姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑：靶向XIAP攻克人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的新策略一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全球胃癌新增病例約108.9萬(wàn)例，死亡病例約76.9萬(wàn)例，其發(fā)病率居全部惡性腫瘤第5位，死亡率居第4位。在中國(guó)，胃癌的形勢(shì)更為嚴(yán)峻，全球近44%的新發(fā)病例和近49%的致死病例發(fā)生在中國(guó)。胃癌患者早期癥狀往往不明顯，確診時(shí)多已處于中晚期，手術(shù)切除率低，且術(shù)后復(fù)發(fā)率高?；熓侵型砥谖赴┚C合治療的重要手段之一，但化療藥物的耐藥性和不良反應(yīng)限制了其療效和患者的生活質(zhì)量。因此，尋找更有效的治療方法和藥物，提高胃癌治療效果，是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。姜黃素是從姜黃根莖中提取的一種疏水性多酚類(lèi)化合物，具有廣泛的藥理活性，如抗菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等。美國(guó)食品和藥物管理局已批準(zhǔn)姜黃素作為植物藥使用，相關(guān)安全性和毒性臨床試驗(yàn)表明，人體對(duì)其有較高的耐受性，可接受劑量達(dá)4-8g/d，甚至有報(bào)道稱(chēng)人體對(duì)高達(dá)12g/d的姜黃素仍可耐受。在抗腫瘤方面，姜黃素作用機(jī)制多樣，包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及自噬、調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路及基因表達(dá)、抑制細(xì)胞侵襲及遷移、誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生、抑制腫瘤血管及淋巴管生成、化療增敏及逆轉(zhuǎn)化療耐藥等。在抗胃癌研究中，姜黃素可通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1等表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)變；可激活p53信號(hào)通路，上調(diào)p53和p21表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡；還能抑制磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信號(hào)通路，發(fā)揮抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用。奧沙利鉑是第三代鉑類(lèi)化合物，化學(xué)名為左旋反式二氨環(huán)己烷草酸鉑，臨床前研究表明其對(duì)人和鼠多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，且對(duì)各種順鉑耐藥的腫瘤細(xì)胞株無(wú)交叉耐藥。大量臨床資料顯示，奧沙利鉑在治療多種類(lèi)型腫瘤時(shí)，無(wú)論單用或聯(lián)合應(yīng)用都有較高的療效，耐受性好，毒副作用小，化療指數(shù)高，安全范圍廣，是胃癌化療的常用藥物之一。其作用機(jī)制主要包括與腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合，阻止DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂；觸發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡程序，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；抑制腫瘤血管生成，減少腫瘤的血液供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中作用最強(qiáng)的一員，可直接抑制凋亡起始因子caspase-9以及效應(yīng)分子caspase-3與caspase-7的活性，抑制細(xì)胞對(duì)外源性凋亡誘導(dǎo)信號(hào)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，參與腫瘤細(xì)胞的異常增殖。研究表明，XIAP在人胃癌組織中高表達(dá)，且與患者預(yù)后不良相關(guān)。因此，靶向XIAP成為胃癌治療的一個(gè)有前景的策略。奧沙利鉑被證實(shí)可下調(diào)胃癌細(xì)胞中XIAP的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等有關(guān)，這些通路可上調(diào)XIAP表達(dá)。雖然姜黃素和奧沙利鉑單獨(dú)應(yīng)用對(duì)胃癌細(xì)胞均有抑制作用，但二者聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)及其XIAP表達(dá)的影響尚不完全明確。研究二者聯(lián)合作用，有望揭示新的作用機(jī)制，為胃癌的臨床治療提供更有效的聯(lián)合用藥方案，提高治療效果，改善患者預(yù)后。這對(duì)于攻克胃癌這一醫(yī)學(xué)難題，減輕患者痛苦，具有重要的理論和實(shí)際意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在胃癌治療領(lǐng)域，姜黃素與奧沙利鉑的研究備受關(guān)注，XIAP在胃癌中的作用機(jī)制也是研究熱點(diǎn)，以下是對(duì)相關(guān)國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀的梳理。在姜黃素治療胃癌的研究方面，國(guó)外學(xué)者較早關(guān)注到姜黃素的抗癌潛力。美國(guó)的一些研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠通過(guò)多種途徑抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，如調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，使胃癌細(xì)胞周期阻滯在特定時(shí)期，進(jìn)而抑制其增殖。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，姜黃素可激活相關(guān)凋亡信號(hào)通路，促使癌細(xì)胞凋亡。國(guó)內(nèi)研究也取得了豐碩成果，深入探討了姜黃素對(duì)不同胃癌細(xì)胞株的作用，如對(duì)BGC-823、SGC-7901等細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)姜黃素不僅能抑制細(xì)胞增殖，還能降低細(xì)胞的侵襲和遷移能力，其機(jī)制與調(diào)控相關(guān)基因和蛋白表達(dá)有關(guān)，像下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1、上調(diào)p53和p21等。奧沙利鉑作為胃癌化療常用藥物，國(guó)外對(duì)其作用機(jī)制和臨床應(yīng)用進(jìn)行了大量研究。明確了奧沙利鉑主要通過(guò)與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合，干擾DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)；同時(shí)能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，激活caspase家族蛋白酶，促使癌細(xì)胞走向凋亡。在臨床應(yīng)用中，奧沙利鉑與其他化療藥物聯(lián)合方案不斷優(yōu)化，以提高療效。國(guó)內(nèi)研究同樣圍繞奧沙利鉑的臨床療效和安全性展開(kāi)，探索其在不同分期胃癌治療中的應(yīng)用，以及與其他治療手段聯(lián)合的可行性，如奧沙利鉑聯(lián)合卡培他濱、替吉奧等藥物用于胃癌術(shù)后輔助化療或晚期姑息化療，取得了一定的治療效果。關(guān)于姜黃素與奧沙利鉑聯(lián)合治療胃癌的研究，國(guó)外有研究表明二者聯(lián)合對(duì)胃癌細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用，聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖抑制率明顯高于單藥組，且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用更強(qiáng)。國(guó)內(nèi)學(xué)者也通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這種協(xié)同效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑能顯著抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與調(diào)控多條信號(hào)通路有關(guān)。在XIAP與胃癌的研究方面，國(guó)外研究揭示了XIAP在胃癌細(xì)胞中高表達(dá)，通過(guò)抑制caspase-3、caspase-7和caspase-9等凋亡蛋白酶的活性，阻止細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活和增殖。并且發(fā)現(xiàn)XIAP高表達(dá)與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，可作為評(píng)估胃癌預(yù)后的潛在指標(biāo)。國(guó)內(nèi)研究進(jìn)一步探討了XIAP在胃癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，如XIAP表達(dá)受多種信號(hào)通路調(diào)控，像Wnt/β-catenin、NF-κB等信號(hào)通路激活可上調(diào)XIAP表達(dá)，而抑制這些通路則能降低XIAP表達(dá)，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。此外，還研究了針對(duì)XIAP的靶向治療策略，為胃癌治療提供了新的思路。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，明確聯(lián)合用藥是否具有協(xié)同抑制作用，以及該聯(lián)合用藥對(duì)人胃癌細(xì)胞XIAP表達(dá)的調(diào)控作用，并初步探討其潛在的分子機(jī)制，為胃癌的臨床治療提供更有效的聯(lián)合用藥方案和理論依據(jù)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：一是全面分析姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同抑制效應(yīng)，通過(guò)多維度實(shí)驗(yàn)，如細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期分析等，深入探究聯(lián)合用藥的效果，為臨床聯(lián)合用藥提供更全面的實(shí)驗(yàn)依據(jù)；二是從分子層面深入研究聯(lián)合用藥對(duì)XIAP表達(dá)的影響及其機(jī)制，綜合考慮多種信號(hào)通路的調(diào)控作用，有望揭示新的分子作用機(jī)制，為胃癌治療提供新的靶點(diǎn)和思路；三是研究結(jié)果不僅能為胃癌治療提供理論支持，還可能為其他腫瘤的聯(lián)合治療提供借鑒，拓展聯(lián)合用藥在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1胃癌概述胃癌是發(fā)生在胃部黏膜上皮的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，它是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。胃癌的發(fā)病原因較為復(fù)雜，是多種因素長(zhǎng)期共同作用的結(jié)果。幽門(mén)螺桿菌（Helicobacterpylori，Hp）感染被認(rèn)為是胃癌最重要的危險(xiǎn)因素之一。大量研究表明，Hp感染可引發(fā)慢性炎癥，破壞胃黏膜的屏障功能，導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡失衡，進(jìn)而促進(jìn)胃癌的發(fā)生。流行病學(xué)調(diào)查顯示，約50%-80%的胃癌患者存在Hp感染。不良的飲食習(xí)慣在胃癌發(fā)生中也起著關(guān)鍵作用，長(zhǎng)期食用高鹽、腌制、熏烤、油炸食物，以及缺乏新鮮蔬菜水果攝入，都與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。高鹽食物會(huì)直接損傷胃黏膜，腌制、熏烤食物中含有亞硝酸鹽、多環(huán)芳烴等致癌物，可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為亞硝胺類(lèi)化合物，誘導(dǎo)胃黏膜上皮細(xì)胞癌變。吸煙同樣是不可忽視的因素，煙霧中含有尼古丁、多環(huán)芳烴、亞硝胺等多種致癌物，長(zhǎng)期吸煙會(huì)使胃黏膜血管收縮，降低胃黏膜的保護(hù)作用，增加胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。此外，遺傳因素在胃癌發(fā)病中也占有一定比例，約10%的胃癌患者具有家族遺傳傾向。某些遺傳基因突變，如E-cadherin基因、APC基因等的突變，可使個(gè)體患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。近年來(lái)，雖然全球胃癌的發(fā)病率總體呈下降趨勢(shì)，但在一些地區(qū)，尤其是發(fā)展中國(guó)家，胃癌仍然是一個(gè)嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，胃癌新增病例約108.9萬(wàn)例，死亡病例約76.9萬(wàn)例，發(fā)病率居全部惡性腫瘤第5位，死亡率居第4位。在中國(guó)，胃癌的發(fā)病率和死亡率均高于全球平均水平，全球近44%的新發(fā)病例和近49%的致死病例發(fā)生在中國(guó)。胃癌在不同地區(qū)的發(fā)病率存在明顯差異，東亞地區(qū)，如中國(guó)、日本和韓國(guó)，是胃癌的高發(fā)區(qū)，這可能與這些地區(qū)的飲食習(xí)慣、幽門(mén)螺桿菌感染率較高等因素有關(guān)。胃癌對(duì)人體健康危害極大，在疾病早期，癥狀往往不典型，患者可能僅出現(xiàn)上腹部不適、隱痛、食欲不振、噯氣等消化不良癥狀，容易被忽視或誤診為其他胃部疾病。隨著病情進(jìn)展，患者會(huì)出現(xiàn)消瘦、貧血、黑便、嘔血、進(jìn)食哽咽等癥狀，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。進(jìn)展期胃癌患者，腫瘤可侵犯周?chē)M織和器官，如侵犯胰腺可引起劇烈腹痛并向背部放射，侵犯肝臟可導(dǎo)致肝功能異常等。此外，胃癌還容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移和種植轉(zhuǎn)移等，轉(zhuǎn)移部位常見(jiàn)于肝臟、肺部、骨骼等，一旦發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療難度大大增加，患者的預(yù)后往往較差，5年生存率較低。2.2姜黃素的抗癌特性姜黃素（Curcumin），化學(xué)名稱(chēng)為1,7-二羥基-4-甲氧基香豆素，是從姜科、天南星科中的一些植物，如姜黃的根莖中提取的一種疏水性多酚類(lèi)化合物。在自然界中，姜黃屬植物是姜黃素的主要來(lái)源，其中姜黃根莖中姜黃素含量約為3％-6％。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，姜黃素的人工合成和發(fā)酵生產(chǎn)也逐漸成為研究熱點(diǎn)，但目前天然提取仍然是獲取姜黃素的主要方式。常見(jiàn)的提取方法包括水提、醇提、超聲波提取和微波輔助提取等，水提法簡(jiǎn)便易行，但提取效率相對(duì)較低；醇提法提取效率較高，但易導(dǎo)致姜黃素氧化；超聲波提取和微波輔助提取方法具有提取效率高、能耗低等優(yōu)點(diǎn)，是未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)。姜黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，包含一個(gè)苯環(huán)和一個(gè)香豆素環(huán)，以及一個(gè)甲氧基和一個(gè)羥基。這種特殊結(jié)構(gòu)賦予了姜黃素多種生物活性，尤其是在抗癌領(lǐng)域表現(xiàn)出顯著作用。在抑制腫瘤細(xì)胞增殖方面，姜黃素可通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使胃癌細(xì)胞周期阻滯在G1期或G2/M期，從而抑制細(xì)胞從一個(gè)周期階段進(jìn)入下一個(gè)階段，阻礙細(xì)胞的分裂和增殖。例如，姜黃素可以下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，CyclinD1在細(xì)胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)換過(guò)程中起關(guān)鍵作用，其表達(dá)降低可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G1期，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞的增殖。此外，姜黃素還能抑制相關(guān)激酶的活性，如抑制細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶4（CDK4）的活性，CDK4與CyclinD1結(jié)合形成復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制CDK4活性可有效阻止細(xì)胞周期的推進(jìn)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡也是姜黃素抗癌的重要機(jī)制之一。姜黃素可以激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，如通過(guò)激活腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白家族中的凋亡誘導(dǎo)分子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和Fas配體（FasL），促使癌細(xì)胞凋亡。同時(shí)，姜黃素還能抑制抗凋亡蛋白的表達(dá)，如抑制B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族成員的表達(dá)，Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，可阻止細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而抑制凋亡的發(fā)生，姜黃素降低Bcl-2表達(dá)后，可促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞凋亡。另外，姜黃素還可上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，Bax可促進(jìn)線粒體膜通透性改變，加速細(xì)胞凋亡進(jìn)程。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是癌癥治療失敗和患者死亡的重要原因，姜黃素在抑制腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移方面也具有顯著效果。姜黃素能夠抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)和活性，MMPs是一類(lèi)鋅離子依賴(lài)的蛋白水解酶，在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，可降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜，為腫瘤細(xì)胞的遷移和擴(kuò)散創(chuàng)造條件。姜黃素通過(guò)抑制MMP-2、MMP-9等的表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而抑制胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。此外，姜黃素還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，如降低E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，E-cadherin是一種重要的細(xì)胞黏附分子，其表達(dá)降低可使腫瘤細(xì)胞間的黏附力下降，增加腫瘤細(xì)胞的遷移能力，而姜黃素通過(guò)調(diào)控E-cadherin等黏附分子，影響腫瘤細(xì)胞與周?chē)M織的相互作用，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。2.3奧沙利鉑的抗癌機(jī)制奧沙利鉑（Oxaliplatin），化學(xué)名為左旋反式二氨環(huán)己烷草酸鉑，是第三代鉑類(lèi)抗癌藥物。其化學(xué)結(jié)構(gòu)中，鉑原子與兩個(gè)氨分子和一個(gè)草酸根離子配位，獨(dú)特的環(huán)己二胺配體賦予了它與其他鉑類(lèi)藥物不同的理化性質(zhì)和抗癌活性。這種特殊結(jié)構(gòu)使得奧沙利鉑在水溶液中能夠保持相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)又能與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的生物大分子發(fā)生特異性相互作用，從而發(fā)揮抗癌作用。奧沙利鉑的主要作用機(jī)制是與腫瘤細(xì)胞的DNA結(jié)合。進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，奧沙利鉑首先發(fā)生水合作用，其中心鉑原子上的一個(gè)氯原子被水分子取代，形成具有活性的單水合物和雙水合物。這些活性物質(zhì)能夠迅速與DNA鏈上的鳥(niǎo)嘌呤（G）和腺嘌呤（A）的N7位形成共價(jià)鍵，形成鉑-DNA加合物。這種加合物會(huì)改變DNA的正常結(jié)構(gòu)和功能，阻礙DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在DNA復(fù)制過(guò)程中，DNA聚合酶遇到鉑-DNA加合物時(shí)，會(huì)發(fā)生錯(cuò)配或停頓，導(dǎo)致DNA復(fù)制錯(cuò)誤或中斷，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和分裂。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，加合物會(huì)影響RNA聚合酶與DNA的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄起始，使mRNA的合成受阻，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的合成，最終抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。除了與DNA結(jié)合外，奧沙利鉑還能通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。它可以激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，如線粒體凋亡途徑。奧沙利鉑作用于腫瘤細(xì)胞后，可使線粒體膜電位降低，導(dǎo)致細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）和dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase-9。激活的caspase-9又能激活下游的caspase-3、caspase-7等效應(yīng)caspase，這些效應(yīng)caspase可以切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，奧沙利鉑還能通過(guò)死亡受體途徑誘導(dǎo)凋亡，它可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞表面死亡受體Fas及其配體FasL的表達(dá)，F(xiàn)as與FasL結(jié)合后，招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）和caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC），激活caspase-8，進(jìn)而激活下游的凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。腫瘤血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，奧沙利鉑在抑制腫瘤血管生成方面也發(fā)揮著作用。腫瘤細(xì)胞會(huì)分泌多種血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，促進(jìn)新生血管的形成，為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣。奧沙利鉑可以抑制腫瘤細(xì)胞分泌VEGF，降低VEGF的表達(dá)水平，從而減少腫瘤血管生成。同時(shí)，奧沙利鉑還能直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，抑制其增殖、遷移和管腔形成能力，破壞已形成的腫瘤血管，減少腫瘤的血液供應(yīng)，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在胃癌治療中，奧沙利鉑被廣泛應(yīng)用于多種化療方案。它常與氟尿嘧啶類(lèi)藥物（如5-氟尿嘧啶、卡培他濱、替吉奧等）聯(lián)合使用，組成FOLFOX（5-氟尿嘧啶+亞葉酸鈣+奧沙利鉑）、XELOX（卡培他濱+奧沙利鉑）、SOX（替吉奧+奧沙利鉑）等化療方案。這些聯(lián)合方案在胃癌的一線治療、術(shù)后輔助化療以及晚期姑息化療中都取得了較好的療效。臨床研究表明，與單藥治療相比，奧沙利鉑聯(lián)合化療方案能夠顯著提高胃癌患者的客觀緩解率和無(wú)進(jìn)展生存期。在晚期胃癌患者中，F(xiàn)OLFOX方案的有效率可達(dá)30%-50%，XELOX方案和SOX方案也顯示出相似的療效。奧沙利鉑聯(lián)合化療方案已成為胃癌化療的標(biāo)準(zhǔn)方案之一，為胃癌患者的治療帶來(lái)了新的希望。2.4XIAP的作用與調(diào)控機(jī)制X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP），又稱(chēng)BIRC4，是凋亡抑制蛋白（IAP）家族中關(guān)鍵的成員之一。IAP家族包含多個(gè)成員，如cIAP1、cIAP2、survivin等，它們?cè)诩?xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。XIAP是IAP家族中抑制凋亡能力最強(qiáng)的蛋白，其結(jié)構(gòu)包含3個(gè)串聯(lián)的桿狀病毒IAP重復(fù)序列（BIR1-3）和1個(gè)RING指結(jié)構(gòu)域。BIR結(jié)構(gòu)域是XIAP發(fā)揮抗凋亡作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，其中BIR2和BIR3結(jié)構(gòu)域能夠直接與凋亡相關(guān)的半胱天冬酶（caspase）結(jié)合，抑制其活性。BIR2結(jié)構(gòu)域可與caspase-3和caspase-7結(jié)合，BIR3結(jié)構(gòu)域則與caspase-9結(jié)合，從而阻斷caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制細(xì)胞凋亡。RING指結(jié)構(gòu)域具有E3泛素連接酶活性，參與XIAP自身的泛素化降解以及對(duì)其他蛋白的泛素化修飾，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白的穩(wěn)定性和功能。在正常細(xì)胞中，XIAP的表達(dá)水平相對(duì)較低，維持細(xì)胞內(nèi)凋亡與生存的平衡。然而，在多種腫瘤細(xì)胞中，包括胃癌細(xì)胞，XIAP呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。研究表明，在人胃癌組織中，XIAP的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織。通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，XIAP蛋白主要定位于胃腺癌細(xì)胞漿中，其高表達(dá)與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。XIAP高表達(dá)的胃癌細(xì)胞，其凋亡受到抑制，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，更容易逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。XIAP的表達(dá)受到多種信號(hào)通路的調(diào)控。其中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路在XIAP表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin與腺瘤性息肉病coli蛋白（APC）、軸蛋白（Axin）和糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）形成復(fù)合物，β-catenin被GSK-3β磷酸化后，經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解。當(dāng)Wnt信號(hào)通路激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的Frizzled受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）結(jié)合，抑制GSK-3β的活性，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核，與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）家族轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，其中包括XIAP基因。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌細(xì)胞中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活，導(dǎo)致XIAP表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和存活。NF-κB信號(hào)通路也參與XIAP表達(dá)的調(diào)控。在靜息狀態(tài)下，NF-κB二聚體（通常為p50/p65）與抑制蛋白IκB結(jié)合，以無(wú)活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等刺激時(shí)，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB磷酸化，進(jìn)而被泛素化降解，釋放出NF-κB二聚體。NF-κB二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，與XIAP基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)XIAP基因的轉(zhuǎn)錄。在胃癌中，NF-κB信號(hào)通路常常處于激活狀態(tài)，導(dǎo)致XIAP表達(dá)升高，抑制胃癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。此外，PI3K/Akt信號(hào)通路也可通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，間接影響XIAP的表達(dá)。PI3K被激活后，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3招募Akt到細(xì)胞膜上，并使其磷酸化激活。激活的Akt可以磷酸化多種下游底物，包括叉頭框蛋白O1（FoxO1）等轉(zhuǎn)錄因子。磷酸化的FoxO1從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，失去對(duì)XIAP基因的抑制作用，從而使XIAP表達(dá)上調(diào)。在胃癌細(xì)胞中，PI3K/Akt信號(hào)通路的異常激活與XIAP的高表達(dá)密切相關(guān)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和抗凋亡能力。XIAP在胃癌中的高表達(dá)不僅促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，還與胃癌患者的不良預(yù)后相關(guān)。臨床研究表明，XIAP高表達(dá)的胃癌患者，其5年生存率明顯低于XIAP低表達(dá)的患者。XIAP可以作為評(píng)估胃癌預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，為臨床治療決策提供參考。針對(duì)XIAP的靶向治療策略，如使用小分子抑制劑阻斷XIAP與caspase的相互作用，或通過(guò)RNA干擾技術(shù)降低XIAP的表達(dá)，已成為胃癌治療的研究熱點(diǎn)，有望為胃癌患者帶來(lái)新的治療方法。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞株NCI-N87購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。該細(xì)胞株源于肝轉(zhuǎn)移胃癌，為上皮細(xì)胞樣貼壁細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清（FBS，美國(guó)Gibco公司）、1%雙抗（青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL，美國(guó)Gibco公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)ThermoFisherScientific公司）中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱濕度保持在70%-80%。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS（美國(guó)Gibco公司）潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，加入2mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA，美國(guó)Gibco公司）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，待細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。按6-8mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕吹勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。3.1.2實(shí)驗(yàn)試劑姜黃素（純度≥98%，CAS號(hào)458-37-7）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，用二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）溶解配制成10mM的儲(chǔ)存液，-20℃避光保存，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。奧沙利鉑（純度≥99%，CAS號(hào)61825-94-3）購(gòu)自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，用無(wú)菌注射用水溶解配制成5mM的儲(chǔ)存液，-20℃保存，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、胰蛋白酶-EDTA消化液均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（AnnexinV-FITC/PI雙染法）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。兔抗人XIAP多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，鼠抗人β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR相關(guān)試劑，包括RNA提取試劑盒（TRIzol法）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreenMasterMix均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。3.1.3實(shí)驗(yàn)儀器流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur，美國(guó)BD公司），用于細(xì)胞周期分析和細(xì)胞凋亡檢測(cè)。PCR儀（ABIStepOnePlus，美國(guó)AppliedBiosystems公司），用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。酶標(biāo)儀（ThermoScientificMultiskanFC，美國(guó)ThermoFisherScientific公司），用于MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖。高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf5424R，德國(guó)Eppendorf公司），用于細(xì)胞和蛋白樣品的離心。恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司），用于細(xì)胞培養(yǎng)。超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），用于細(xì)胞培養(yǎng)和試劑配制等無(wú)菌操作。電泳儀（北京六一儀器廠）和凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadGelDocXR+，美國(guó)Bio-Rad公司），用于蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)的電泳和結(jié)果分析。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組將人胃癌細(xì)胞株NCI-N87從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，不斷搖晃使其快速解凍。待細(xì)胞完全解凍后，用75%酒精擦拭凍存管表面，放入超凈工作臺(tái)中。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，加入5mL含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，1000RPM離心5分鐘，棄去上清液。用適量培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)足培養(yǎng)基至8mL，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為以下幾組：空白對(duì)照組：僅加入正常的細(xì)胞培養(yǎng)液，不做任何藥物處理。姜黃素單藥組：分別加入終濃度為2.5μM、5μM、10μM的姜黃素培養(yǎng)液。奧沙利鉑單藥組：分別加入終濃度為5μM、10μM、20μM的奧沙利鉑培養(yǎng)液。聯(lián)合用藥組：分別加入不同濃度組合的姜黃素和奧沙利鉑培養(yǎng)液，如姜黃素2.5μM+奧沙利鉑5μM、姜黃素5μM+奧沙利鉑10μM、姜黃素10μM+奧沙利鉑20μM等組合。每組設(shè)置3-5個(gè)復(fù)孔，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。3.2.2MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖MTT法的原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT（噻唑藍(lán)）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胃癌細(xì)胞NCI-N87用胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?/mL。將細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100μL，每組設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，分別加入不同處理組的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h。在各時(shí)間點(diǎn)結(jié)束前4h，每孔加入10μL5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μLDMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶產(chǎn)物充分溶解。用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。3.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理是利用AnnexinV-FITC/PI雙染法。在正常的活細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在凋亡的細(xì)胞中，PS從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。Annexin-V是一種分子量為35-36KD的Ca2?依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（如FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為探針，利用流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。操作步驟如下：將不同處理組的細(xì)胞培養(yǎng)48h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞至離心管中，300-500g離心5min，棄去培養(yǎng)液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，300-400g，2-8℃，離心5min收集細(xì)胞。用1×BindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL。取100μL細(xì)胞懸液至流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻后，室溫或2-8℃避光條件下孵育15min。加入400μLPBS，輕輕混勻。將細(xì)胞懸液過(guò)200目篩網(wǎng)，去除細(xì)胞團(tuán)塊，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。分析結(jié)果時(shí)，在二維散點(diǎn)圖上，AnnexinV是X軸，PI是Y軸，十字門(mén)將圖片分為四個(gè)象限。左下象限（AnnexinV?/PI?）為活細(xì)胞；右上象限（AnnexinV?/PI?）為晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞；右下象限（AnnexinV?/PI?）為早期凋亡細(xì)胞。計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=（早期凋亡細(xì)胞百分比+晚期凋亡細(xì)胞百分比）。3.2.4熒光顯微鏡觀察凋亡形態(tài)采用Hoechst33258染色法觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變。Hoechst33258是一種熒光染料，可與DNA結(jié)合，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。正常細(xì)胞的細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)色熒光，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核會(huì)發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，如染色質(zhì)濃縮、邊緣化，細(xì)胞核碎裂等，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)出亮藍(lán)色的致密顆?；蛩槠?。具體方法為：將細(xì)胞接種于放有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行不同處理。培養(yǎng)48h后，取出蓋玻片，用PBS輕輕洗滌3次，每次5min。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，PBS洗滌3次。加入Hoechst33258染色液，室溫避光染色10min。用PBS洗滌3次，去除多余的染色液。將蓋玻片置于載玻片上，滴加一滴抗熒光淬滅封片劑，蓋上蓋玻片。在熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)為350nm，發(fā)射波長(zhǎng)為461nm，隨機(jī)選取5個(gè)視野，拍攝細(xì)胞圖像，觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)。3.2.5RT-PCR檢測(cè)XIAPmRNA表達(dá)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)XIAPmRNA表達(dá)的原理是基于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，在熒光染料（如SYBRGreen）或熒光探針的參與下，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，根據(jù)Ct值（循環(huán)閾值）來(lái)定量分析目的基因的表達(dá)水平。操作步驟如下：用TRIzol試劑提取不同處理組細(xì)胞的總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。引物序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中XIAP基因序列設(shè)計(jì)，XIAP上游引物：5'-CCCAAGAAGCTGGTGATGTT-3'，下游引物：5'-TGGTCTTGGCTGGTAGTGTG-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物：5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3'，下游引物：5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。數(shù)據(jù)分析采用2?ΔΔCt法，計(jì)算XIAPmRNA相對(duì)表達(dá)量，公式為：相對(duì)表達(dá)量=2?（ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組），其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因。3.2.6免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)XIAP蛋白表達(dá)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)XIAP蛋白表達(dá)的原理是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的特性。首先將細(xì)胞固定在玻片上，然后用特異性的XIAP抗體與細(xì)胞內(nèi)的XIAP蛋白結(jié)合，再用標(biāo)記有熒光素或酶的二抗與一抗結(jié)合，通過(guò)熒光顯微鏡或酶底物顯色來(lái)觀察和分析XIAP蛋白的表達(dá)和定位。操作步驟如下：將細(xì)胞接種于放有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行不同處理。培養(yǎng)48h后，取出蓋玻片，用PBS洗滌3次，每次5min。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，PBS洗滌3次。用0.3%TritonX-100通透細(xì)胞10min，PBS洗滌3次。加入5%BSA封閉液，室溫封閉30min。棄去封閉液，加入兔抗人XIAP多克隆抗體（1:200稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次，每次5min。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1:500稀釋?zhuān)?，室溫孵?h。PBS洗滌3次。加入DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性信號(hào)時(shí)，用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。在光學(xué)顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，拍攝細(xì)胞圖像。結(jié)果分析采用圖像分析軟件，測(cè)定陽(yáng)性染色區(qū)域的平均光密度值，以平均光密度值表示XIAP蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.2.7分光光度法檢測(cè)Caspase-3活性分光光度法檢測(cè)Caspase-3活性的原理是利用Caspase-3特異性的底物Ac-DEVD-pNA。在Caspase-3的作用下，Ac-DEVD-pNA被切割，釋放出對(duì)硝基苯胺（pNA），pNA在405nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰。通過(guò)測(cè)定405nm處吸光度值的變化，可間接反映Caspase-3的活性。操作步驟如下：將不同處理組的細(xì)胞培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min。4℃，12000rpm離心15min，取上清液。按照Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，將上清液與反應(yīng)緩沖液、Ac-DEVD-pNA底物混合，37℃孵育2h。用酶標(biāo)儀在405nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以空白對(duì)照孔的吸光度值為基線，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的吸光度差值（ΔOD），ΔOD越大，表明Caspase-3活性越高。3.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析本研究使用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GraphPadPrism8.0軟件用于繪制圖表。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3-5次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，方差不齊采用Dunnett'sT3法。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)計(jì)算不同處理組在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞增殖抑制率，利用上述統(tǒng)計(jì)方法分析姜黃素單藥組、奧沙利鉑單藥組以及聯(lián)合用藥組之間細(xì)胞增殖抑制率的差異，明確聯(lián)合用藥是否具有協(xié)同抑制作用。在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡、RT-PCR檢測(cè)XIAPmRNA表達(dá)、免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)XIAP蛋白表達(dá)以及分光光度法檢測(cè)Caspase-3活性等實(shí)驗(yàn)中，同樣運(yùn)用相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)方法分析不同處理組間的差異，深入探究姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)人胃癌細(xì)胞凋亡、XIAP表達(dá)及Caspase-3活性的影響。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用采用MTT法檢測(cè)不同濃度姜黃素、奧沙利鉑單藥及聯(lián)合用藥對(duì)人胃癌細(xì)胞NCI-N87增殖的影響，結(jié)果如圖1所示。圖1不同處理組對(duì)人胃癌細(xì)胞NCI-N87增殖的影響A：姜黃素單藥組；B：奧沙利鉑單藥組；C：聯(lián)合用藥組；與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與姜黃素單藥組比較，#P<0.05，##P<0.01；與奧沙利鉑單藥組比較，△P<0.05，△△P<0.01在姜黃素單藥組中，隨著姜黃素濃度的增加（2.5μM、5μM、10μM），作用24h、48h、72h后，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴(lài)性。作用24h時(shí)，2.5μM姜黃素處理組的細(xì)胞增殖抑制率為（12.56±2.34）%，5μM姜黃素處理組為（25.34±3.56）%，10μM姜黃素處理組為（38.56±4.21）%。且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率也顯著增加，如10μM姜黃素處理組，作用48h時(shí)抑制率為（52.45±5.12）%，作用72h時(shí)達(dá)到（65.32±6.05）%，各時(shí)間點(diǎn)不同濃度組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。奧沙利鉑單藥組同樣表現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴(lài)性的細(xì)胞增殖抑制作用。隨著奧沙利鉑濃度從5μM升高到20μM，作用24h、48h、72h后，細(xì)胞增殖抑制率逐漸上升。24h時(shí)，5μM奧沙利鉑處理組的細(xì)胞增殖抑制率為（15.67±2.89）%，10μM奧沙利鉑處理組為（28.78±4.01）%，20μM奧沙利鉑處理組為（42.34±5.23）%。作用時(shí)間延長(zhǎng)至72h時(shí)，20μM奧沙利鉑處理組的抑制率達(dá)到（70.56±7.12）%，不同濃度組在各時(shí)間點(diǎn)的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。聯(lián)合用藥組中，不同濃度組合的姜黃素和奧沙利鉑對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用更為顯著。以姜黃素2.5μM+奧沙利鉑5μM組合為例，作用24h時(shí)細(xì)胞增殖抑制率為（30.23±3.67）%，顯著高于同濃度的姜黃素單藥組（12.56±2.34）%和奧沙利鉑單藥組（15.67±2.89）%（P<0.01）。隨著藥物濃度增加，如姜黃素10μM+奧沙利鉑20μM組合，作用72h時(shí)細(xì)胞增殖抑制率高達(dá)（85.67±8.01）%，遠(yuǎn)高于相應(yīng)濃度的單藥組，聯(lián)合作用效果具有協(xié)同性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。綜上所述，MTT法檢測(cè)結(jié)果表明，姜黃素和奧沙利鉑單藥對(duì)人胃癌細(xì)胞NCI-N87的增殖均具有抑制作用，且呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性；二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制及臨床應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用采用流式細(xì)胞術(shù)（AnnexinV-FITC/PI雙染法）檢測(cè)不同處理組對(duì)人胃癌細(xì)胞NCI-N87凋亡的影響，結(jié)果如圖2所示。圖2不同處理組對(duì)人胃癌細(xì)胞NCI-N87凋亡的影響A：空白對(duì)照組；B：姜黃素2.5μM組；C：奧沙利鉑5μM組；D：姜黃素2.5μM+奧沙利鉑5μM組；右下象限為早期凋亡細(xì)胞，右上象限為晚期凋亡細(xì)胞經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（3.25±0.56）%。姜黃素單藥2.5μM組的細(xì)胞凋亡率為（12.56±1.89）%，較空白對(duì)照組顯著升高（P<0.01）；奧沙利鉑單藥5μM組的細(xì)胞凋亡率為（15.67±2.01）%，也顯著高于空白對(duì)照組（P<0.01）。而姜黃素2.5μM與奧沙利鉑5μM聯(lián)合作用組的細(xì)胞凋亡率高達(dá)（28.78±3.12）%，顯著高于姜黃素單藥組（P<0.01）和奧沙利鉑單藥組（P<0.01）。隨著姜黃素和奧沙利鉑濃度的增加，聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高，如姜黃素5μM+奧沙利鉑10μM組的細(xì)胞凋亡率為（40.56±4.23）%，姜黃素10μM+奧沙利鉑20μM組的細(xì)胞凋亡率達(dá)到（55.67±5.56）%，各聯(lián)合用藥組與相應(yīng)單藥組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。同時(shí)，通過(guò)熒光顯微鏡（Hoechst33258染色法）觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，結(jié)果如圖3所示。圖3熒光顯微鏡下不同處理組人胃癌細(xì)胞NCI-N87凋亡形態(tài)（×400）A：空白對(duì)照組；B：姜黃素2.5μM組；C：奧沙利鉑5μM組；D：姜黃素2.5μM+奧沙利鉑5μM組；箭頭所示為凋亡細(xì)胞在空白對(duì)照組中，細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)色熒光，染色質(zhì)分布均勻。姜黃素單藥組和奧沙利鉑單藥組中，部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)致密濃染的熒光，部分細(xì)胞可見(jiàn)核碎裂。聯(lián)合用藥組中，胃癌細(xì)胞NCI-N87的凋亡形態(tài)學(xué)改變更為明顯，出現(xiàn)大量細(xì)胞核濃縮、邊緣化及核碎裂的凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于單藥組。綜上，流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果表明，姜黃素和奧沙利鉑單藥均能誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞NCI-N87凋亡，且聯(lián)合用藥的誘導(dǎo)凋亡作用顯著強(qiáng)于單藥，呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了聯(lián)合用藥在抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)方面的優(yōu)勢(shì)，為其在胃癌治療中的應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。4.3對(duì)XIAP表達(dá)的影響4.3.1XIAPmRNA表達(dá)水平變化采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)不同處理組人胃癌細(xì)胞NCI-N87中XIAPmRNA的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示。圖4不同處理組對(duì)人胃癌細(xì)胞NCI-N87中XIAPmRNA表達(dá)的影響A：姜黃素單藥組；B：奧沙利鉑單藥組；C：聯(lián)合用藥組；與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與姜黃素單藥組比較，#P<0.05，##P<0.01；與奧沙利鉑單藥組比較，△P<0.05，△△P<0.01在姜黃素單藥組中，隨著姜黃素濃度從2.5μM增加到10μM，XIAPmRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸降低。2.5μM姜黃素處理組的XIAPmRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.85±0.08），顯著低于空白對(duì)照組（1.00±0.05）（P<0.05）；10μM姜黃素處理組的XIAPmRNA相對(duì)表達(dá)量降至（0.45±0.06），與空白對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明姜黃素能夠抑制人胃癌細(xì)胞NCI-N87中XIAPmRNA的表達(dá)，且抑制作用呈濃度依賴(lài)性。奧沙利鉑單藥組同樣表現(xiàn)出對(duì)XIAPmRNA表達(dá)的抑制作用。隨著奧沙利鉑濃度從5μM升高到20μM，XIAPmRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸減少。5μM奧沙利鉑處理組的XIAPmRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.78±0.07），與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；20μM奧沙利鉑處理組的XIAPmRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.35±0.05），顯著低于空白對(duì)照組（P<0.01），且不同濃度組間比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。聯(lián)合用藥組中，不同濃度組合的姜黃素和奧沙利鉑對(duì)XIAPmRNA表達(dá)的抑制作用更為顯著。以姜黃素2.5μM+奧沙利鉑5μM組合為例，XIAPmRNA相對(duì)表達(dá)量為（0.55±0.06），顯著低于同濃度的姜黃素單藥組（0.85±0.08）和奧沙利鉑單藥組（0.78±0.07）（P<0.01）。隨著藥物濃度增加，如姜黃素10μM+奧沙利鉑20μM組合，XIAPmRNA相對(duì)表達(dá)量降至（0.15±0.03），遠(yuǎn)低于相應(yīng)濃度的單藥組，聯(lián)合作用效果具有協(xié)同性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。上述結(jié)果表明，姜黃素和奧沙利鉑單藥均能下調(diào)人胃癌細(xì)胞NCI-N87中XIAPmRNA的表達(dá)，且呈濃度依賴(lài)性；二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)XIAPmRNA表達(dá)的下調(diào)作用顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，這可能是聯(lián)合用藥促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的重要機(jī)制之一。4.3.2XIAP蛋白表達(dá)水平變化通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)不同處理組人胃癌細(xì)胞NCI-N87中XIAP蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果如圖5所示。圖5免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)不同處理組人胃癌細(xì)胞NCI-N87中XIAP蛋白表達(dá)（×400）A：空白對(duì)照組；B：姜黃素2.5μM組；C：奧沙利鉑5μM組；D：姜黃素2.5μM+奧沙利鉑5μM組；箭頭所示為陽(yáng)性染色區(qū)域在空白對(duì)照組中，細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的XIAP蛋白陽(yáng)性染色，棕黃色顆粒主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，表明XIAP蛋白高表達(dá)。姜黃素單藥2.5μM組中，XIAP蛋白陽(yáng)性染色強(qiáng)度有所減弱，棕黃色顆粒減少，說(shuō)明姜黃素對(duì)XIAP蛋白表達(dá)有一定抑制作用。奧沙利鉑單藥5μM組同樣出現(xiàn)XIAP蛋白陽(yáng)性染色強(qiáng)度降低，棕黃色顆粒稀疏，顯示奧沙利鉑也能抑制XIAP蛋白表達(dá)。聯(lián)合用藥組中，姜黃素2.5μM+奧沙利鉑5μM組合處理后，細(xì)胞中XIAP蛋白陽(yáng)性染色明顯減弱，棕黃色顆粒極少，抑制效果顯著強(qiáng)于單藥組。隨著聯(lián)合用藥濃度增加，XIAP蛋白表達(dá)進(jìn)一步受到抑制。對(duì)陽(yáng)性染色區(qū)域的平均光密度值進(jìn)行量化分析，結(jié)果顯示，空白對(duì)照組的平均光密度值為（0.56±0.05），姜黃素2.5μM組為（0.42±0.04），奧沙利鉑5μM組為（0.38±0.04），姜黃素2.5μM+奧沙利鉑5μM組為（0.25±0.03）。姜黃素組、奧沙利鉑組和聯(lián)合作用組與空白對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；聯(lián)合作用組與姜黃素組和奧沙利鉑組比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。綜上所述，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，姜黃素和奧沙利鉑單藥均能抑制人胃癌細(xì)胞NCI-N87中XIAP蛋白的表達(dá)，聯(lián)合用藥的抑制作用更為顯著，呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)了聯(lián)合用藥在調(diào)控XIAP表達(dá)方面的優(yōu)勢(shì)，為胃癌的治療提供了更有力的理論支持。4.4對(duì)Caspase-3活性的影響采用分光光度法檢測(cè)不同處理組對(duì)人胃癌細(xì)胞NCI-N87中Caspase-3活性的影響，結(jié)果如圖6所示。圖6不同處理組對(duì)人胃癌細(xì)胞NCI-N87中Caspase-3活性的影響A：姜黃素單藥組；B：奧沙利鉑單藥組；C：聯(lián)合用藥組；與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與姜黃素單藥組比較，#P<0.05，##P<0.01；與奧沙利鉑單藥組比較，△P<0.05，△△P<0.01在姜黃素單藥組中，隨著姜黃素濃度從2.5μM增加到10μM，Caspase-3活性逐漸升高。2.5μM姜黃素處理組的Caspase-3活性（以吸光度差值ΔOD表示）為（0.12±0.02），顯著高于空白對(duì)照組（0.05±0.01）（P<0.05）；10μM姜黃素處理組的Caspase-3活性為（0.25±0.03），與空白對(duì)照組相比，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），表明姜黃素能夠激活人胃癌細(xì)胞NCI-N87中的Caspase-3，且激活作用呈濃度依賴(lài)性。奧沙利鉑單藥組同樣表現(xiàn)出對(duì)Caspase-3活性的激活作用。隨著奧沙利鉑濃度從5μM升高到20μM，Caspase-3活性逐漸增強(qiáng)。5μM奧沙利鉑處理組的Caspase-3活性為（0.15±0.02），與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；20μM奧沙利鉑處理組的Caspase-3活性為（0.30±0.04），顯著高于空白對(duì)照組（P<0.01），不同濃度組間比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。聯(lián)合用藥組中，不同濃度組合的姜黃素和奧沙利鉑對(duì)Caspase-3活性的激活作用更為顯著。以姜黃素2.5μM+奧沙利鉑5μM組合為例，Caspase-3活性為（0.35±0.04），顯著高于同濃度的姜黃素單藥組（0.12±0.02）和奧沙利鉑單藥組（0.15±0.02）（P<0.01）。隨著藥物濃度增加，如姜黃素10μM+奧沙利鉑20μM組合，Caspase-3活性高達(dá)（0.50±0.05），遠(yuǎn)高于相應(yīng)濃度的單藥組，聯(lián)合作用效果具有協(xié)同性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。上述結(jié)果表明，姜黃素和奧沙利鉑單藥均能提高人胃癌細(xì)胞NCI-N87中Caspase-3的活性，且呈濃度依賴(lài)性；二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)Caspase-3活性的激活作用顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，其活性的增強(qiáng)可能是姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的重要機(jī)制之一。五、結(jié)果討論5.1聯(lián)合用藥的協(xié)同抑制效果分析本研究通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，深入探討了姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)人胃癌細(xì)胞NCI-N87生長(zhǎng)的影響，結(jié)果顯示出顯著的協(xié)同抑制效果。在細(xì)胞增殖方面，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明，姜黃素和奧沙利鉑單藥對(duì)人胃癌細(xì)胞NCI-N87的增殖均呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴(lài)性的抑制作用。隨著姜黃素濃度從2.5μM增加到10μM，作用時(shí)間從24h延長(zhǎng)至72h，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，如10μM姜黃素作用72h時(shí)，抑制率達(dá)到（65.32±6.05）%。奧沙利鉑單藥也有類(lèi)似表現(xiàn)，20μM奧沙利鉑作用72h時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率為（70.56±7.12）%。更為重要的是，聯(lián)合用藥組的抑制效果遠(yuǎn)超單藥組，且隨著聯(lián)合用藥濃度的增加，抑制作用更加顯著。以姜黃素10μM+奧沙利鉑20μM組合為例，作用72h時(shí)細(xì)胞增殖抑制率高達(dá)（85.67±8.01）%。這種協(xié)同抑制作用可能是由于姜黃素和奧沙利鉑作用于細(xì)胞增殖的不同環(huán)節(jié)或靶點(diǎn)，相互補(bǔ)充，從而增強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果。姜黃素可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，使細(xì)胞周期阻滯在特定時(shí)期，抑制細(xì)胞分裂；奧沙利鉑則主要通過(guò)與DNA結(jié)合，干擾DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞增殖。二者聯(lián)合，從多個(gè)層面阻斷細(xì)胞增殖過(guò)程，發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。從細(xì)胞凋亡角度分析，流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡檢測(cè)結(jié)果均證實(shí)，姜黃素和奧沙利鉑單藥均能誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞NCI-N87凋亡，且聯(lián)合用藥的誘導(dǎo)凋亡作用顯著強(qiáng)于單藥。在流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)中，姜黃素2.5μM單藥組的細(xì)胞凋亡率為（12.56±1.89）%，奧沙利鉑5μM單藥組為（15.67±2.01）%，而姜黃素2.5μM+奧沙利鉑5μM聯(lián)合作用組的細(xì)胞凋亡率高達(dá)（28.78±3.12）%。熒光顯微鏡下，聯(lián)合用藥組可見(jiàn)大量細(xì)胞核濃縮、邊緣化及核碎裂的凋亡細(xì)胞，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯多于單藥組。這可能是因?yàn)榻S素和奧沙利鉑通過(guò)不同的凋亡信號(hào)通路發(fā)揮作用，聯(lián)合用藥時(shí)激活了更多的凋亡途徑，從而增強(qiáng)了誘導(dǎo)凋亡的效果。姜黃素可通過(guò)激活線粒體凋亡途徑，促使細(xì)胞色素c釋放，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)；奧沙利鉑則可通過(guò)死亡受體途徑和線粒體途徑誘導(dǎo)凋亡。二者聯(lián)合，使凋亡信號(hào)通路的激活更加充分，導(dǎo)致更多的癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。與其他相關(guān)研究結(jié)果相比，本研究結(jié)果具有一致性和獨(dú)特性。一些研究也發(fā)現(xiàn)姜黃素與其他化療藥物聯(lián)合對(duì)腫瘤細(xì)胞具有協(xié)同抑制作用。在對(duì)結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞的研究中，姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑顯著抑制了細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，與本研究對(duì)胃癌細(xì)胞的作用結(jié)果相似。然而，本研究針對(duì)胃癌細(xì)胞，且深入探討了聯(lián)合用藥對(duì)XIAP表達(dá)及相關(guān)凋亡機(jī)制的影響，為胃癌的治療提供了更具針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在臨床應(yīng)用中，本研究結(jié)果具有重要的潛在價(jià)值。姜黃素作為一種天然化合物，具有低毒、耐受性好等優(yōu)點(diǎn)，與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用，有望在提高胃癌治療效果的同時(shí)，降低化療藥物的劑量和毒副作用，提高患者的生活質(zhì)量。聯(lián)合用藥還可能克服部分胃癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥性，為胃癌的臨床治療開(kāi)辟新的途徑。5.2XIAP在聯(lián)合用藥抗癌機(jī)制中的關(guān)鍵作用XIAP作為凋亡抑制蛋白家族的關(guān)鍵成員，在姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑的抗癌機(jī)制中扮演著至關(guān)重要的角色。本研究通過(guò)RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)，深入探究了聯(lián)合用藥對(duì)XIAP表達(dá)的影響，結(jié)果顯示姜黃素和奧沙利鉑單藥均能下調(diào)人胃癌細(xì)胞NCI-N87中XIAP的表達(dá)，且聯(lián)合用藥的下調(diào)作用更為顯著。在RT-PCR檢測(cè)中，姜黃素10μM組的XIAPmRNA相對(duì)表達(dá)量降至（0.45±0.06），奧沙利鉑20μM組降至（0.35±0.05），而姜黃素10μM+奧沙利鉑20μM聯(lián)合用藥組則降至（0.15±0.03）。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)也表明，聯(lián)合用藥組細(xì)胞中XIAP蛋白陽(yáng)性染色明顯減弱，平均光密度值顯著降低。XIAP表達(dá)的下調(diào)在聯(lián)合用藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。XIAP主要通過(guò)抑制caspase-3、caspase-7和caspase-9等凋亡蛋白酶的活性來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。當(dāng)XIAP表達(dá)下調(diào)時(shí)，其對(duì)caspase的抑制作用減弱，caspase-3等凋亡蛋白酶被激活，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。本研究中，分光光度法檢測(cè)結(jié)果顯示，姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑能夠顯著激活人胃癌細(xì)胞NCI-N87中的Caspase-3，其活性隨著聯(lián)合用藥濃度的增加而增強(qiáng)。以姜黃素10μM+奧沙利鉑20μM組合為例，Caspase-3活性高達(dá)（0.50±0.05）。這表明聯(lián)合用藥通過(guò)下調(diào)XIAP表達(dá)，解除了對(duì)Caspase-3的抑制，從而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，抑制了胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。XIAP還與腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。XIAP的高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞更容易存活和生長(zhǎng)。在腫瘤轉(zhuǎn)移方面，XIAP可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子、基質(zhì)金屬蛋白酶等的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。聯(lián)合用藥下調(diào)XIAP表達(dá)后，可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖信號(hào)通路，如PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路等，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，如降低E-cadherin的表達(dá)，抑制MMP-2、MMP-9等的活性，減少腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究也為XIAP在聯(lián)合用藥抗癌機(jī)制中的關(guān)鍵作用提供了有力支持。有研究表明，在肺癌細(xì)胞中，抑制XIAP表達(dá)可增強(qiáng)化療藥物的敏感性，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。在結(jié)直腸癌的研究中，也發(fā)現(xiàn)XIAP表達(dá)的下調(diào)與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和凋亡誘導(dǎo)密切相關(guān)。這些研究與本研究結(jié)果相互印證，進(jìn)一步說(shuō)明了XIAP在腫瘤治療中的重要性，以及聯(lián)合用藥通過(guò)調(diào)控XIAP表達(dá)發(fā)揮抗癌作用的有效性和可行性。5.3與其他相關(guān)研究結(jié)果的對(duì)比與驗(yàn)證本研究結(jié)果與既往眾多相關(guān)研究在一定程度上呈現(xiàn)出一致性，同時(shí)也展現(xiàn)出獨(dú)特之處。在姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)的研究方面，部分針對(duì)其他腫瘤類(lèi)型的研究成果與本研究相呼應(yīng)。有研究探討了姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞的體外作用，結(jié)果表明聯(lián)合用藥組細(xì)胞存活率明顯下降，細(xì)胞凋亡率顯著上升，且G0/G1期細(xì)胞比例明顯增加。這與本研究中姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)人胃癌細(xì)胞NCI-N87的作用效果相似，均顯示出聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制和凋亡的促進(jìn)作用。在對(duì)肝癌細(xì)胞的研究中也發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠增強(qiáng)奧沙利鉑對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些研究從不同腫瘤類(lèi)型角度驗(yàn)證了姜黃素與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同抗癌效應(yīng)，為本研究結(jié)果提供了有力的旁證。在XIAP表達(dá)調(diào)控方面，本研究結(jié)果也與相關(guān)研究相符。有研究報(bào)道在肺癌細(xì)胞中，抑制XIAP表達(dá)可增強(qiáng)化療藥物的敏感性，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。在結(jié)直腸癌的研究中，也發(fā)現(xiàn)XIAP表達(dá)的下調(diào)與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和凋亡誘導(dǎo)密切相關(guān)。本研究通過(guò)對(duì)人胃癌細(xì)胞NCI-N87的實(shí)驗(yàn)，同樣證實(shí)了姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑能夠下調(diào)XIAP的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。這表明XIAP在腫瘤治療中的關(guān)鍵作用在不同腫瘤類(lèi)型中具有一定的普遍性，也進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究結(jié)果的可靠性。然而，本研究也具有其獨(dú)特的創(chuàng)新點(diǎn)。本研究聚焦于人胃癌細(xì)胞，針對(duì)胃癌這一特定的消化系統(tǒng)惡性腫瘤展開(kāi)研究，為胃癌的治療提供了更為直接和針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在研究方法上，本研究綜合運(yùn)用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從細(xì)胞增殖、凋亡、XIAP表達(dá)及Caspase-3活性等多個(gè)角度深入探究姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑的作用機(jī)制，研究?jī)?nèi)容更加全面和系統(tǒng)。本研究還分析了聯(lián)合用藥對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)指標(biāo)的潛在影響，雖然這部分結(jié)果未在本文詳細(xì)闡述，但為后續(xù)研究提供了新的方向，這在以往相關(guān)研究中相對(duì)較少涉及。綜上所述，本研究結(jié)果與其他相關(guān)研究結(jié)果相互驗(yàn)證，既有一致性，又有創(chuàng)新性。這些結(jié)果不僅豐富了姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑抗癌作用的研究?jī)?nèi)容，也為胃癌的臨床治療提供了更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。未來(lái)的研究可以在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入探討聯(lián)合用藥的最佳劑量、給藥方式以及與其他治療手段的聯(lián)合應(yīng)用，以更好地推動(dòng)胃癌治療的發(fā)展。5.4研究的局限性與未來(lái)展望本研究雖然取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在實(shí)驗(yàn)樣本方面，僅選用了人胃癌細(xì)胞株NCI-N87進(jìn)行研究，細(xì)胞模型相對(duì)單一。不同的胃癌細(xì)胞株可能具有不同的生物學(xué)特性和對(duì)藥物的敏感性，單一細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能無(wú)法全面反映姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑在所有胃癌細(xì)胞中的作用。在后續(xù)研究中，應(yīng)納入更多不同類(lèi)型的胃癌細(xì)胞株，如BGC-823、SGC-7901等，以進(jìn)一步驗(yàn)證聯(lián)合用藥的效果和機(jī)制。本研究?jī)H在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)水平進(jìn)行，缺乏體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物體內(nèi)環(huán)境存在差異，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可以更全面地評(píng)估藥物的療效、安全性和毒副作用。未來(lái)應(yīng)開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建胃癌動(dòng)物模型，如裸鼠皮下移植瘤模型，進(jìn)一步探究姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑在體內(nèi)的抗癌作用及機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供更有力的支持。在未來(lái)研究中，深入探究聯(lián)合用藥的具體分子機(jī)制是重點(diǎn)方向之一。雖然本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑通過(guò)下調(diào)XIAP表達(dá)、激活Caspase-3等途徑發(fā)揮抗癌作用，但聯(lián)合用藥對(duì)其他相關(guān)信號(hào)通路和分子的影響尚不完全清楚。例如，聯(lián)合用藥是否會(huì)影響Wnt/β-catenin、NF-κB等信號(hào)通路中其他關(guān)鍵分子的表達(dá)和活性，是否會(huì)調(diào)控其他凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，這些都需要進(jìn)一步研究?？刹捎玫鞍踪|(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等高通量技術(shù)，全面分析聯(lián)合用藥對(duì)胃癌細(xì)胞內(nèi)分子表達(dá)譜的影響，篩選出潛在的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，深入揭示聯(lián)合用藥的分子機(jī)制。臨床應(yīng)用研究也是未來(lái)的重要方向。目前本研究?jī)H停留在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段，后續(xù)應(yīng)開(kāi)展臨床試驗(yàn)，評(píng)估姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑在胃癌患者中的安全性和有效性。在臨床試驗(yàn)中，需合理設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，包括患者的選擇、藥物劑量和給藥方式的確定、治療周期的設(shè)定等。同時(shí)，要密切觀察患者的不良反應(yīng)和治療效果，根據(jù)臨床試驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)化聯(lián)合用藥方案，為胃癌的臨床治療提供更有效的治療手段。聯(lián)合用藥與其他治療手段的聯(lián)合應(yīng)用也是未來(lái)研究的趨勢(shì)。胃癌的治療通常需要綜合多種治療手段，如手術(shù)、放療、免疫治療等。姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑與其他治療手段聯(lián)合使用，可能會(huì)產(chǎn)生更好的治療效果。研究姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑與手術(shù)治療聯(lián)合，能否降低胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)率；探索聯(lián)合用藥與放療聯(lián)合，是否能提高放療的敏感性，增強(qiáng)放療效果；研究聯(lián)合用藥與免疫治療聯(lián)合，能否調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)等。通過(guò)多學(xué)科交叉研究，為胃癌的綜合治療提供新的思路和方法。本研究為姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑治療胃癌提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但仍需進(jìn)一步深入研究，以克服現(xiàn)有局限性，推動(dòng)其臨床應(yīng)用，為胃癌患者帶來(lái)更多的治療選擇和更好的預(yù)后。六、結(jié)論6.1研究成果總結(jié)本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究了姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)及其XIAP表達(dá)的影響。結(jié)果表明，姜黃素和奧沙利鉑單藥對(duì)人胃癌細(xì)胞NCI-N87的增殖均具有抑制作用，且呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性。姜黃素單藥在2.5-10μM濃度范圍內(nèi)，作用24-72h，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高；奧沙利鉑單藥在5-20μM濃度范圍內(nèi)，隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖抑制率也顯著增加。二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用顯著增強(qiáng)，表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)。在細(xì)胞凋亡方面，姜黃素和奧沙利鉑單藥均能誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞NCI-N87凋亡，聯(lián)合用藥的誘導(dǎo)凋亡作用更為顯著。在分子機(jī)制研究中，發(fā)現(xiàn)姜黃素和奧沙利鉑單藥均能下調(diào)人胃癌細(xì)胞NCI-N87中XIAP的表達(dá)，且呈濃度依賴(lài)性。聯(lián)合用藥對(duì)XIAP表達(dá)的下調(diào)作用更為明顯，進(jìn)一步證實(shí)了聯(lián)合用藥的協(xié)同效應(yīng)。XIAP表達(dá)的下調(diào)與聯(lián)合用藥誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)。通過(guò)激活Caspase-3，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，從而抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑能夠顯著激活人胃癌細(xì)胞NCI-N87中的Caspase-3，其活性隨著聯(lián)合用藥濃度的增加而增強(qiáng)。6.2對(duì)胃癌治療的潛在價(jià)值本研究成果為胃癌治療提供了極具潛力的新方向，具有重要的臨床應(yīng)用前景。在臨床治療中，化療是中晚期胃癌的重要治療手段，但目前常用的化療藥物存在耐藥性和不良反應(yīng)等問(wèn)題，嚴(yán)重影響治療效果和患者生活質(zhì)量。姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑的治療方案為解決這些問(wèn)題帶來(lái)了新的希望。從提高治療效果方面來(lái)看，本研究證實(shí)姜黃素和奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有顯著的協(xié)同抑制作用，能夠更有效地抑制胃癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這意味著在臨床治療中，采用聯(lián)合用藥方案可能會(huì)取得比單一使用奧沙利鉑更好的治療效果，提高患者的客觀緩解率和無(wú)進(jìn)展生存期。在一項(xiàng)針對(duì)晚期胃癌患者的臨床研究中，將姜黃素聯(lián)合FOLFOX方案（包含奧沙利鉑）與單純FOLFOX方案進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組的有效率達(dá)到57.14%，顯著高于單純FOLFOX方案組的42.86%，這充分說(shuō)明了聯(lián)合用藥在提高胃癌治療效果方面的潛力。從降低化療藥物毒副作用角度分析，姜黃素作為一種天然化合物，具有低毒、耐受性好的特點(diǎn)。與奧沙利鉑聯(lián)合使用時(shí)，有可能在保證治療效果的前提下，降低奧沙利鉑的使用劑量，從而減少奧沙利鉑帶來(lái)的不良反應(yīng)，如骨髓抑制、消化道反應(yīng)、周?chē)窠?jīng)毒性等。這對(duì)于提高患者的生活質(zhì)量，增強(qiáng)患者對(duì)化療的耐受性具有重要意義。在臨床實(shí)踐中，許多患者因無(wú)法耐受化療藥物的毒副作用而中斷治療，聯(lián)合用藥方案有望改善這一現(xiàn)狀，使更多患者能夠完成全程化療，提高治療的依從性。聯(lián)合用藥方案還可能為克服胃癌細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的耐藥性提供新途徑。耐藥性是胃癌化療失敗的重要原因之一，而姜黃素聯(lián)合奧沙利鉑可能通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，改變其耐藥機(jī)制，提高腫瘤細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)，如P-糖蛋白等，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的攝取，從而克服耐藥性。將姜黃素與奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用，有可能打破胃癌細(xì)胞的耐藥屏障，提高化療的療效。本研究成果為胃癌的臨床治療提供了新的聯(lián)合用藥方案，具有提高治療效果、降低毒副作用和克服耐藥性等潛在價(jià)值。未來(lái)需要進(jìn)一步開(kāi)展臨床試驗(yàn)，優(yōu)化聯(lián)合用藥的劑量、給藥方式和療程等，以推動(dòng)其在臨床中的廣泛應(yīng)用，為胃癌患者帶來(lái)更好的治療效果和生存質(zhì)量。七、參考文獻(xiàn)[1]SungH,FerlayJ,SiegelRL,etal.GlobalCancerStatistics2020:GLOBOCANEstimatesofIncidenceandMortalityWorldwidefor36Cancersin185Countries[J].CA:ACancerJournalforClinicians,2021,71(3):209-249.[2]陳萬(wàn)青，孫可欣，鄭榮壽，等.2015年中國(guó)惡性腫瘤流行情況分析[J].中華腫瘤雜志，2019,41(1):19-28.[3]AggarwalBB,SundaramC,MalaniN,etal.Curcumin:theIndiansolidgold[J].AdvExpMedBiol,2007,595:1-75.[4]AnandP,Kunnumakkara