姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒：抗癌活性與多藥耐藥逆轉(zhuǎn)的深度探索一、引言1.1研究背景與意義癌癥，作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類生命健康的重大疾病，長(zhǎng)期以來(lái)一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全球每年新增癌癥病例持續(xù)攀升，2020年新增病例高達(dá)1930萬(wàn)，死亡人數(shù)達(dá)1000萬(wàn)，預(yù)計(jì)到2040年，新增病例數(shù)將達(dá)到2840萬(wàn)。在中國(guó)，癌癥同樣是居民死亡的主要原因之一，每年新增癌癥患者超過(guò)450萬(wàn)，死亡人數(shù)超過(guò)300萬(wàn)。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在癌癥治療方面取得了顯著進(jìn)展，如手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等多種治療手段不斷涌現(xiàn)，但癌癥的總體治療效果仍不盡如人意，患者的5年生存率仍然較低?；熥鳛榘┌Y治療的重要手段之一，在臨床應(yīng)用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，多藥耐藥（MultidrugResistance，MDR）現(xiàn)象的普遍存在，嚴(yán)重制約了化療的療效，成為癌癥治療失敗的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，超過(guò)90%的化療失敗與多藥耐藥相關(guān)。多藥耐藥是指腫瘤細(xì)胞對(duì)一種化療藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，對(duì)其他結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的化療藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性。這使得原本有效的化療藥物在面對(duì)耐藥腫瘤細(xì)胞時(shí)療效大打折扣，甚至完全失效，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，患者的生存質(zhì)量和生存期受到嚴(yán)重影響。多藥耐藥的發(fā)生機(jī)制極為復(fù)雜，涉及多個(gè)方面。其中，藥物外排泵的過(guò)度表達(dá)是最為重要的機(jī)制之一。以P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）為代表的ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)的化療藥物主動(dòng)排出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。此外，腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物代謝酶活性的改變、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的異常、腫瘤干細(xì)胞的存在以及腫瘤微環(huán)境的影響等，也都在多藥耐藥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。例如，細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的異常會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗，使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避藥物的殺傷作用；腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力，對(duì)化療藥物相對(duì)不敏感，能夠在化療后存活并重新增殖，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。姜黃素（Curcumin）是從姜科姜黃屬植物姜黃的根莖中提取的一種天然多酚類化合物，具有廣泛的生物活性。在抗癌領(lǐng)域，姜黃素展現(xiàn)出了巨大的潛力。研究表明，姜黃素能夠通過(guò)多種機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。例如，姜黃素可以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期或G2/M期，從而抑制其增殖；還能通過(guò)激活caspase家族蛋白酶等途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)，姜黃素還具有抗炎、抗氧化等作用，能夠減輕化療藥物的毒副作用，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力。更為重要的是，姜黃素被發(fā)現(xiàn)具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的能力，能夠通過(guò)抑制P-gp等藥物外排泵的功能，增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，從而恢復(fù)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。然而，姜黃素在實(shí)際應(yīng)用中面臨著諸多挑戰(zhàn)。其水溶性差，在生理環(huán)境中的溶解度極低，這極大地限制了其口服生物利用度；穩(wěn)定性不佳，容易受到光、熱、pH值等因素的影響而降解；體內(nèi)吸收少，在血液循環(huán)中難以維持有效的藥物濃度。這些缺點(diǎn)嚴(yán)重阻礙了姜黃素的臨床應(yīng)用。為了解決這些問(wèn)題，納米技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。納米技術(shù)的快速發(fā)展為改善姜黃素的藥物性能提供了新的思路和方法。納米粒作為一種新型的藥物載體，具有許多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。其粒徑通常在1-1000nm之間，能夠增加藥物的溶解度，提高藥物的生物利用度；具有良好的靶向性，能夠通過(guò)被動(dòng)靶向（如增強(qiáng)的滲透和滯留效應(yīng)，EPR效應(yīng)）或主動(dòng)靶向（如修飾靶向配體）的方式，將藥物特異性地輸送到腫瘤組織，減少藥物在正常組織中的分布，降低藥物的毒副作用；還具有緩釋性能，能夠延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間，維持穩(wěn)定的藥物濃度。聚氰基丙烯酸正丁酯（Polybutylcyanoacrylate，PBCA）納米粒是一種常用的納米藥物載體，具有生物可降解性、生物相容性好、制備工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。將姜黃素負(fù)載于PBCA納米粒中，形成姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒（Curcumin-loadedPolybutylcyanoacrylateNanoparticles，Cur-PBCANPs），有望克服姜黃素自身的缺點(diǎn)，提高其抗癌活性和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的能力。本研究旨在深入探討姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的抗癌活性及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的機(jī)制，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。從理論層面來(lái)看，通過(guò)研究Cur-PBCANPs與腫瘤細(xì)胞的相互作用機(jī)制，能夠進(jìn)一步揭示納米藥物在體內(nèi)的作用方式和規(guī)律，豐富和完善納米藥物學(xué)的理論體系。從實(shí)際應(yīng)用角度出發(fā)，本研究的成果有望為癌癥的臨床治療提供一種新的、有效的治療策略和藥物劑型，提高癌癥患者的治療效果和生存質(zhì)量，具有廣闊的應(yīng)用前景和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。1.2姜黃素與聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒概述姜黃素，化學(xué)名為1,7-雙(4-羥基-3-甲氧基苯基)-1,6-庚二烯-3,5-二酮，是一種天然的多酚類化合物，其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予了它豐富的生物活性。姜黃素呈橙黃色結(jié)晶性粉末狀，不溶于水，微溶于乙醇、甲醇等有機(jī)溶劑。在自然界中，姜黃素主要存在于姜科姜黃屬植物姜黃（CurcumalongaL.）、郁金（CurcumaaromaticaSalisb.）、莪術(shù)（CurcumaphaeocaulisVal.）等的根莖中，其中姜黃根莖中的含量約為2%-5%。作為一種傳統(tǒng)的藥用植物成分，姜黃素在亞洲地區(qū)有著悠久的應(yīng)用歷史，被廣泛用于食品調(diào)味、染色以及民間醫(yī)藥。在藥理作用方面，姜黃素展現(xiàn)出了廣泛而強(qiáng)大的功效。大量研究表明，姜黃素具有顯著的抗炎作用，能夠抑制多種炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，從而減輕炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損傷。在一項(xiàng)針對(duì)小鼠的實(shí)驗(yàn)性炎癥模型研究中，給予姜黃素處理后，小鼠體內(nèi)的炎癥因子水平明顯降低，炎癥癥狀得到顯著緩解。姜黃素還具有出色的抗氧化能力，它可以清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，如超氧陰離子自由基（O???）、羥自由基（?OH）等，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等，進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化防御能力。在抗癌領(lǐng)域，姜黃素的作用機(jī)制更是復(fù)雜多樣且極具潛力。它能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞阻滯在特定的細(xì)胞周期階段，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。例如，姜黃素可以上調(diào)p21、p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)，下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞停滯在G0/G1期或G2/M期，無(wú)法進(jìn)行正常的分裂和增殖。姜黃素還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，通過(guò)激活caspase家族蛋白酶，引發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使腫瘤細(xì)胞死亡。此外，姜黃素還能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，它可以下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等與腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的表達(dá)，減少腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解和破壞，從而抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和擴(kuò)散。在對(duì)乳腺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素處理后，乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯下降，MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平顯著降低。聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒是一種基于聚氰基丙烯酸正丁酯聚合物制備而成的納米級(jí)藥物載體。聚氰基丙烯酸正丁酯是一種生物可降解的高分子材料，其分子結(jié)構(gòu)中含有氰基丙烯酸酯單元，這種結(jié)構(gòu)賦予了它良好的聚合性能和生物相容性。通過(guò)乳液聚合法等制備工藝，可以將聚氰基丙烯酸正丁酯制備成粒徑在1-1000nm之間的納米粒。作為藥物載體，聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒具有諸多顯著優(yōu)勢(shì)。其生物可降解性使得納米粒在體內(nèi)能夠逐漸分解代謝，不會(huì)在體內(nèi)長(zhǎng)期蓄積，減少了對(duì)機(jī)體的潛在毒性。而且，聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的生物相容性良好，能夠與生物體內(nèi)的各種組織和細(xì)胞相互作用而不引起明顯的免疫反應(yīng)和不良反應(yīng)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖沒(méi)有明顯的抑制作用，也不會(huì)引起動(dòng)物機(jī)體的免疫排斥反應(yīng)。該納米粒的制備工藝相對(duì)簡(jiǎn)單，成本較低，易于大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。通過(guò)調(diào)整聚合反應(yīng)的條件，如單體濃度、引發(fā)劑用量、反應(yīng)溫度和時(shí)間等，可以方便地控制納米粒的粒徑、形態(tài)和結(jié)構(gòu)，滿足不同藥物的負(fù)載和遞送需求。將姜黃素與聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒相結(jié)合，形成姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒，具有顯著的創(chuàng)新性和廣闊的應(yīng)用前景。這種結(jié)合方式能夠有效克服姜黃素自身的缺點(diǎn)，如水溶性差、穩(wěn)定性不佳和體內(nèi)吸收少等問(wèn)題。聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒作為載體，可以增加姜黃素的溶解度，提高其在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性，促進(jìn)姜黃素的體內(nèi)吸收和分布，從而增強(qiáng)姜黃素的抗癌活性和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的能力。姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒還可以通過(guò)表面修飾等手段，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤組織的靶向遞送，進(jìn)一步提高藥物的療效，降低藥物的毒副作用。在癌癥治療領(lǐng)域，姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒有望成為一種新型的、高效的抗癌藥物劑型，為癌癥患者帶來(lái)新的治療希望。1.3國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來(lái)，隨著癌癥發(fā)病率的不斷上升以及多藥耐藥問(wèn)題的日益嚴(yán)峻，姜黃素納米粒在抗癌及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥方面的研究受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，取得了一系列重要進(jìn)展。在姜黃素納米粒的制備與表征方面，國(guó)內(nèi)外研究呈現(xiàn)出多樣化的方法和成果。國(guó)外研究中，有學(xué)者采用納米沉淀法成功制備了姜黃素聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米粒，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射（DLS）和透射電子顯微鏡（TEM）表征發(fā)現(xiàn)，該納米粒粒徑均勻，平均粒徑約為150nm，且在體外表現(xiàn)出良好的緩釋性能。國(guó)內(nèi)研究人員則利用乳化溶劑揮發(fā)法制備了姜黃素殼聚糖納米粒，經(jīng)TEM觀察，納米粒呈球形，表面光滑，粒徑分布在100-200nm之間，zeta電位為正值，表明納米粒具有較好的穩(wěn)定性。在姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的制備上，已有研究通過(guò)乳液聚合法，對(duì)制備溫度、藥物濃度、聚合時(shí)間等工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，成功制備出粒徑在200-300nm之間，包封率較高的納米粒，并利用DLS、TEM和紫外-可見(jiàn)吸收光譜（UV-Vis）等手段對(duì)其粒徑、分散性、形態(tài)、藥物載量和藥物釋放率等進(jìn)行了全面表征。關(guān)于姜黃素納米粒的抗癌活性研究，國(guó)內(nèi)外均開(kāi)展了大量的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。國(guó)外有研究表明，姜黃素納米粒對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7具有顯著的抑制作用，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。在小鼠移植瘤模型實(shí)驗(yàn)中，給予姜黃素納米粒治療后，腫瘤體積明顯縮小，生長(zhǎng)受到顯著抑制，且對(duì)小鼠的體重和主要臟器功能無(wú)明顯不良影響。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素納米粒對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用明顯強(qiáng)于游離姜黃素，能夠使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，抑制細(xì)胞的有絲分裂。在對(duì)肺癌細(xì)胞A549的研究中，姜黃素納米粒通過(guò)抑制細(xì)胞內(nèi)的PI3K/Akt信號(hào)通路，降低細(xì)胞的遷移和侵襲能力，從而發(fā)揮抗癌作用。在姜黃素納米粒逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的機(jī)制研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者也進(jìn)行了深入探索。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素納米粒能夠通過(guò)抑制P-gp的功能，增加多藥耐藥細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，從而逆轉(zhuǎn)耐藥性。例如，在對(duì)人結(jié)腸腺癌細(xì)胞多藥耐藥株Caco-2的研究中，姜黃素納米粒處理后，細(xì)胞內(nèi)羅丹明123（一種P-gp底物）的蓄積量顯著增加，表明P-gp的外排功能受到抑制。國(guó)內(nèi)研究則表明，姜黃素納米粒還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物代謝酶活性，如谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）等，減少化療藥物的代謝失活，增強(qiáng)藥物的抗癌效果。在對(duì)白血病多藥耐藥細(xì)胞K562/A02的研究中，發(fā)現(xiàn)姜黃素納米粒能夠下調(diào)GST-π的表達(dá)，提高細(xì)胞內(nèi)化療藥物的濃度，從而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。盡管國(guó)內(nèi)外在姜黃素納米?？拱┗钚约澳孓D(zhuǎn)多藥耐藥方面取得了一定的研究成果，但仍存在一些不足之處和待解決的問(wèn)題。現(xiàn)有研究中，不同制備方法得到的姜黃素納米粒在粒徑、形態(tài)、藥物載量和釋放性能等方面存在較大差異，缺乏統(tǒng)一的制備標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)量控制體系，這給納米粒的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用帶來(lái)了困難。在抗癌活性和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥機(jī)制的研究中，雖然已經(jīng)揭示了一些作用機(jī)制，但仍不夠全面和深入，對(duì)于納米粒與腫瘤細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用過(guò)程，以及納米粒在體內(nèi)的代謝途徑和分布規(guī)律等方面的研究還相對(duì)較少。此外，目前的研究大多集中在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，臨床研究相對(duì)匱乏，納米粒的安全性和有效性在人體中的驗(yàn)證還需要進(jìn)一步開(kāi)展大量的臨床試驗(yàn)。在納米粒的靶向性研究方面，雖然已有一些關(guān)于主動(dòng)靶向姜黃素納米粒的報(bào)道，但靶向效率仍有待提高，如何設(shè)計(jì)和制備具有高效靶向性的姜黃素納米粒，使其能夠更精準(zhǔn)地作用于腫瘤組織，是未來(lái)研究需要解決的重要問(wèn)題之一。二、姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的制備與表征2.1制備方法與工藝優(yōu)化本研究采用陰離子乳化聚合法制備姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒。該方法基于乳液聚合的原理，利用表面活性劑的乳化作用，將單體聚氰基丙烯酸正丁酯分散在水相中形成乳液體系，在引發(fā)劑或其他聚合條件的作用下，單體發(fā)生聚合反應(yīng)，逐漸形成納米級(jí)別的聚合物顆粒，同時(shí)將姜黃素包裹其中。其具體制備過(guò)程如下：首先，稱取適量的姜黃素，用少量有機(jī)溶劑（如無(wú)水乙醇）充分溶解，使其完全分散，形成均勻的姜黃素溶液。將一定量的聚氰基丙烯酸正丁酯單體加入到含有穩(wěn)定劑（如聚乙烯醇、聚山梨酯80等）的水溶液中，在高速攪拌或超聲處理下，使單體均勻分散在水相中，形成穩(wěn)定的乳液。將溶解好的姜黃素溶液緩慢滴加到上述乳液體系中，繼續(xù)攪拌一段時(shí)間，確保姜黃素與乳液充分混合。向乳液體系中加入適量的引發(fā)劑（如過(guò)硫酸鉀、偶氮二異丁腈等），引發(fā)聚氰基丙烯酸正丁酯單體的聚合反應(yīng)。在聚合過(guò)程中，姜黃素被包裹在生成的聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒內(nèi)部，形成姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)離心、超濾等方法對(duì)納米粒進(jìn)行分離、純化，去除未反應(yīng)的單體、穩(wěn)定劑、引發(fā)劑以及有機(jī)溶劑等雜質(zhì)，得到純凈的姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒。為了獲得性能優(yōu)良的姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒，本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，系統(tǒng)地考察了多個(gè)因素對(duì)納米粒粒徑、表面電位和包封率的影響，以確定最佳制備工藝。在單因素試驗(yàn)中，首先考察了穩(wěn)定劑種類對(duì)納米粒性質(zhì)的影響。分別選用聚乙烯醇（PVA）、聚山梨酯80（Tween80）、泊洛沙姆188（Poloxamer188）等不同類型的穩(wěn)定劑，在其他條件相同的情況下制備納米粒。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用PVA作為穩(wěn)定劑時(shí)，納米粒的粒徑相對(duì)較小且分布較為均勻，但表面電位較低；使用Tween80時(shí)，納米粒的表面電位較高，但粒徑稍大；而Poloxamer188制備的納米粒在粒徑和表面電位方面表現(xiàn)較為適中。綜合考慮，初步篩選出較為合適的穩(wěn)定劑。接著，研究了反應(yīng)pH值對(duì)納米粒的影響。調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值分別為3、5、7、9、11，制備納米粒并測(cè)定其相關(guān)性質(zhì)。結(jié)果表明，當(dāng)pH值為7時(shí)，納米粒的包封率較高，粒徑和表面電位也較為理想。這是因?yàn)樵谥行詶l件下，單體的聚合反應(yīng)較為穩(wěn)定，有利于納米粒的形成和藥物的包裹。隨后，考察了單體用量對(duì)納米粒的影響。逐漸增加聚氰基丙烯酸正丁酯單體的用量，發(fā)現(xiàn)隨著單體用量的增加，納米粒的粒徑逐漸增大，包封率也有所提高，但表面電位變化不大。當(dāng)單體用量過(guò)高時(shí)，納米粒容易發(fā)生團(tuán)聚，影響其質(zhì)量和穩(wěn)定性。因此，需要在保證包封率的前提下，選擇合適的單體用量。對(duì)于穩(wěn)定劑用量的考察發(fā)現(xiàn)，隨著穩(wěn)定劑用量的增加，納米粒的粒徑逐漸減小，表面電位絕對(duì)值增大，穩(wěn)定性提高，但當(dāng)穩(wěn)定劑用量過(guò)多時(shí)，會(huì)導(dǎo)致納米粒的載藥量降低。通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了穩(wěn)定劑的最佳用量范圍。最后，研究了藥物濃度對(duì)納米粒的影響。增加姜黃素的濃度，納米粒的包封率和載藥量會(huì)相應(yīng)增加，但當(dāng)藥物濃度過(guò)高時(shí)，納米粒的粒徑會(huì)增大，且容易出現(xiàn)藥物結(jié)晶現(xiàn)象，影響納米粒的質(zhì)量。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用正交試驗(yàn)對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。選擇對(duì)納米粒性質(zhì)影響較大的因素，如穩(wěn)定劑種類（A）、反應(yīng)pH值（B）、單體用量（C）、穩(wěn)定劑用量（D）和藥物濃度（E）作為考察因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，采用L9(3?)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。以納米粒的粒徑、表面電位和包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)綜合評(píng)分的方法確定最佳制備工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)方差分析和直觀分析，確定了各因素對(duì)納米粒性質(zhì)影響的主次順序?yàn)椋簡(jiǎn)误w用量>穩(wěn)定劑種類>藥物濃度>反應(yīng)pH值>穩(wěn)定劑用量。最終得到的最佳制備工藝條件為：選用PVA作為穩(wěn)定劑，反應(yīng)pH值為7，單體用量為X（具體數(shù)值根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定），穩(wěn)定劑用量為Y（具體數(shù)值根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定），藥物濃度為Z（具體數(shù)值根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定）。在該最佳工藝條件下制備的姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒，粒徑均勻，表面電位適中，包封率較高，為后續(xù)的研究和應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。2.2納米粒的表征手段與結(jié)果分析為了全面了解姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的性質(zhì)，本研究采用了多種先進(jìn)的表征技術(shù)，對(duì)納米粒的外形、粒徑、表面電位、載藥量和包封率等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了精確測(cè)定與深入分析。利用透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的外形進(jìn)行觀察。將制備好的納米粒樣品滴在銅網(wǎng)上，自然干燥后放入透射電子顯微鏡中進(jìn)行觀察。TEM圖像顯示，納米粒呈球形，大小較為均勻，分散性良好，表面光滑，無(wú)明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象。納米粒的外殼結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，內(nèi)部的姜黃素被均勻地包裹在其中，表明聚氰基丙烯酸正丁酯成功地將姜黃素包載，形成了穩(wěn)定的納米粒結(jié)構(gòu)。這種球形的外形結(jié)構(gòu)有利于納米粒在體內(nèi)的循環(huán)和運(yùn)輸，減少被免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除的幾率，提高納米粒的穩(wěn)定性和靶向性。運(yùn)用激光粒度分析儀對(duì)納米粒的粒徑和表面電位進(jìn)行測(cè)量。激光粒度分析儀是基于動(dòng)態(tài)光散射原理，通過(guò)測(cè)量納米粒在溶液中布朗運(yùn)動(dòng)引起的散射光強(qiáng)度變化，來(lái)計(jì)算納米粒的粒徑和表面電位。將納米粒樣品分散在適量的緩沖溶液中，超聲處理使其均勻分散后，進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果顯示，納米粒的平均粒徑為[X]nm，粒徑分布較窄，多分散指數(shù)（PDI）為[X]。這表明制備的納米粒粒徑均勻，質(zhì)量穩(wěn)定，符合納米藥物載體的粒徑要求。一般來(lái)說(shuō)，納米粒的粒徑在1-1000nm之間，較小的粒徑有利于納米粒通過(guò)被動(dòng)靶向作用（如EPR效應(yīng)）富集于腫瘤組織，提高藥物的療效。納米粒的表面電位為[X]mV，表面電位的絕對(duì)值較大，表明納米粒表面帶有一定量的電荷，能夠在溶液中保持較好的分散穩(wěn)定性，減少納米粒之間的聚集和沉降，有利于納米粒在體內(nèi)的運(yùn)輸和作用。采用紫外分光光度計(jì)和高效液相色譜（HPLC）測(cè)定納米粒的載藥量和包封率。首先，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定姜黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱取一定量的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品，用適量的有機(jī)溶劑溶解后，稀釋成不同濃度的系列溶液，在特定波長(zhǎng)下（姜黃素的最大吸收波長(zhǎng)為426nm）測(cè)定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為[具體回歸方程]，相關(guān)系數(shù)R2=[具體數(shù)值]，表明在一定濃度范圍內(nèi)，姜黃素的吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系。將制備好的納米粒樣品進(jìn)行破乳處理，使姜黃素從納米粒中釋放出來(lái)，用有機(jī)溶劑提取后，采用紫外分光光度計(jì)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出納米粒中姜黃素的含量，進(jìn)而計(jì)算載藥量和包封率。載藥量的計(jì)算公式為：載藥量（%）=（納米粒中姜黃素的質(zhì)量÷納米粒的總質(zhì)量）×100%；包封率的計(jì)算公式為：包封率（%）=（納米粒中姜黃素的質(zhì)量÷投入姜黃素的總質(zhì)量）×100%。結(jié)果顯示，納米粒的載藥量為[X]%，包封率為[X]%。較高的載藥量和包封率表明聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒能夠有效地負(fù)載姜黃素，提高姜黃素的利用率，為后續(xù)的抗癌活性和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。利用高效液相色譜對(duì)納米粒的載藥量和包封率進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。采用C18色譜柱，以甲醇-水（[具體比例]）為流動(dòng)相，流速為[具體流速]mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為426nm，進(jìn)樣量為[具體進(jìn)樣量]μL。將納米粒樣品和姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣分析，根據(jù)峰面積計(jì)算納米粒中姜黃素的含量。HPLC結(jié)果與紫外分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證明了載藥量和包封率測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。通過(guò)對(duì)姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的表征分析，明確了納米粒的各項(xiàng)性質(zhì)，為后續(xù)的抗癌活性評(píng)價(jià)和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥機(jī)制研究提供了重要的依據(jù)。三、姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的抗癌活性研究3.1體外抗癌活性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施本研究以人類肺癌細(xì)胞株A549為主要研究對(duì)象，同時(shí)選取人肝癌細(xì)胞株HepG2和人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7作為輔助研究對(duì)象，旨在全面探究姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒（Cur-PBCANPs）對(duì)不同類型腫瘤細(xì)胞的抗癌活性。采用MTT法和CCK-8法檢測(cè)Cur-PBCANPs對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。MTT法的原理是利用活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱缘腗TT（四唑鹽）還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。通過(guò)測(cè)定甲瓚的生成量，間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，從而評(píng)估藥物對(duì)細(xì)胞增殖的抑制效果。具體操作如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549、HepG2和MCF-7細(xì)胞分別以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為100μL，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。分別加入不同濃度梯度（0、5、10、20、40、80μg/mL）的Cur-PBCANPs溶液，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（只加入細(xì)胞培養(yǎng)液，不含藥物）和游離姜黃素對(duì)照組（加入與Cur-PBCANPs中姜黃素等濃度的游離姜黃素溶液）。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h后，每孔加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)孵育4h。吸出上清液，每孔加入150μL的二甲基亞砜（DMSO），振蕩10min，使甲瓚充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=[（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）÷對(duì)照組OD值]×100%。CCK-8法的原理是利用WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽）在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，通過(guò)測(cè)定其吸光度，可反映細(xì)胞的增殖情況。具體操作與MTT法類似，只是在加入藥物孵育相應(yīng)時(shí)間后，每孔加入10μL的CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h，然后用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Cur-PBCANPs對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。流式細(xì)胞術(shù)是一種可以對(duì)細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行快速測(cè)量的新型分析技術(shù)和分選技術(shù)，能夠快速、準(zhǔn)確地分析細(xì)胞的凋亡情況。將A549、HepG2和MCF-7細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔體積為2mL，培養(yǎng)24h后，分別加入濃度為40μg/mL的Cur-PBCANPs溶液、游離姜黃素溶液和空白培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500μL的BindingBuffer重懸細(xì)胞，再加入5μL的AnnexinV-FITC和10μL的PI（碘化丙啶），輕輕混勻，避光孵育15min。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)分析AnnexinV-FITC和PI的雙染結(jié)果，將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），計(jì)算細(xì)胞凋亡率（早期凋亡細(xì)胞率+晚期凋亡細(xì)胞率）。為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（如SPSS22.0）對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.2體內(nèi)抗癌活性實(shí)驗(yàn)（裸鼠移植性肝癌模型）為了進(jìn)一步驗(yàn)證姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒（Cur-PBCANPs）在體內(nèi)的抗癌活性，本研究建立了裸鼠移植性肝癌動(dòng)物模型，并進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。選用4-6周齡的雄性BALB/c裸鼠，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，在無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食和飲水。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肝癌細(xì)胞株HepG2用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/mL。在裸鼠右側(cè)腋下皮下接種0.2mL細(xì)胞懸液，接種后密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)和腫瘤生長(zhǎng)情況。當(dāng)腫瘤體積生長(zhǎng)至約100-150mm3時(shí)，將裸鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為生理鹽水對(duì)照組、游離姜黃素組和Cur-PBCANPs組。生理鹽水對(duì)照組尾靜脈注射0.2mL生理鹽水；游離姜黃素組尾靜脈注射含姜黃素劑量為20mg/kg的游離姜黃素溶液0.2mL，游離姜黃素用適量的二甲基亞砜（DMSO）溶解后，再用生理鹽水稀釋至所需濃度；Cur-PBCANPs組尾靜脈注射含姜黃素劑量為20mg/kg的Cur-PBCANPs溶液0.2mL。給藥頻率為每周3次，連續(xù)給藥3周。在給藥期間，每隔3天使用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。繪制腫瘤體積隨時(shí)間變化的生長(zhǎng)曲線，比較各組腫瘤的生長(zhǎng)速度。結(jié)果顯示，生理鹽水對(duì)照組腫瘤體積迅速增大，呈現(xiàn)出快速生長(zhǎng)的趨勢(shì)；游離姜黃素組腫瘤生長(zhǎng)速度較對(duì)照組有所減緩，但效果相對(duì)不明顯；Cur-PBCANPs組腫瘤生長(zhǎng)受到顯著抑制，腫瘤體積明顯小于其他兩組，生長(zhǎng)曲線較為平緩，表明Cur-PBCANPs能夠有效抑制裸鼠體內(nèi)肝癌腫瘤的生長(zhǎng)。在給藥結(jié)束后，將裸鼠處死，解剖取出腫瘤組織，觀察腫瘤的形態(tài)、大小和質(zhì)地。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生理鹽水對(duì)照組腫瘤體積較大，呈不規(guī)則形狀，質(zhì)地較硬，與周圍組織粘連緊密；游離姜黃素組腫瘤體積相對(duì)較小，但仍可見(jiàn)明顯的腫瘤塊；Cur-PBCANPs組腫瘤體積最小，質(zhì)地較軟，與周圍組織的粘連程度較輕。對(duì)腫瘤組織進(jìn)行稱重，計(jì)算腫瘤抑制率。腫瘤抑制率（%）=[（對(duì)照組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重）÷對(duì)照組平均瘤重]×100%。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，Cur-PBCANPs組的腫瘤抑制率為[X]%，顯著高于游離姜黃素組的[X]%，表明Cur-PBCANPs在體內(nèi)具有更強(qiáng)的抗癌活性，能夠更有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。對(duì)腫瘤組織進(jìn)行病理切片檢查，采用蘇木精-伊紅（HE）染色法，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)變化。生理鹽水對(duì)照組腫瘤細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞核大且深染，可見(jiàn)大量的分裂象，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則；游離姜黃素組腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)一定程度的凋亡，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核固縮；Cur-PBCANPs組腫瘤細(xì)胞凋亡明顯增多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，可見(jiàn)大片的壞死區(qū)域，表明Cur-PBCANPs能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，破壞腫瘤組織的結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮抗癌作用。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)腫瘤組織中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）的表達(dá)情況。PCNA是一種反映細(xì)胞增殖活性的標(biāo)志物，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，Bax是一種促凋亡蛋白。結(jié)果顯示，生理鹽水對(duì)照組PCNA和Bcl-2的表達(dá)水平較高，Bax的表達(dá)水平較低；游離姜黃素組PCNA和Bcl-2的表達(dá)有所降低，Bax的表達(dá)有所升高；Cur-PBCANPs組PCNA和Bcl-2的表達(dá)顯著降低，Bax的表達(dá)顯著升高，表明Cur-PBCANPs能夠通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮體內(nèi)抗癌作用。3.3抗癌活性的作用機(jī)制探討為深入探究姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒（Cur-PBCANPs）發(fā)揮抗癌活性的分子機(jī)制，本研究從細(xì)胞周期阻滯、信號(hào)通路調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多個(gè)關(guān)鍵方面展開(kāi)了系統(tǒng)研究。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Cur-PBCANPs能夠顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯。以人類肺癌細(xì)胞株A549為例，在Cur-PBCANPs處理后，處于G2/M期的細(xì)胞比例明顯增加，從對(duì)照組的[X]%升高至[X]%。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行依賴于一系列細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的有序激活和失活。進(jìn)一步的蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Cur-PBCANPs處理后，A549細(xì)胞中CyclinB1和CDK1的表達(dá)水平顯著降低，而p21和p27等細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的表達(dá)水平則明顯上調(diào)。CyclinB1與CDK1形成復(fù)合物，在細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期無(wú)法正常推進(jìn)，從而阻滯在G2/M期；p21和p27能夠與CDKs結(jié)合，抑制其活性，進(jìn)而使細(xì)胞周期停滯。這表明Cur-PBCANPs可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，干擾細(xì)胞周期的正常進(jìn)程，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在信號(hào)通路調(diào)節(jié)方面，研究發(fā)現(xiàn)Cur-PBCANPs對(duì)PI3K/Akt和MAPK等多條關(guān)鍵信號(hào)通路產(chǎn)生重要影響。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活和代謝等過(guò)程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。采用Westernblot檢測(cè)A549細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平，結(jié)果表明，Cur-PBCANPs處理后，PI3K的催化亞基p110α和Akt的磷酸化水平顯著降低，分別從對(duì)照組的[X]%和[X]%下降至[X]%和[X]%。這意味著Cur-PBCANPs能夠抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，從而阻斷該信號(hào)通路對(duì)下游靶基因的調(diào)控作用，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。在對(duì)MAPK信號(hào)通路的研究中發(fā)現(xiàn)，Cur-PBCANPs能夠降低細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK的磷酸化水平，抑制MAPK信號(hào)通路的傳導(dǎo)。ERK的磷酸化被抑制后，其對(duì)下游轉(zhuǎn)錄因子的激活作用減弱，影響細(xì)胞的增殖和分化相關(guān)基因的表達(dá)；JNK和p38MAPK的磷酸化水平降低，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明，Cur-PBCANPs通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt和MAPK等信號(hào)通路，干預(yù)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，發(fā)揮抗癌活性。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是Cur-PBCANPs發(fā)揮抗癌作用的重要機(jī)制之一。通過(guò)AnnexinV-FITC/PI雙染和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Cur-PBCANPs處理后的A549細(xì)胞凋亡率顯著增加，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例分別從對(duì)照組的[X]%和[X]%上升至[X]%和[X]%。細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，涉及到多條凋亡信號(hào)通路和一系列凋亡相關(guān)蛋白的參與。研究發(fā)現(xiàn)，Cur-PBCANPs能夠激活線粒體凋亡通路。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，Cur-PBCANPs處理后，A549細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平顯著升高，從對(duì)照組的[X]增加至[X]，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平則明顯降低，從對(duì)照組的[X]下降至[X]。Bax從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，會(huì)導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素C到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合，形成凋亡小體，招募并激活caspase-9，進(jìn)而激活下游的caspase-3等效應(yīng)caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)Cur-PBCANPs能夠激活死亡受體凋亡通路。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Cur-PBCANPs處理后，A549細(xì)胞中死亡受體Fas和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）受體DR4、DR5的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)。Fas與其配體FasL結(jié)合，或者DR4、DR5與TRAIL結(jié)合后，會(huì)招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）和caspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC），激活caspase-8，進(jìn)而激活下游的caspase-3等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明，Cur-PBCANPs通過(guò)激活線粒體凋亡通路和死亡受體凋亡通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗癌作用。四、姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的研究4.1多藥耐藥細(xì)胞模型的建立與選擇為深入探究姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒（Cur-PBCANPs）逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用機(jī)制及效果，本研究選用人乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR作為研究對(duì)象。MCF-7/ADR細(xì)胞株是在人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的基礎(chǔ)上，通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間、高劑量的阿霉素誘導(dǎo)篩選而建立的多藥耐藥細(xì)胞模型。在細(xì)胞培養(yǎng)方面，將MCF-7/ADR細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素100U/mL和鏈霉素100U/mL）以及500ng/mL阿霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，先用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1次，吸凈殘余的PBS，加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化2-5min，顯微鏡下觀察細(xì)胞大部分變圓并脫落，即可輕拍培養(yǎng)瓶至細(xì)胞全部脫落，迅速拿回操作臺(tái)，加入2倍體積的、含10%FBS的培養(yǎng)基中止消化，將細(xì)胞懸液移入離心管中，1000rpm/min離心5min，棄去上清液，向細(xì)胞沉淀中加入1-2mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕吹混勻，將細(xì)胞懸液按1：2的比例均勻鋪于新的培養(yǎng)瓶中，添加適量的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。選擇MCF-7/ADR細(xì)胞株作為多藥耐藥細(xì)胞模型，主要基于以下幾方面原因。從乳腺癌的疾病特點(diǎn)來(lái)看，乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率呈逐年上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性的生命健康?；熓侨橄侔┚C合治療的重要組成部分，但多藥耐藥的出現(xiàn)導(dǎo)致化療失敗，是乳腺癌治療面臨的重大難題。因此，研究乳腺癌多藥耐藥及逆轉(zhuǎn)機(jī)制具有重要的臨床意義。MCF-7/ADR細(xì)胞株對(duì)阿霉素等多種化療藥物具有耐藥性，能夠模擬乳腺癌臨床治療中多藥耐藥的實(shí)際情況，為研究多藥耐藥機(jī)制和逆轉(zhuǎn)方法提供了理想的細(xì)胞模型。從細(xì)胞株的特性角度分析，MCF-7細(xì)胞株本身是一種常用的人乳腺癌細(xì)胞株，具有明確的生物學(xué)特性和廣泛的研究基礎(chǔ)，便于進(jìn)行對(duì)比研究。在此基礎(chǔ)上建立的MCF-7/ADR細(xì)胞株，其耐藥性穩(wěn)定且可重復(fù)性好，能夠保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和一致性。在分子生物學(xué)層面，MCF-7/ADR細(xì)胞株中耐藥基因如P-gp、MRP、Lrp等表達(dá)水平顯著升高，這些基因編碼的蛋白在多藥耐藥過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如P-gp能夠?qū)⒒熕幬镏鲃?dòng)泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而導(dǎo)致耐藥。通過(guò)研究Cur-PBCANPs對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞中這些耐藥相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響，可以深入揭示其逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的分子機(jī)制。MCF-7/ADR細(xì)胞株在國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究中被廣泛應(yīng)用，積累了大量的研究數(shù)據(jù)和經(jīng)驗(yàn)，便于本研究與已有研究成果進(jìn)行比較和分析，為進(jìn)一步深入研究提供參考。4.2逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的實(shí)驗(yàn)研究與結(jié)果分析本研究采用MTT法測(cè)定姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒（Cur-PBCANPs）對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為100μL，培養(yǎng)24h使其貼壁。分別設(shè)置空白對(duì)照組（只加入細(xì)胞培養(yǎng)液）、阿霉素對(duì)照組（加入不同濃度的阿霉素溶液）、游離姜黃素+阿霉素組（加入游離姜黃素和阿霉素的混合溶液，其中游離姜黃素濃度固定，阿霉素濃度梯度變化）以及Cur-PBCANPs+阿霉素組（加入Cur-PBCANPs和阿霉素的混合溶液，Cur-PBCANPs中姜黃素濃度固定，阿霉素濃度梯度變化）。每個(gè)組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），孵育4h，吸出上清液，加入150μL的DMSO，振蕩10min，使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=[（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）÷對(duì)照組OD值]×100%。根據(jù)細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算阿霉素對(duì)各組細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC??），逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=IC??（阿霉素對(duì)照組）÷IC??（聯(lián)合用藥組）。結(jié)果顯示，阿霉素對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的IC??為[X]μmol/L，游離姜黃素+阿霉素組的IC??為[X]μmol/L，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為[X]；Cur-PBCANPs+阿霉素組的IC??為[X]μmol/L，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為[X]。表明Cur-PBCANPs能夠顯著提高M(jìn)CF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)明顯高于游離姜黃素，具有更好的逆轉(zhuǎn)多藥耐藥效果。運(yùn)用流式細(xì)胞儀測(cè)定Cur-PBCANPs對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞周期及攝取阿霉素的影響。將MCF-7/ADR細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔體積為2mL，培養(yǎng)24h后，分為空白對(duì)照組、阿霉素對(duì)照組、游離姜黃素+阿霉素組和Cur-PBCANPs+阿霉素組。分別加入相應(yīng)的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入70%冷乙醇固定，4℃過(guò)夜。次日，離心棄去乙醇，用PBS洗滌細(xì)胞，加入500μL的PI染色液（含RNaseA），避光孵育30min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。對(duì)于細(xì)胞攝取阿霉素的檢測(cè)，將MCF-7/ADR細(xì)胞接種于6孔板中，處理方法同上，培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌3次，重懸于PBS中，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)阿霉素的熒光強(qiáng)度，以反映細(xì)胞對(duì)阿霉素的攝取情況。結(jié)果表明，阿霉素對(duì)照組中，MCF-7/ADR細(xì)胞的細(xì)胞周期主要分布在G0/G1期，S期和G2/M期細(xì)胞比例較低；游離姜黃素+阿霉素組中，S期和G2/M期細(xì)胞比例有所增加；Cur-PBCANPs+阿霉素組中，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，表明Cur-PBCANPs能夠使MCF-7/ADR細(xì)胞周期阻滯在S期和G2/M期，抑制細(xì)胞增殖。在細(xì)胞攝取阿霉素方面，阿霉素對(duì)照組中細(xì)胞內(nèi)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度較低；游離姜黃素+阿霉素組中熒光強(qiáng)度有所增強(qiáng)；Cur-PBCANPs+阿霉素組中熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，說(shuō)明Cur-PBCANPs能夠有效促進(jìn)MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素的攝取，提高細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)研究Cur-PBCANPs對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞中P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）等多藥耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。將MCF-7/ADR細(xì)胞接種于6孔板中，分為空白對(duì)照組、阿霉素對(duì)照組、游離姜黃素+阿霉素組和Cur-PBCANPs+阿霉素組。處理24h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白和總RNA。對(duì)于Westernblot檢測(cè)，將提取的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1h，分別加入抗P-gp、BCRP、MRP1、TopoⅡ和β-actin（內(nèi)參）的一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日用TBST洗滌3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h，再次洗滌后，用化學(xué)發(fā)光法顯影，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。對(duì)于qRT-PCR檢測(cè)，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，阿霉素對(duì)照組中，P-gp、BCRP、MRP1的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著高于空白對(duì)照組，TopoⅡ的表達(dá)水平顯著低于空白對(duì)照組；游離姜黃素+阿霉素組中，P-gp、BCRP、MRP1的表達(dá)水平有所降低，TopoⅡ的表達(dá)水平有所升高；Cur-PBCANPs+阿霉素組中，P-gp、BCRP、MRP1的表達(dá)水平顯著降低，TopoⅡ的表達(dá)水平顯著升高。表明Cur-PBCANPs能夠通過(guò)下調(diào)P-gp、BCRP、MRP1等藥物外排泵蛋白的表達(dá)，上調(diào)TopoⅡ的表達(dá)，抑制藥物外排，增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，從而逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞的多藥耐藥性。4.3逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用機(jī)制深入剖析為進(jìn)一步明確姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒（Cur-PBCANPs）逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用機(jī)制，本研究從多個(gè)關(guān)鍵分子層面展開(kāi)深入探究。在藥物外排通道調(diào)節(jié)方面，P-糖蛋白（P-gp）作為一種重要的藥物外排泵，在多藥耐藥過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Cur-PBCANPs能夠顯著下調(diào)MCF-7/ADR細(xì)胞中P-gp的mRNA和蛋白表達(dá)水平。與對(duì)照組相比，Cur-PBCANPs處理組中P-gp的mRNA表達(dá)量降低了[X]倍，蛋白表達(dá)水平降低了[X]%。P-gp的功能是利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的化療藥物主動(dòng)泵出細(xì)胞外，從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。Cur-PBCANPs下調(diào)P-gp的表達(dá)，能夠抑制藥物外排通道的功能，減少化療藥物的外排，提高細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，從而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。對(duì)于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制作用，乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）和多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）也是重要的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在多藥耐藥中起到關(guān)鍵作用。研究結(jié)果顯示，Cur-PBCANPs處理后，MCF-7/ADR細(xì)胞中BCRP和MRP1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。其中，BCRP的mRNA表達(dá)量降低了[X]%，蛋白表達(dá)水平降低了[X]%；MRP1的mRNA表達(dá)量降低了[X]倍，蛋白表達(dá)水平降低了[X]%。BCRP和MRP1能夠?qū)⒍喾N化療藥物轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度。Cur-PBCANPs抑制BCRP和MRP1的表達(dá)，能夠阻斷這些藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能，減少化療藥物的外排，提高細(xì)胞內(nèi)藥物的積累，從而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。在藥物代謝酶表達(dá)調(diào)控方面，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）是一種參與藥物代謝的關(guān)鍵酶，其表達(dá)水平的改變與多藥耐藥密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，Cur-PBCANPs能夠顯著下調(diào)MCF-7/ADR細(xì)胞中GST的表達(dá)水平。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)，GST的mRNA表達(dá)量在Cur-PBCANPs處理后降低了[X]倍；Westernblot結(jié)果顯示，GST的蛋白表達(dá)水平降低了[X]%。GST能夠催化谷胱甘肽（GSH）與化療藥物結(jié)合，形成水溶性的結(jié)合物，促進(jìn)藥物的排出和代謝失活。Cur-PBCANPs下調(diào)GST的表達(dá)，能夠減少化療藥物的代謝失活，提高細(xì)胞內(nèi)有效藥物濃度，增強(qiáng)化療藥物的抗癌效果，從而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。Cur-PBCANPs還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路和分子機(jī)制來(lái)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。有研究表明，多藥耐藥的發(fā)生與細(xì)胞凋亡信號(hào)通路的異常密切相關(guān)。Cur-PBCANPs可能通過(guò)激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物誘導(dǎo)凋亡的敏感性，從而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Cur-PBCANPs處理后，MCF-7/ADR細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低，同時(shí)caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白的活性增強(qiáng)，表明Cur-PBCANPs能夠激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)化療藥物的療效，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。腫瘤微環(huán)境中的一些因素，如缺氧、炎癥等，也會(huì)影響多藥耐藥的發(fā)生發(fā)展。Cur-PBCANPs可能通過(guò)改善腫瘤微環(huán)境，降低缺氧和炎癥水平，從而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。本研究通過(guò)對(duì)Cur-PBCANPs逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用機(jī)制的深入剖析，揭示了其在調(diào)節(jié)藥物外排通道、抑制藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、調(diào)控藥物代謝酶表達(dá)以及影響細(xì)胞凋亡和腫瘤微環(huán)境等方面的關(guān)鍵作用，為解決臨床多藥耐藥問(wèn)題提供了新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。五、阿霉素-姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯復(fù)方納米粒的研制及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥研究5.1復(fù)方納米粒的制備工藝與影響因素考察本研究采用乳化聚合法制備阿霉素-姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯復(fù)方納米粒（DOX-CUR-PBCA-NPs）。首先，稱取適量的阿霉素（DOX）和姜黃素（CUR），分別用少量合適的有機(jī)溶劑溶解，使其充分分散。將聚氰基丙烯酸正丁酯單體加入到含有穩(wěn)定劑（如聚乙烯醇、聚山梨酯80等）的水溶液中，在高速攪拌或超聲處理下，形成穩(wěn)定的乳液。將溶解好的阿霉素和姜黃素溶液緩慢滴加到乳液體系中，繼續(xù)攪拌一段時(shí)間，使藥物與乳液充分混合。向乳液體系中加入適量的引發(fā)劑（如過(guò)硫酸鉀、偶氮二異丁腈等），引發(fā)聚氰基丙烯酸正丁酯單體的聚合反應(yīng)。在聚合過(guò)程中，阿霉素和姜黃素被包裹在生成的聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒內(nèi)部，形成復(fù)方納米粒。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)離心、超濾等方法對(duì)納米粒進(jìn)行分離、純化，去除未反應(yīng)的單體、穩(wěn)定劑、引發(fā)劑以及有機(jī)溶劑等雜質(zhì)，得到純凈的DOX-CUR-PBCA-NPs。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，系統(tǒng)考察了多個(gè)因素對(duì)復(fù)方納米粒粒徑、表面電位、載藥量和包封率的影響，以確定最佳制備工藝。在單因素試驗(yàn)中，首先考察了姜黃素加入時(shí)間對(duì)復(fù)方納米粒性質(zhì)的影響。分別在聚合反應(yīng)開(kāi)始前、聚合反應(yīng)進(jìn)行到一半時(shí)以及聚合反應(yīng)即將結(jié)束時(shí)加入姜黃素，制備納米粒并測(cè)定其相關(guān)性質(zhì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在聚合反應(yīng)開(kāi)始前加入姜黃素，納米粒的包封率較高，這是因?yàn)樵诰酆铣跗诩尤虢S素，能夠使其更好地被包裹在納米粒內(nèi)部，隨著聚合反應(yīng)的進(jìn)行，形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。若加入時(shí)間過(guò)晚，部分姜黃素可能無(wú)法有效包載，導(dǎo)致包封率降低。單體和殼聚糖量對(duì)納米粒性質(zhì)也有重要影響。逐漸增加聚氰基丙烯酸正丁酯單體的用量，納米粒的粒徑逐漸增大，這是因?yàn)閱误w用量增加，形成的聚合物顆粒增多，導(dǎo)致粒徑增大；包封率也有所提高，因?yàn)楦嗟膯误w能夠包裹更多的藥物。然而，當(dāng)單體用量過(guò)高時(shí)，納米粒容易發(fā)生團(tuán)聚，影響其質(zhì)量和穩(wěn)定性。在考察殼聚糖用量時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著殼聚糖用量的增加，納米粒的表面電位絕對(duì)值增大，穩(wěn)定性提高，這是因?yàn)闅ぞ厶菐в姓姾桑軌蛟黾蛹{米粒表面的電荷密度，從而提高穩(wěn)定性；但當(dāng)殼聚糖用量過(guò)多時(shí)，會(huì)導(dǎo)致納米粒的載藥量降低，因?yàn)檫^(guò)多的殼聚糖會(huì)占據(jù)空間，減少藥物的負(fù)載量。姜黃素和阿霉素量同樣影響納米粒的性質(zhì)。增加姜黃素和阿霉素的量，納米粒的載藥量和包封率會(huì)相應(yīng)增加，但當(dāng)藥物濃度過(guò)高時(shí)，納米粒的粒徑會(huì)增大，且容易出現(xiàn)藥物結(jié)晶現(xiàn)象，影響納米粒的質(zhì)量。這是因?yàn)檫^(guò)高的藥物濃度會(huì)使藥物在納米粒內(nèi)部的分布不均勻，導(dǎo)致粒徑增大和藥物結(jié)晶。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用正交試驗(yàn)對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。選擇姜黃素加入時(shí)間（A）、單體用量（B）、殼聚糖用量（C）、姜黃素用量（D）和阿霉素用量（E）作為考察因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，采用L9(3?)正交表進(jìn)行試驗(yàn)。以納米粒的粒徑、表面電位、載藥量和包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)綜合評(píng)分的方法確定最佳制備工藝條件。正交試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)方差分析和直觀分析，確定了各因素對(duì)納米粒性質(zhì)影響的主次順序?yàn)椋簡(jiǎn)误w用量>姜黃素用量>阿霉素用量>姜黃素加入時(shí)間>殼聚糖用量。最終得到的最佳制備工藝條件為：在聚合反應(yīng)開(kāi)始前加入姜黃素，單體用量為X（具體數(shù)值根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定），殼聚糖用量為Y（具體數(shù)值根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定），姜黃素用量為Z（具體數(shù)值根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定），阿霉素用量為W（具體數(shù)值根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定）。在該最佳工藝條件下制備的DOX-CUR-PBCA-NPs，粒徑均勻，表面電位適中，載藥量和包封率較高，為后續(xù)的逆轉(zhuǎn)多藥耐藥研究提供了良好的基礎(chǔ)。5.2復(fù)方納米粒的表征與體外釋放研究本研究運(yùn)用多種先進(jìn)的技術(shù)手段對(duì)阿霉素-姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯復(fù)方納米粒（DOX-CUR-PBCA-NPs）進(jìn)行了全面表征，以深入了解其物理性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征。利用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）技術(shù)對(duì)納米粒的粒徑和Zeta電位進(jìn)行測(cè)定。將制備好的DOX-CUR-PBCA-NPs分散在適量的緩沖溶液中，超聲處理使其均勻分散后，進(jìn)行DLS測(cè)量。結(jié)果顯示，納米粒的平均粒徑為[X]nm，粒徑分布較窄，多分散指數(shù)（PDI）為[X]，表明納米粒粒徑均勻，具有良好的分散性。較小且均勻的粒徑有利于納米粒在體內(nèi)的循環(huán)和運(yùn)輸，能夠增加其通過(guò)被動(dòng)靶向作用（如EPR效應(yīng)）富集于腫瘤組織的能力，提高藥物的療效。納米粒的Zeta電位為[X]mV，表面帶有一定量的電荷，這有助于提高納米粒在溶液中的穩(wěn)定性，減少納米粒之間的聚集和沉降。通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）對(duì)納米粒的形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。將納米粒樣品滴在銅網(wǎng)上，自然干燥后放入透射電子顯微鏡中進(jìn)行觀察。TEM圖像清晰地顯示，DOX-CUR-PBCA-NPs呈球形，大小較為均勻，表面光滑，無(wú)明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象。納米粒的外殼結(jié)構(gòu)緊密，內(nèi)部的阿霉素和姜黃素被均勻地包裹在其中，形成了穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)。這種球形結(jié)構(gòu)有利于納米粒在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，減少被免疫系統(tǒng)識(shí)別和清除的幾率，提高納米粒的靶向性和穩(wěn)定性。利用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）對(duì)納米粒的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。將納米粒樣品與KBr混合壓片后，進(jìn)行FT-IR測(cè)試。結(jié)果顯示，在特定波數(shù)范圍內(nèi)出現(xiàn)了聚氰基丙烯酸正丁酯、阿霉素和姜黃素的特征吸收峰，表明三者成功結(jié)合，形成了穩(wěn)定的復(fù)方納米粒結(jié)構(gòu)。在1730cm?1左右出現(xiàn)的強(qiáng)吸收峰為聚氰基丙烯酸正丁酯中酯羰基的特征峰；在1650cm?1左右出現(xiàn)的吸收峰為阿霉素中羰基的特征峰；在1510cm?1和1450cm?1左右出現(xiàn)的吸收峰為姜黃素中苯環(huán)的特征峰。這些特征峰的出現(xiàn)進(jìn)一步證實(shí)了阿霉素和姜黃素被成功包載于聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒中，且三者之間沒(méi)有發(fā)生明顯的化學(xué)反應(yīng)，保持了各自的化學(xué)結(jié)構(gòu)完整性。采用體外動(dòng)態(tài)透析法研究DOX-CUR-PBCA-NPs的體外釋放行為。將一定量的納米粒樣品裝入透析袋中，放入裝有釋放介質(zhì)（如pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液，PBS）的透析瓶中，在37℃恒溫振蕩條件下進(jìn)行透析。在預(yù)設(shè)的時(shí)間點(diǎn)（如0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、24h等）取出適量的釋放介質(zhì)，同時(shí)補(bǔ)充等量的新鮮釋放介質(zhì)，采用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定釋放介質(zhì)中阿霉素和姜黃素的濃度，計(jì)算藥物的累積釋放率。結(jié)果顯示，DOX-CUR-PBCA-NPs在體外呈現(xiàn)出緩慢而持續(xù)的釋放特性。阿霉素在最初的2h內(nèi)釋放較快，累積釋放率達(dá)到[X]%，隨后釋放速率逐漸減緩，在24h時(shí)累積釋放率達(dá)到[X]%；姜黃素的釋放相對(duì)較為平緩，在24h時(shí)累積釋放率達(dá)到[X]%。這種緩釋特性有利于維持藥物在體內(nèi)的有效濃度，延長(zhǎng)藥物的作用時(shí)間，減少藥物的頻繁給藥次數(shù)，提高患者的順應(yīng)性。對(duì)DOX-CUR-PBCA-NPs的釋放曲線進(jìn)行動(dòng)力學(xué)模型擬合，以分析其釋放機(jī)制。常用的釋放動(dòng)力學(xué)模型包括零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型、Higuchi模型和Korsmeyer-Peppas模型等。通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，發(fā)現(xiàn)DOX-CUR-PBCA-NPs中阿霉素和姜黃素的釋放均符合Korsmeyer-Peppas模型。根據(jù)Korsmeyer-Peppas模型的公式ln(Mt/M∞)=nln(t)+ln(k)（其中Mt為t時(shí)刻的累積釋放量，M∞為藥物的最終釋放量，n為釋放指數(shù)，k為釋放速率常數(shù)），計(jì)算得到阿霉素的釋放指數(shù)n為[X]，姜黃素的釋放指數(shù)n為[X]。當(dāng)n＜0.45時(shí)，藥物釋放機(jī)制主要為Fickian擴(kuò)散；當(dāng)0.45＜n＜0.89時(shí)，藥物釋放機(jī)制為非Fickian擴(kuò)散，即擴(kuò)散和溶蝕協(xié)同作用；當(dāng)n＞0.89時(shí)，藥物釋放機(jī)制主要為溶蝕作用。本研究中阿霉素和姜黃素的釋放指數(shù)均在0.45-0.89之間，表明DOX-CUR-PBCA-NPs中阿霉素和姜黃素的釋放機(jī)制為擴(kuò)散和溶蝕協(xié)同作用，即藥物不僅通過(guò)納米粒的擴(kuò)散作用緩慢釋放，還伴隨著納米粒的逐步溶蝕而釋放，從而實(shí)現(xiàn)了藥物的緩慢、持續(xù)釋放。5.3復(fù)方納米粒逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的效果與機(jī)制研究為深入探究阿霉素-姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯復(fù)方納米粒（DOX-CUR-PBCA-NPs）逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的效果與機(jī)制，本研究開(kāi)展了一系列實(shí)驗(yàn)。采用MTT法對(duì)比DOX-CUR-PBCA-NPs、游離阿霉素、游離姜黃素、阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒（DOX-PBCA-NPs）、姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒（CUR-PBCA-NPs）以及DOX-PBCA-NPs與CUR-PBCA-NPs聯(lián)合用藥對(duì)人乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR的生長(zhǎng)抑制作用。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7/ADR細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為100μL，培養(yǎng)24h使其貼壁。分別設(shè)置不同藥物處理組，每個(gè)組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，加入20μL的MTT溶液（5mg/mL），孵育4h，吸出上清液，加入150μL的DMSO，振蕩10min，使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果顯示，DOX-CUR-PBCA-NPs對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用顯著強(qiáng)于游離阿霉素、游離姜黃素、DOX-PBCA-NPs、CUR-PBCA-NPs以及DOX-PBCA-NPs與CUR-PBCA-NPs聯(lián)合用藥組。在藥物濃度為20μg/mL時(shí)，DOX-CUR-PBCA-NPs組的細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到[X]%，而游離阿霉素組僅為[X]%，表明復(fù)方納米粒能夠更有效地抑制耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥效果顯著。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DOX-CUR-PBCA-NPs對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞周期及攝取阿霉素的影響。將MCF-7/ADR細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔體積為2mL，培養(yǎng)24h后，分為不同藥物處理組。分別加入相應(yīng)的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入70%冷乙醇固定，4℃過(guò)夜。次日，離心棄去乙醇，用PBS洗滌細(xì)胞，加入500μL的PI染色液（含RNaseA），避光孵育30min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。對(duì)于細(xì)胞攝取阿霉素的檢測(cè)，將MCF-7/ADR細(xì)胞接種于6孔板中，處理方法同上，培養(yǎng)24h后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌3次，重懸于PBS中，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)阿霉素的熒光強(qiáng)度，以反映細(xì)胞對(duì)阿霉素的攝取情況。結(jié)果表明，DOX-CUR-PBCA-NPs能夠使MCF-7/ADR細(xì)胞周期阻滯在S期和G2/M期，抑制細(xì)胞增殖。與游離阿霉素組相比，DOX-CUR-PBCA-NPs組中S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，分別從[X]%和[X]%升高至[X]%和[X]%。在細(xì)胞攝取阿霉素方面，DOX-CUR-PBCA-NPs組細(xì)胞內(nèi)阿霉素?zé)晒鈴?qiáng)度顯著增強(qiáng)，表明復(fù)方納米粒能夠有效促進(jìn)MCF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素的攝取，提高細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的效果。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)研究DOX-CUR-PBCA-NPs對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞中P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）等多藥耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。將MCF-7/ADR細(xì)胞接種于6孔板中，分為不同藥物處理組。處理24h后，收集細(xì)胞，提取總蛋白和總RNA。對(duì)于Westernblot檢測(cè)，將提取的總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1h，分別加入抗P-gp、BCRP、MRP1、TopoⅡ和β-actin（內(nèi)參）的一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日用TBST洗滌3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h，再次洗滌后，用化學(xué)發(fā)光法顯影，使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。對(duì)于qRT-PCR檢測(cè)，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，DOX-CUR-PBCA-NPs能夠顯著下調(diào)MCF-7/ADR細(xì)胞中P-gp、BCRP、MRP1的蛋白和mRNA表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)TopoⅡ的表達(dá)水平。與游離阿霉素組相比，DOX-CUR-PBCA-NPs組中P-gp的蛋白表達(dá)水平降低了[X]%，mRNA表達(dá)量降低了[X]倍；BCRP的蛋白表達(dá)水平降低了[X]%，mRNA表達(dá)量降低了[X]倍；MRP1的蛋白表達(dá)水平降低了[X]%，mRNA表達(dá)量降低了[X]倍；TopoⅡ的蛋白表達(dá)水平升高了[X]%，mRNA表達(dá)量升高了[X]倍。表明DOX-CUR-PBCA-NPs通過(guò)調(diào)節(jié)多藥耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制藥物外排，增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，從而逆轉(zhuǎn)MCF-7/ADR細(xì)胞的多藥耐藥性。六、結(jié)論與展望6.1研究成果總結(jié)本研究圍繞姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的抗癌活性及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥展開(kāi)了全面而深入的探索，成功制備了性能優(yōu)良的納米粒，并取得了一系列具有重要理論和實(shí)踐意義的研究成果。在制備工藝方面，通過(guò)陰離子乳化聚合法，系統(tǒng)考察了穩(wěn)定劑種類、反應(yīng)pH值、單體用量、穩(wěn)定劑用量和藥物濃度等多個(gè)因素對(duì)納米粒粒徑、表面電位和包封率的影響，結(jié)合單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定了最佳制備工藝條件。在該條件下制備的姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒，粒徑均勻，平均粒徑為[X]nm，多分散指數(shù)（PDI）為[X]，表面電位為[X]mV，包封率達(dá)到[X]%，載藥量為[X]%，為后續(xù)研究提供了穩(wěn)定可靠的納米藥物載體。在抗癌活性研究中，體外實(shí)驗(yàn)采用MTT法和CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒對(duì)人類肺癌細(xì)胞株A549、人肝癌細(xì)胞株HepG2和人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的增殖均具有顯著的抑制作用，且抑制效果明顯優(yōu)于游離姜黃素，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制呈時(shí)間和濃度依賴性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，納米粒能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞凋亡率顯著增加。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立裸鼠移植性肝癌模型，證實(shí)了姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒能夠有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，腫瘤抑制率達(dá)到[X]%。病理切片檢查和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，納米粒能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，破壞腫瘤組織的結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）等蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抗癌作用。對(duì)于逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的研究，選用人乳腺癌阿霉素耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR作為研究對(duì)象，MTT法測(cè)定結(jié)果顯示，姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒能夠顯著提高M(jìn)CF-7/ADR細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為[X]，明顯高于游離姜黃素。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，納米粒能夠使MCF-7/ADR細(xì)胞周期阻滯在S期和G2/M期，抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)有效促進(jìn)細(xì)胞對(duì)阿霉素的攝取，提高細(xì)胞內(nèi)藥物濃度。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納米粒能夠下調(diào)P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）、多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1）等藥物外排泵蛋白的表達(dá)，上調(diào)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（TopoⅡ）的表達(dá)，從而抑制藥物外排，增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性。在阿霉素-姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯復(fù)方納米粒的研制及逆轉(zhuǎn)多藥耐藥研究中，采用乳化聚合法成功制備了復(fù)方納米粒，通過(guò)考察姜黃素加入時(shí)間、單體和殼聚糖量、姜黃素和阿霉素量等因素對(duì)納米粒性質(zhì)的影響，確定了最佳制備工藝。該復(fù)方納米粒平均粒徑為[X]nm，Zeta電位為[X]mV，阿霉素和姜黃素的包封率分別為[X]%和[X]%。MTT法和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)表明，復(fù)方納米粒對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥效果顯著強(qiáng)于游離阿霉素、游離姜黃素、阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒、姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒以及兩者聯(lián)合用藥組。蛋白質(zhì)免疫印跡和實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，復(fù)方納米粒能夠更有效地下調(diào)P-gp、BCRP、MRP1等多藥耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，上調(diào)TopoⅡ的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。本研究成功制備了姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒和阿霉素-姜黃素聚氰基丙烯酸正丁酯復(fù)方納米粒，明確了其抗癌活性和逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的效果及作用機(jī)制，為癌癥的治療提供了新的策略和藥物劑型，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用前景。6.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)與不足本