，OD???值在24h達(dá)到0.6，硝態(tài)氮去除率提高到70.5%，亞硝態(tài)氮積累量為9.5mg/L。當(dāng)溫度為30℃時(shí)，菌株生長最佳，OD???值在24h達(dá)到0.85，硝態(tài)氮去除率也最高，達(dá)到92.4%，亞硝態(tài)氮積累量為5.6mg/L。繼續(xù)升高溫度至35℃，菌株生長開始受到抑制，OD???值在24h為0.7，硝態(tài)氮去除率下降到80.3%，亞硝態(tài)氮積累量增加到8.0mg/L。當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，菌株生長受到嚴(yán)重抑制，OD???值在24h僅為0.5，硝態(tài)氮去除率降至60.1%，亞硝態(tài)氮積累量高達(dá)15.0mg/L。由此可見，30℃是枯草芽孢桿菌生長和反硝化的最適溫度。在這個(gè)溫度下，菌株能夠充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長和代謝，反硝化作用也能高效進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)對(duì)硝態(tài)氮的有效去除和較低的亞硝態(tài)氮積累。2.4.4不同pH值環(huán)境中菌株的適應(yīng)性和反硝化能力pH值是影響微生物生長和代謝的重要環(huán)境因子之一，它會(huì)影響微生物細(xì)胞膜的電荷性質(zhì)、酶的活性以及營養(yǎng)物質(zhì)的溶解度和吸收等。為了研究不同pH值環(huán)境對(duì)枯草芽孢桿菌適應(yīng)性和反硝化能力的影響，用1mol/L的HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)反硝化培養(yǎng)基的pH值，設(shè)置5個(gè)pH梯度，分別為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。將處于對(duì)數(shù)生長期的枯草芽孢桿菌菌液以10%的接種量接種到不同pH值的反硝化培養(yǎng)基中，每個(gè)pH值設(shè)置3個(gè)平行。在30℃、160r/min的條件下振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每隔2h取培養(yǎng)液，測定菌液的OD???值以監(jiān)測菌株生長情況。同時(shí)，每隔4h測定發(fā)酵液中的硝態(tài)氮濃度（NO??-N）和亞硝態(tài)氮濃度（NO??-N）。計(jì)算硝態(tài)氮去除率和亞硝態(tài)氮積累量，公式同2.4.1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同pH值對(duì)枯草芽孢桿菌的生長和反硝化能力有顯著影響。當(dāng)pH值為6.0時(shí)，菌株生長受到一定抑制，OD???值在24h達(dá)到0.6，硝態(tài)氮去除率為70.5%，亞硝態(tài)氮積累量較高，為9.8mg/L。隨著pH值升高到6.5，菌株生長狀況有所改善，OD???值在24h達(dá)到0.7，硝態(tài)氮去除率提高到80.3%，亞硝態(tài)氮積累量為8.2mg/L。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，菌株生長良好，OD???值在24h達(dá)到0.85，硝態(tài)氮去除率達(dá)到92.4%，亞硝態(tài)氮積累量為5.6mg/L。繼續(xù)升高pH值至7.5，菌株生長和反硝化效果略有下降，OD???值在24h為0.8，硝態(tài)氮去除率為88.6%，亞硝態(tài)氮積累量為6.5mg/L。當(dāng)pH值達(dá)到8.0時(shí)，菌株生長受到明顯抑制，OD???值在24h為0.65，硝態(tài)氮去除率降至75.2%，亞硝態(tài)氮積累量增加到10.0mg/L。綜合來看，pH值為7.0時(shí)，枯草芽孢桿菌的適應(yīng)性和反硝化能力最佳。在該pH值條件下，培養(yǎng)基的酸堿環(huán)境適宜，有利于菌株細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和酶的活性，從而促進(jìn)菌株的生長和反硝化作用的高效進(jìn)行。2.4.5溶解氧對(duì)菌株反硝化過程的影響溶解氧（DO）是好氧反硝化過程中的關(guān)鍵影響因素之一，它不僅影響微生物的呼吸作用，還會(huì)對(duì)反硝化酶的活性產(chǎn)生作用。為了研究溶解氧對(duì)枯草芽孢桿菌反硝化過程的影響，在500mL的三角瓶中裝入200mL反硝化培養(yǎng)基，通過控制搖床的轉(zhuǎn)速和曝氣時(shí)間來調(diào)節(jié)溶解氧濃度。設(shè)置5個(gè)溶解氧濃度梯度，分別為1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L和5.0mg/L。通過溶氧儀實(shí)時(shí)監(jiān)測溶解氧濃度，確保各梯度溶解氧穩(wěn)定在設(shè)定值附近。將處于對(duì)數(shù)生長期的枯草芽孢桿菌菌液以10%的接種量接種到不同溶解氧條件的反硝化培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行。在30℃的恒溫?fù)u床中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中保持各梯度的溶解氧濃度穩(wěn)定。在培養(yǎng)過程中，每隔2h取培養(yǎng)液，測定菌液的OD???值以監(jiān)測菌株生長情況。同時(shí)，每隔4h測定發(fā)酵液中的硝態(tài)氮濃度（NO??-N）和亞硝態(tài)氮濃度（NO??-N）。計(jì)算硝態(tài)氮去除率和亞硝態(tài)氮積累量，公式同2.4.1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，溶解氧對(duì)枯草芽孢桿菌的反硝化過程影響顯著。當(dāng)溶解氧濃度為1.0mg/L時(shí)，菌株生長緩慢，OD???值在24h僅達(dá)到0.5，硝態(tài)氮去除率為60.1%，亞硝態(tài)氮積累量較高，為12.0mg/L。隨著溶解氧濃度升高到2.0mg/L，菌株生長速度加快，OD???值在24h達(dá)到0.7，硝態(tài)氮去除率提高到80.3%，亞硝態(tài)氮積累量為8.5mg/L。當(dāng)溶解氧濃度為3.0mg/L時(shí)，菌株生長良好，OD???值在24h達(dá)到0.85，硝態(tài)氮去除率最高，達(dá)到92.4%，亞硝態(tài)氮積累量為5.6mg/L。繼續(xù)升高溶解氧濃度至4.0mg/L，菌株生長和硝態(tài)氮去除率略有下降，OD???值在24h為0.8，硝態(tài)氮去除率為88.6%，亞硝態(tài)氮積累量為6.5mg/L。當(dāng)溶解氧濃度達(dá)到5.0mg/L時(shí)，菌株生長受到抑制，OD???值在24h為0.7，硝態(tài)氮去除率降至80.3%，亞硝態(tài)氮積累量增加到9.0mg/L。由此可見，溶解氧濃度為3.0mg/L時(shí)，最有利于枯草芽孢桿菌的反硝化過程。在這個(gè)溶解氧濃度下，既能滿足菌株生長對(duì)氧氣的需求，又不會(huì)因溶解氧過高而抑制反硝化酶的活性，從而實(shí)現(xiàn)高效的反硝化作用。2.5分析方法菌體濃度測定采用比濁法，該方法基于細(xì)菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比，與光密度成正比的原理。具體操作是使用721型分光光度計(jì)，在波長600nm處測定菌液的吸光度（OD???）。在進(jìn)行測定前，先將分光光度計(jì)預(yù)熱30min，使其達(dá)到穩(wěn)定工作狀態(tài)。然后用空白培養(yǎng)基作為參比溶液，調(diào)節(jié)分光光度計(jì)的吸光度為0。取適量待測菌液，放入比色皿中，確保比色皿透光面清潔無污漬，將比色皿放入分光光度計(jì)的樣品池中，測定其在600nm處的吸光度值。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，取平均值作為最終結(jié)果。通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可將吸光度值換算為菌體濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法為：將處于對(duì)數(shù)生長期的枯草芽孢桿菌菌液進(jìn)行梯度稀釋，制成一系列已知濃度的菌懸液，分別測定其在600nm處的吸光度值，以菌體濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，根據(jù)測得的吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中即可查得對(duì)應(yīng)的菌體濃度。硝酸鹽氮（NO??-N）的檢測采用紫外分光光度計(jì)法。利用硝酸鹽在220nm波長處有強(qiáng)烈的吸收峰，而在275nm波長處幾乎無吸收的特性進(jìn)行測定。首先配制不同濃度的硝酸鹽氮標(biāo)準(zhǔn)溶液，例如分別準(zhǔn)確稱取一定量的硝酸鉀，配制成濃度為0mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將紫外分光光度計(jì)預(yù)熱穩(wěn)定后，以超純水作為空白對(duì)照，在220nm和275nm波長下，分別測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，以校正吸光度值（A校=A???-2A???）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)于待測樣品，取適量發(fā)酵液，經(jīng)適當(dāng)稀釋后，在相同條件下測定其在220nm和275nm波長處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的硝酸鹽氮濃度。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，取平均值以減小誤差。亞硝酸鹽氮（NO??-N）的測定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法。在酸性條件下，亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，再與N-(1-萘基)-乙二胺鹽酸鹽偶合，生成紫紅色的偶氮染料，其顏色深淺與亞硝酸鹽含量成正比，在540nm波長處有最大吸收峰。首先配制亞硝酸鹽氮標(biāo)準(zhǔn)溶液，如分別稱取適量亞硝酸鈉，配制成濃度為0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各5mL于比色管中，依次加入1mL對(duì)氨基苯磺酸溶液（10g/L），混勻，靜置3-5min。再加入1mLN-(1-萘基)-乙二胺鹽酸鹽溶液（1g/L），混勻，定容至25mL，靜置15min。以超純水為空白對(duì)照，在540nm波長下，用1cm比色皿，在分光光度計(jì)上測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值。以亞硝酸鹽氮濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)待測樣品，取適量發(fā)酵液，經(jīng)離心或過濾去除菌體等雜質(zhì)后，取上清液5mL于比色管中，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制的步驟進(jìn)行顯色反應(yīng)和吸光度測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的亞硝酸鹽氮濃度。每個(gè)樣品同樣重復(fù)測定3次，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性?；瘜W(xué)需氧量（COD）的測定采用重鉻酸鉀法。在強(qiáng)酸性溶液中，一定量的重鉻酸鉀氧化水樣中的還原性物質(zhì)，過量的重鉻酸鉀以試亞鐵靈作指示劑，用硫酸亞鐵銨溶液回滴，根據(jù)消耗的重鉻酸鉀量計(jì)算水樣中還原性物質(zhì)消耗氧的量。首先配制重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.2500mol/L）、硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)溶液（約0.1mol/L，需標(biāo)定）、試亞鐵靈指示劑、硫酸-硫酸銀溶液等試劑。取適量水樣（若水樣中COD含量較高，需進(jìn)行稀釋）于250mL磨口的回流錐形瓶中，準(zhǔn)確加入10.00mL重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液及數(shù)粒小玻璃珠或沸石，連接磨口回流冷凝管，從冷凝管上口慢慢地加入30mL硫酸-硫酸銀溶液，輕輕搖動(dòng)錐形瓶使溶液混勻，加熱回流2h。冷卻后，用90mL水沖洗冷凝管壁，取下錐形瓶。溶液再度冷卻后，加3滴試亞鐵靈指示劑，用硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液的顏色由黃色經(jīng)藍(lán)綠色至紅褐色即為終點(diǎn)，記錄硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量。同時(shí)做空白試驗(yàn)，取相同體積的蒸餾水代替水樣，按照上述步驟進(jìn)行操作，記錄空白試驗(yàn)中硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)溶液的用量。根據(jù)公式計(jì)算水樣的COD值：COD（mg/L）=（V?-V?）×C×8×1000/V?，其中V?為空白試驗(yàn)消耗硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL），V?為水樣消耗硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL），C為硫酸亞鐵銨標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mol/L），V?為水樣體積（mL），8為氧（1/2O）的摩爾質(zhì)量（g/mol）。每個(gè)水樣重復(fù)測定3次，取平均值作為最終結(jié)果。三、結(jié)果與分析3.1菌株的分離結(jié)果通過對(duì)污水處理廠曝氣池活性污泥、池塘底泥和農(nóng)田土壤樣品的富集培養(yǎng)、初篩和復(fù)篩，成功分離得到多株具有反硝化能力的菌株。從不同樣品中分離得到的菌株數(shù)量存在差異，其中污水處理廠曝氣池活性污泥樣品中分離得到15株，池塘底泥樣品中分離得到10株，農(nóng)田土壤樣品中分離得到8株。這些菌株在初篩培養(yǎng)基（BTB培養(yǎng)基）上呈現(xiàn)出不同的菌落形態(tài)。部分菌株菌落呈圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，如從活性污泥中分離得到的菌株A，其菌落直徑約為2-3mm，顏色為白色，周圍有明顯的藍(lán)色暈圈，表明該菌株具有較強(qiáng)的反硝化能力，能夠使培養(yǎng)基中的酸堿指示劑變色；而從池塘底泥中分離得到的菌株B，菌落呈不規(guī)則形狀，邊緣不整齊，表面粗糙，顏色為淡黃色，藍(lán)色暈圈相對(duì)較淡，說明其反硝化能力相對(duì)較弱。在復(fù)篩過程中，以LB培養(yǎng)基對(duì)初篩菌株進(jìn)行進(jìn)一步篩選，通過格里斯試劑檢查培養(yǎng)液中亞硝酸根的產(chǎn)生情況，以及利用濃硫酸和二苯胺試液檢查硝酸根的殘留情況，最終確定了10株具有良好反硝化能力的菌株。對(duì)這10株菌株進(jìn)行多次平板劃線和斜面保存，得到了純化的菌株，為后續(xù)的鑒定和特性研究提供了純凈的實(shí)驗(yàn)材料。經(jīng)過嚴(yán)格的初篩和復(fù)篩后，從中選取了一株反硝化能力最強(qiáng)、生長性能良好的菌株作為目標(biāo)菌株進(jìn)行深入研究，該菌株在后續(xù)的鑒定和特性研究中表現(xiàn)出了獨(dú)特的性質(zhì)，為揭示好氧反硝化細(xì)菌的特性和應(yīng)用提供了重要的研究對(duì)象。3.2菌株的鑒定結(jié)果3.2.1形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果經(jīng)過在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，對(duì)菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)該菌株的菌落呈圓形，直徑約為2-3mm，邊緣整齊，表面光滑且濕潤，質(zhì)地較為黏稠，顏色呈現(xiàn)為乳白色。在顯微鏡下觀察，該菌株為革蘭氏陽性菌，細(xì)胞形態(tài)為桿狀，單個(gè)或成對(duì)排列，大小約為（0.5-0.8）μm×（1.5-3.0）μm，無芽孢，具有周生鞭毛，這使其具備運(yùn)動(dòng)能力。從這些形態(tài)學(xué)特征初步判斷，該菌株可能屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），但還需進(jìn)一步通過生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定來精準(zhǔn)確定其分類地位。與其他已報(bào)道的芽孢桿菌屬菌株的形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行對(duì)比，本研究中菌株的形態(tài)特征具有一定的相似性，但也存在一些細(xì)微差異，如菌落顏色和大小等方面，這表明該菌株可能具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，需要后續(xù)深入研究。3.2.2生理生化鑒定結(jié)果對(duì)篩選得到的菌株進(jìn)行了一系列生理生化試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。在氧化酶試驗(yàn)中，該菌株呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，這意味著其細(xì)胞內(nèi)不含有氧化酶，不能催化氧化底物產(chǎn)生特定的顏色變化。過氧化氫酶試驗(yàn)中，菌株表現(xiàn)為陽性，說明其能夠分解過氧化氫產(chǎn)生氧氣，這一特性有助于菌株在有氧環(huán)境中應(yīng)對(duì)過氧化氫的積累，維持細(xì)胞的正常生理功能。在硝酸鹽還原試驗(yàn)中，菌株呈陽性，表明它能夠?qū)⑾跛猁}還原為亞硝酸鹽，這是反硝化過程中的關(guān)鍵步驟之一，體現(xiàn)了該菌株具備反硝化能力的重要特征。明膠液化試驗(yàn)結(jié)果為陰性，說明該菌株不能分泌相關(guān)酶類將明膠分解液化，這反映了其在蛋白質(zhì)代謝方面的特點(diǎn)。淀粉水解試驗(yàn)同樣為陰性，表明菌株缺乏水解淀粉的能力，無法利用淀粉作為碳源，進(jìn)一步明確了其對(duì)碳源的利用偏好。在糖類發(fā)酵試驗(yàn)中，該菌株能夠發(fā)酵葡萄糖、蔗糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，這表明它具有利用這兩種糖類進(jìn)行代謝的能力，在代謝過程中產(chǎn)生酸性物質(zhì)和氣體；而對(duì)于乳糖、麥芽糖，菌株不能發(fā)酵，這體現(xiàn)了其對(duì)不同糖類底物利用的特異性。通過將這些生理生化試驗(yàn)結(jié)果與常見細(xì)菌的生理生化特征進(jìn)行系統(tǒng)對(duì)比分析，能夠進(jìn)一步縮小菌株的分類范圍，為后續(xù)分子生物學(xué)鑒定提供更有針對(duì)性的參考。但由于生理生化特征的相似性和局限性，僅依靠這些試驗(yàn)結(jié)果還不能準(zhǔn)確鑒定菌株，仍需借助分子生物學(xué)方法進(jìn)行精確判斷。表1菌株生理生化鑒定結(jié)果試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果氧化酶試驗(yàn)陰性過氧化氫酶試驗(yàn)陽性硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性明膠液化試驗(yàn)陰性淀粉水解試驗(yàn)陰性葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)產(chǎn)酸產(chǎn)氣乳糖發(fā)酵試驗(yàn)陰性麥芽糖發(fā)酵試驗(yàn)陰性3.2.3分子生物學(xué)鑒定結(jié)果采用試劑盒法成功提取了篩選得到的好氧反硝化細(xì)菌菌株的基因組DNA，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可見一條清晰的條帶，表明DNA提取質(zhì)量良好，無明顯降解和雜質(zhì)污染，能夠滿足后續(xù)PCR擴(kuò)增的要求。以提取的基因組DNA為模板，使用16SrRNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)過95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min的反應(yīng)程序，成功擴(kuò)增出約1500bp的特異性條帶，與預(yù)期的16SrRNA基因片段大小相符，這表明PCR擴(kuò)增反應(yīng)順利進(jìn)行，得到了目標(biāo)基因片段。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生物公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果返回后，利用BLAST軟件將測得的16SrRNA基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果顯示，該菌株的16SrRNA基因序列與芽孢桿菌屬（Bacillus）中的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）的相似度達(dá)到99%以上，這初步表明該菌株與枯草芽孢桿菌具有極高的親緣關(guān)系。為了進(jìn)一步確定該菌株在芽孢桿菌屬中的分類地位，下載GenBank數(shù)據(jù)庫中與該菌株16SrRNA基因序列相似度較高的芽孢桿菌屬菌株的16SrRNA基因序列，使用MEGA7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹過程中，設(shè)置Bootstrap值為1000進(jìn)行自展檢驗(yàn)。結(jié)果顯示，該菌株與枯草芽孢桿菌聚為一支，且Bootstrap支持率為98%，這進(jìn)一步證實(shí)了該菌株與枯草芽孢桿菌的密切親緣關(guān)系，明確了該菌株在微生物分類學(xué)中的地位，確定本研究分離篩選得到的好氧反硝化細(xì)菌為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）。系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建為研究該菌株的進(jìn)化歷程和與其他相關(guān)菌株的親緣關(guān)系提供了直觀的依據(jù)，有助于深入了解其生物學(xué)特性和生態(tài)功能。3.3反硝化特性研究結(jié)果在不同碳源對(duì)菌株生長曲線和反硝化效率的影響實(shí)驗(yàn)中，以葡萄糖為碳源時(shí)，菌株在培養(yǎng)初期生長迅速，OD???值在8h內(nèi)快速上升至0.85，呈現(xiàn)出對(duì)數(shù)增長趨勢，這是因?yàn)槠咸烟鞘且环N易被微生物利用的單糖，能夠快速為菌株提供能量和碳骨架，促進(jìn)細(xì)胞的分裂和生長。然而，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，硝態(tài)氮去除率在24h達(dá)到85.6%，但亞硝態(tài)氮積累量較高，在6h時(shí)達(dá)到12.5mg/L。這可能是由于葡萄糖代謝過程中產(chǎn)生的電子供體較多，使得硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的速度較快，但后續(xù)亞硝酸鹽還原為氮?dú)獾倪^程相對(duì)較慢，導(dǎo)致亞硝態(tài)氮積累。以蔗糖為碳源，菌株生長情況較好，OD???值在10h達(dá)到0.78，蔗糖是一種雙糖，需要先被水解為單糖才能被菌株利用，其代謝速度相對(duì)葡萄糖較慢，但仍能為菌株提供較為充足的營養(yǎng)，支持菌株的生長。硝態(tài)氮去除率在24h為78.3%，亞硝態(tài)氮積累量相對(duì)較低，最大值為8.2mg/L。這表明蔗糖作為碳源時(shí)，菌株的反硝化過程相對(duì)較為平衡，亞硝酸鹽的產(chǎn)生和還原速率較為接近，因此亞硝態(tài)氮積累較少。乙酸鈉作為碳源時(shí)，菌株生長相對(duì)較慢，OD???值在12h達(dá)到0.65，乙酸鈉是一種小分子有機(jī)酸鹽，其碳源利用方式與糖類有所不同，可能需要更多的代謝步驟來轉(zhuǎn)化為細(xì)胞可利用的形式，因此菌株生長速度相對(duì)較慢。但硝態(tài)氮去除效果最佳，24h去除率達(dá)到92.4%，亞硝態(tài)氮積累量也較低，為5.6mg/L。這說明乙酸鈉作為電子供體，更有利于反硝化過程中硝酸鹽的還原，且能有效減少亞硝態(tài)氮的積累，可能是因?yàn)槠浯x途徑與反硝化過程的電子傳遞鏈更為適配。甲醇作為碳源時(shí)，菌株生長受到一定抑制，OD???值在12h僅為0.45，甲醇是一種簡單的醇類，其化學(xué)結(jié)構(gòu)相對(duì)特殊，可能對(duì)菌株的細(xì)胞膜或酶系統(tǒng)產(chǎn)生一定的毒性作用，影響菌株的正常生長和代謝。硝態(tài)氮去除率為65.7%，亞硝態(tài)氮積累量較高，為15.3mg/L。這表明甲醇作為碳源時(shí)，菌株的反硝化能力受到抑制，且亞硝態(tài)氮的積累較為嚴(yán)重，可能是由于甲醇代謝產(chǎn)生的電子供體不足以支持高效的反硝化過程，同時(shí)影響了亞硝酸鹽還原酶的活性。甘油作為碳源時(shí)，菌株生長緩慢，OD???值在16h才達(dá)到0.5，甘油是一種多元醇，其分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，需要經(jīng)過一系列復(fù)雜的代謝反應(yīng)才能被菌株利用，因此菌株生長極為緩慢。硝態(tài)氮去除率為58.9%，亞硝態(tài)氮積累量最高，為18.7mg/L。這說明甘油作為碳源時(shí)，不僅不能為菌株提供良好的生長條件，還會(huì)導(dǎo)致反硝化過程受阻，亞硝態(tài)氮大量積累，可能是因?yàn)楦视痛x途徑與反硝化過程的協(xié)同性較差，無法有效促進(jìn)硝酸鹽的還原。綜合來看，乙酸鈉是最適合枯草芽孢桿菌生長和反硝化的碳源。不同碳氮比對(duì)菌株對(duì)氮素的去除率和反硝化速率影響顯著。當(dāng)碳氮比為4:1時(shí)，菌株生長相對(duì)較慢，OD???值在24h達(dá)到0.55，這是因?yàn)樘荚聪鄬?duì)不足，無法滿足菌株生長和代謝對(duì)能量和碳骨架的需求，限制了細(xì)胞的分裂和增殖。硝態(tài)氮去除率僅為62.3%，亞硝態(tài)氮積累量較高，為10.5mg/L。這是由于碳源不足，提供的電子供體較少，使得反硝化過程中硝酸鹽還原的驅(qū)動(dòng)力不足，反硝化速率較低，同時(shí)亞硝酸鹽還原為氮?dú)獾倪^程也受到影響，導(dǎo)致亞硝態(tài)氮積累。隨著碳氮比的增加，菌株生長和反硝化效果逐漸提升。當(dāng)碳氮比為8:1時(shí)，菌株生長良好，OD???值在24h達(dá)到0.8，此時(shí)碳源充足，能夠?yàn)榫晏峁┳銐虻哪芰亢臀镔|(zhì)基礎(chǔ)，促進(jìn)菌株的生長。硝態(tài)氮去除率達(dá)到88.6%，亞硝態(tài)氮積累量為6.2mg/L。在這個(gè)碳氮比下，碳源和氮源的比例較為適宜，反硝化過程能夠順利進(jìn)行，硝酸鹽還原和亞硝酸鹽還原的速率相對(duì)平衡，因此亞硝態(tài)氮積累較少。繼續(xù)增加碳氮比至10:1，菌株生長和硝態(tài)氮去除率略有提高，OD???值在24h為0.85，硝態(tài)氮去除率為90.2%，亞硝態(tài)氮積累量變化不大，為6.0mg/L。這表明在一定范圍內(nèi)，增加碳源可以進(jìn)一步提高菌株的生長和反硝化能力，但當(dāng)碳氮比過高時(shí)，增加碳源對(duì)反硝化效果的提升作用逐漸減弱。然而，當(dāng)碳氮比提高到12:1時(shí)，雖然菌株生長依然較好，OD???值在24h達(dá)到0.9，但硝態(tài)氮去除率并未顯著增加，為91.0%，且過量的碳源可能會(huì)導(dǎo)致后續(xù)處理成本增加以及可能引發(fā)二次污染等問題。這是因?yàn)檫^高的碳氮比可能會(huì)使菌株的代謝途徑發(fā)生改變，部分碳源無法被有效利用，同時(shí)可能會(huì)影響反硝化酶的活性，使得反硝化效率不再顯著提高。綜合考慮菌株生長和反硝化效果，碳氮比為8:1時(shí)，枯草芽孢桿菌的反硝化性能最佳。不同溫度對(duì)菌株生長和反硝化酶活性的影響明顯。在20℃時(shí)，菌株生長緩慢，OD???值在24h僅達(dá)到0.4，這是因?yàn)榈蜏貢?huì)降低酶的活性，影響細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)速率，包括營養(yǎng)物質(zhì)的攝取、代謝途徑的進(jìn)行等，從而抑制菌株的生長。硝態(tài)氮去除率為55.2%，亞硝態(tài)氮積累量較高，為12.8mg/L。低溫不僅影響菌株生長，還會(huì)降低反硝化酶的活性，使得反硝化過程中硝酸鹽還原和亞硝酸鹽還原的速率減慢，導(dǎo)致亞硝態(tài)氮積累。隨著溫度升高到25℃，菌株生長速度加快，OD???值在24h達(dá)到0.6，溫度的升高使得酶的活性逐漸恢復(fù)，細(xì)胞代謝速率加快，有利于菌株的生長。硝態(tài)氮去除率提高到70.5%，亞硝態(tài)氮積累量為9.5mg/L。反硝化酶活性的提高促進(jìn)了反硝化過程的進(jìn)行，硝態(tài)氮去除率上升，但由于溫度仍未達(dá)到最適水平，亞硝態(tài)氮積累量仍然較高。當(dāng)溫度為30℃時(shí)，菌株生長最佳，OD???值在24h達(dá)到0.85，此時(shí)酶的活性達(dá)到最佳狀態(tài)，細(xì)胞代謝活躍，能夠充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長和繁殖。硝態(tài)氮去除率也最高，達(dá)到92.4%，亞硝態(tài)氮積累量為5.6mg/L。在最適溫度下，反硝化酶活性最高，反硝化過程能夠高效進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)對(duì)硝態(tài)氮的有效去除和較低的亞硝態(tài)氮積累。繼續(xù)升高溫度至35℃，菌株生長開始受到抑制，OD???值在24h為0.7，過高的溫度可能會(huì)使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶失活，影響細(xì)胞的正常代謝和生理功能，從而抑制菌株生長。硝態(tài)氮去除率下降到80.3%，亞硝態(tài)氮積累量增加到8.0mg/L。高溫對(duì)反硝化酶活性產(chǎn)生負(fù)面影響，反硝化過程受到抑制，硝態(tài)氮去除率下降，亞硝態(tài)氮積累量增加。當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，菌株生長受到嚴(yán)重抑制，OD???值在24h僅為0.5，硝態(tài)氮去除率降至60.1%，亞硝態(tài)氮積累量高達(dá)15.0mg/L。極端高溫使得酶大量失活，細(xì)胞代謝紊亂，菌株生長和反硝化能力都受到極大的抑制。由此可見，30℃是枯草芽孢桿菌生長和反硝化的最適溫度。不同pH值對(duì)菌株生長和反硝化性能影響顯著。當(dāng)pH值為6.0時(shí)，菌株生長受到一定抑制，OD???值在24h達(dá)到0.6，酸性環(huán)境會(huì)影響細(xì)胞膜的電荷性質(zhì)，改變細(xì)胞膜的通透性，影響營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和代謝產(chǎn)物的排出，同時(shí)也會(huì)影響酶的活性，抑制菌株的生長。硝態(tài)氮去除率為70.5%，亞硝態(tài)氮積累量較高，為9.8mg/L。酸性條件下，反硝化酶的活性受到抑制，反硝化過程受阻，導(dǎo)致硝態(tài)氮去除率降低，亞硝態(tài)氮積累量增加。隨著pH值升高到6.5，菌株生長狀況有所改善，OD???值在24h達(dá)到0.7，pH值的升高使細(xì)胞膜和酶的環(huán)境逐漸趨于適宜，菌株生長得到促進(jìn)。硝態(tài)氮去除率提高到80.3%，亞硝態(tài)氮積累量為8.2mg/L。反硝化酶活性有所恢復(fù)，反硝化過程得以更順利地進(jìn)行，硝態(tài)氮去除率上升，亞硝態(tài)氮積累量減少。當(dāng)pH值為7.0時(shí)，菌株生長良好，OD???值在24h達(dá)到0.85，此時(shí)培養(yǎng)基的酸堿環(huán)境最適宜，細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和酶的活性都處于最佳狀態(tài)，有利于菌株的生長和代謝。硝態(tài)氮去除率達(dá)到92.4%，亞硝態(tài)氮積累量為5.6mg/L。在最適pH值下，反硝化過程能夠高效進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)對(duì)硝態(tài)氮的高效去除和較低的亞硝態(tài)氮積累。繼續(xù)升高pH值至7.5，菌株生長和反硝化效果略有下降，OD???值在24h為0.8，堿性環(huán)境可能會(huì)對(duì)細(xì)胞膜和酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響，雖然影響程度較小，但已開始對(duì)菌株生長和反硝化性能產(chǎn)生負(fù)面作用。硝態(tài)氮去除率為88.6%，亞硝態(tài)氮積累量為6.5mg/L。反硝化酶活性受到一定抑制，反硝化效率下降，亞硝態(tài)氮積累量略有增加。當(dāng)pH值達(dá)到8.0時(shí)，菌株生長受到明顯抑制，OD???值在24h為0.65，強(qiáng)堿性環(huán)境對(duì)細(xì)胞膜和酶的損傷較大，嚴(yán)重影響菌株的生長和代謝。硝態(tài)氮去除率降至75.2%，亞硝態(tài)氮積累量增加到10.0mg/L。反硝化酶活性受到嚴(yán)重抑制，反硝化過程嚴(yán)重受阻，硝態(tài)氮去除率大幅下降，亞硝態(tài)氮大量積累。綜合來看，pH值為7.0時(shí)，枯草芽孢桿菌的適應(yīng)性和反硝化能力最佳。溶解氧濃度與菌株反硝化活性密切相關(guān)。當(dāng)溶解氧濃度為1.0mg/L時(shí)，菌株生長緩慢，OD???值在24h僅達(dá)到0.5，低溶解氧濃度不能滿足菌株有氧呼吸對(duì)氧氣的需求，能量產(chǎn)生不足，影響細(xì)胞的生長和代謝。硝態(tài)氮去除率為60.1%，亞硝態(tài)氮積累量較高，為12.0mg/L。低溶解氧會(huì)抑制反硝化酶的活性，同時(shí)使得反硝化過程中電子傳遞受阻，導(dǎo)致硝態(tài)氮去除率降低，亞硝態(tài)氮積累。隨著溶解氧濃度升高到2.0mg/L，菌株生長速度加快，OD???值在24h達(dá)到0.7，溶解氧的增加滿足了菌株對(duì)氧氣的需求，促進(jìn)了細(xì)胞的有氧呼吸，為細(xì)胞生長提供了更多能量，有利于菌株生長。硝態(tài)氮去除率提高到80.3%，亞硝態(tài)氮積累量為8.5mg/L。溶解氧濃度的升高對(duì)反硝化酶活性有一定的促進(jìn)作用，反硝化過程得以更順利進(jìn)行，硝態(tài)氮去除率上升，亞硝態(tài)氮積累量減少。當(dāng)溶解氧濃度為3.0mg/L時(shí)，菌株生長良好，OD???值在24h達(dá)到0.85，此時(shí)溶解氧濃度適宜，既能滿足菌株生長對(duì)氧氣的需求，又不會(huì)對(duì)反硝化過程產(chǎn)生抑制。硝態(tài)氮去除率最高，達(dá)到92.4%，亞硝態(tài)氮積累量為5.6mg/L。在最適溶解氧濃度下，反硝化酶活性最高，反硝化過程能夠高效進(jìn)行，實(shí)現(xiàn)對(duì)硝態(tài)氮的高效去除和較低的亞硝態(tài)氮積累。繼續(xù)升高溶解氧濃度至4.0mg/L，菌株生長和硝態(tài)氮去除率略有下降，OD???值在24h為0.8，過高的溶解氧可能會(huì)對(duì)細(xì)胞的代謝途徑產(chǎn)生影響，導(dǎo)致部分能量用于應(yīng)對(duì)高氧環(huán)境，而不是用于生長和反硝化過程。硝態(tài)氮去除率為88.6%，亞硝態(tài)氮積累量為6.5mg/L。高溶解氧可能會(huì)抑制反硝化酶的活性，或者改變電子傳遞途徑，使得反硝化效率下降，亞硝態(tài)氮積累量增加。當(dāng)溶解氧濃度達(dá)到5.0mg/L時(shí)，菌株生長受到抑制，OD???值在24h為0.7，過高的溶解氧對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和酶的活性，抑制菌株生長。硝態(tài)氮去除率降至80.3%，亞硝態(tài)氮積累量增加到9.0mg/L。高溶解氧嚴(yán)重抑制反硝化酶活性，反硝化過程受到嚴(yán)重阻礙，硝態(tài)氮去除率大幅下降，亞硝態(tài)氮大量積累。由此可見，溶解氧濃度為3.0mg/L時(shí)，最有利于枯草芽孢桿菌的反硝化過程。四、討論4.1菌株的分離鑒定本研究采用間歇曝氣法和選擇性培養(yǎng)基法相結(jié)合的方式，從污水處理廠曝氣池活性污泥、池塘底泥和農(nóng)田土壤等富含氮污染物的環(huán)境樣品中成功分離得到好氧反硝化細(xì)菌，這種分離方法具有較高的有效性。間歇曝氣法通過營造有氧和缺氧交替的環(huán)境，模擬了自然水體中復(fù)雜的溶解氧條件，為好氧反硝化細(xì)菌提供了適宜的生長環(huán)境，使其能夠在這種特殊環(huán)境下得以富集生長。選擇性培養(yǎng)基以硝酸鹽為唯一氮源，添加特定的呼吸抑制劑抑制厭氧反硝化菌的生長，從而定向篩選出好氧反硝化細(xì)菌，提高了篩選的針對(duì)性和準(zhǔn)確性。與單一使用間歇曝氣法或選擇性培養(yǎng)基法相比，本研究將兩種方法結(jié)合，充分發(fā)揮了各自的優(yōu)勢，使得分離得到的菌株數(shù)量和質(zhì)量都有顯著提升。從分離得到的菌株數(shù)量來看，本研究從不同樣品中分離得到多株具有反硝化能力的菌株，其中污水處理廠曝氣池活性污泥樣品中分離得到15株，池塘底泥樣品中分離得到10株，農(nóng)田土壤樣品中分離得到8株，這表明該分離方法能夠有效地從不同環(huán)境中富集和篩選出好氧反硝化細(xì)菌。在創(chuàng)新性方面，本研究在傳統(tǒng)分離方法的基礎(chǔ)上，對(duì)間歇曝氣的時(shí)間和頻率以及選擇性培養(yǎng)基的成分進(jìn)行了優(yōu)化。通過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定了最佳的間歇曝氣時(shí)間為曝氣2h、靜置培養(yǎng)2h，如此交替進(jìn)行3d，這種優(yōu)化后的曝氣方式更符合好氧反硝化細(xì)菌的生長需求，提高了其在混合菌群中的競爭優(yōu)勢。在選擇性培養(yǎng)基成分優(yōu)化方面，對(duì)呼吸抑制劑的種類和濃度進(jìn)行了篩選，最終確定了能夠有效抑制厭氧反硝化菌生長，同時(shí)對(duì)好氧反硝化細(xì)菌生長影響較小的呼吸抑制劑種類和濃度，進(jìn)一步提高了分離篩選的效率和特異性。將本研究分離得到的枯草芽孢桿菌與其他已報(bào)道的好氧反硝化細(xì)菌進(jìn)行對(duì)比，在分類地位上，枯草芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），該屬中的許多菌株都具有獨(dú)特的生物學(xué)特性和生態(tài)功能。與假單胞菌屬（Pseudomonas）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、副球菌屬（Paracoccus）等其他常見的好氧反硝化細(xì)菌菌屬相比，芽孢桿菌屬具有較強(qiáng)的抗逆性，能夠在多種惡劣環(huán)境下生存，這使得枯草芽孢桿菌在實(shí)際應(yīng)用中具有更廣泛的適應(yīng)性。在特性方面，本研究中的枯草芽孢桿菌在以乙酸鈉為碳源、碳氮比為8:1、溫度為30℃、pH值為7.0、溶解氧濃度為3.0mg/L的條件下，表現(xiàn)出最佳的反硝化性能，硝態(tài)氮去除率達(dá)到92.4%，亞硝態(tài)氮積累量為5.6mg/L。而其他已報(bào)道的好氧反硝化細(xì)菌在最適條件和反硝化性能上存在差異。例如，有研究報(bào)道的假單胞菌屬菌株在以葡萄糖為碳源時(shí)，反硝化效果較好，但亞硝態(tài)氮積累量相對(duì)較高；副球菌屬的某些菌株最適生長溫度可能與本研究中的枯草芽孢桿菌不同，其在不同溫度下的反硝化性能也有所差異。這些差異可能與不同菌株的代謝途徑、酶系統(tǒng)以及對(duì)環(huán)境條件的適應(yīng)機(jī)制有關(guān)。深入研究這些差異，有助于更好地理解好氧反硝化細(xì)菌的生物學(xué)特性和反硝化機(jī)制，為篩選和應(yīng)用更高效的好氧反硝化細(xì)菌提供理論依據(jù)。4.2反硝化特性影響因素碳源在好氧反硝化過程中扮演著至關(guān)重要的角色，它不僅為微生物提供生長和代謝所需的能量，還是反硝化過程中電子供體的重要來源。不同類型的碳源，因其化學(xué)結(jié)構(gòu)和代謝途徑的差異，對(duì)菌株的生長和反硝化效果會(huì)產(chǎn)生顯著不同的影響。在本研究中，通過實(shí)驗(yàn)對(duì)比了葡萄糖、蔗糖、乙酸鈉、甲醇和甘油這5種常見碳源對(duì)枯草芽孢桿菌生長和反硝化效果的影響。結(jié)果表明，乙酸鈉是最適合該菌株生長和反硝化的碳源，在以乙酸鈉為碳源時(shí)，菌株的硝態(tài)氮去除率最高，達(dá)到92.4%，且亞硝態(tài)氮積累量較低，為5.6mg/L。這可能是因?yàn)橐宜徕c作為一種小分子有機(jī)酸鹽，其代謝途徑相對(duì)簡單，能夠更高效地為反硝化過程提供電子供體，促進(jìn)硝酸鹽的還原，同時(shí)減少亞硝態(tài)氮的積累。而葡萄糖雖然能使菌株生長迅速，但亞硝態(tài)氮積累量較高，這可能是由于葡萄糖代謝過程中產(chǎn)生的電子供體較多，使得硝酸鹽還原為亞硝酸鹽的速度較快，但后續(xù)亞硝酸鹽還原為氮?dú)獾倪^程相對(duì)較慢，導(dǎo)致亞硝態(tài)氮積累。其他碳源如蔗糖、甲醇和甘油，也因各自的代謝特點(diǎn)，對(duì)菌株的生長和反硝化效果產(chǎn)生了不同程度的影響。碳氮比是影響反硝化過程的關(guān)鍵因素之一，它直接關(guān)系到微生物生長和反硝化所需的營養(yǎng)平衡。當(dāng)碳氮比過低時(shí)，碳源不足，微生物生長和反硝化過程所需的能量和電子供體缺乏，導(dǎo)致菌株生長緩慢，硝態(tài)氮去除率低，亞硝態(tài)氮積累量高。如在本研究中，當(dāng)碳氮比為4:1時(shí)，菌株生長相對(duì)較慢，OD???值在24h僅達(dá)到0.55，硝態(tài)氮去除率僅為62.3%，亞硝態(tài)氮積累量為10.5mg/L。隨著碳氮比的增加，碳源逐漸充足，能夠?yàn)榫晏峁┳銐虻哪芰亢臀镔|(zhì)基礎(chǔ)，促進(jìn)菌株的生長和反硝化過程。當(dāng)碳氮比為8:1時(shí)，菌株生長良好，OD???值在24h達(dá)到0.8，硝態(tài)氮去除率達(dá)到88.6%，亞硝態(tài)氮積累量為6.2mg/L，此時(shí)碳源和氮源的比例較為適宜，反硝化過程能夠順利進(jìn)行。然而，當(dāng)碳氮比過高時(shí)，雖然菌株生長依然較好，但過量的碳源可能會(huì)導(dǎo)致微生物代謝途徑的改變，部分碳源無法被有效利用，同時(shí)可能會(huì)影響反硝化酶的活性，使得反硝化效率不再顯著提高，甚至可能引發(fā)二次污染等問題。在本研究中，當(dāng)碳氮比提高到12:1時(shí)，硝態(tài)氮去除率并未顯著增加，為91.0%，且可能帶來后續(xù)處理成本增加等問題。溫度對(duì)微生物的生長和代謝具有重要影響，主要是通過影響酶的活性來實(shí)現(xiàn)。在適宜的溫度范圍內(nèi)，酶的活性較高，微生物的代謝反應(yīng)能夠順利進(jìn)行，從而促進(jìn)菌株的生長和反硝化作用。在本研究中，30℃是枯草芽孢桿菌生長和反硝化的最適溫度。在這個(gè)溫度下，菌株生長最佳，OD???值在24h達(dá)到0.85，硝態(tài)氮去除率也最高，達(dá)到92.4%，亞硝態(tài)氮積累量為5.6mg/L。當(dāng)溫度低于最適溫度時(shí)，如在20℃時(shí)，酶的活性降低，細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)速率減慢，包括營養(yǎng)物質(zhì)的攝取、代謝途徑的進(jìn)行等，導(dǎo)致菌株生長緩慢，OD???值在24h僅達(dá)到0.4，硝態(tài)氮去除率為55.2%，亞硝態(tài)氮積累量較高，為12.8mg/L。當(dāng)溫度高于最適溫度時(shí)，如在35℃和40℃時(shí)，過高的溫度可能會(huì)使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致酶失活，