姜黃素對(duì)人腎癌細(xì)胞786-O的體外作用及多通路機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義腎癌，作為泌尿系統(tǒng)中惡性度較高的腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。其發(fā)病占腎臟惡性腫瘤的80%-90%，且近年來(lái)發(fā)病率呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)，發(fā)病年齡也愈發(fā)年輕化。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2022年中國(guó)腎癌發(fā)病約7.37萬(wàn)人，死亡約2.4萬(wàn)人，給患者家庭及社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。腎癌早期通常缺乏典型癥狀，當(dāng)患者出現(xiàn)腰痛、腰部包塊、血尿等明顯癥狀時(shí)，多數(shù)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。對(duì)于中晚期腎癌患者，目前的治療手段有限，除了手術(shù)治療外，化療、放療的效果并不理想，靶向治療雖有一定療效，但也面臨著耐藥性等問題，患者的5年生存率較低。例如，傳統(tǒng)化療藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成較大損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，生活質(zhì)量急劇下降。而靶向治療藥物的耐藥性問題，使得許多患者在治療一段時(shí)間后，病情再次惡化，治療陷入困境。尋找新的治療方法和藥物成為腎癌治療領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。姜黃素，作為一種從姜科、天南星科中的一些植物根莖中提取的天然多酚類化合物，具有多種生物活性，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤等，近年來(lái)在癌癥治療領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。研究表明，姜黃素可以通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗癌作用，如抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲等。例如，在對(duì)其他腫瘤細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠?qū)⒛[瘤細(xì)胞周期阻滯于特定時(shí)期，抑制癌細(xì)胞的增殖；還能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。人腎癌細(xì)胞786-O是一種常用的腎癌研究細(xì)胞系，其源自一名58歲白人男性原發(fā)性透明細(xì)胞腺癌組織，具有典型的腎癌細(xì)胞特征，常被用于腎癌疾病發(fā)展機(jī)制和防治手段的研究。探討姜黃素對(duì)人腎癌細(xì)胞786-O的體外作用及其機(jī)制，對(duì)于深入了解姜黃素的抗癌作用機(jī)制，開發(fā)新型的腎癌治療藥物或輔助治療方法具有重要意義，有望為腎癌患者帶來(lái)新的希望，改善他們的預(yù)后和生活質(zhì)量，在腎癌治療領(lǐng)域開拓新的思路和方向。1.2人腎癌細(xì)胞786-O概述人腎癌細(xì)胞786-O，又稱786-O細(xì)胞，于1979年從一名58歲白人男性原發(fā)性透明細(xì)胞腺癌組織中成功分離獲得。該細(xì)胞呈現(xiàn)粘附增殖的特性，在體外培養(yǎng)時(shí)，能緊密貼附于培養(yǎng)瓶壁，并不斷分裂增殖。它還具備在軟瓊脂中生長(zhǎng)的能力，這一特性是許多腫瘤細(xì)胞所特有的，意味著其具有較強(qiáng)的生存和增殖能力，即使在缺乏常規(guī)細(xì)胞外基質(zhì)支持的環(huán)境下，依然能夠持續(xù)生長(zhǎng)。同時(shí)，786-O細(xì)胞具有致瘤性，當(dāng)將其接種到免疫抑制的倉(cāng)鼠體內(nèi)時(shí)，能夠形成腫瘤組織，進(jìn)一步證實(shí)了其作為癌細(xì)胞的惡性特征。786-O細(xì)胞在形態(tài)上呈上皮樣，細(xì)胞邊界較為清晰，具有明顯的極性，通常緊密排列成單層，類似于正常上皮組織的結(jié)構(gòu)。在細(xì)胞表面，存在著微絨毛和橋粒等特殊結(jié)構(gòu)。微絨毛的存在增加了細(xì)胞的表面積，有助于細(xì)胞與周圍環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換，獲取更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以滿足其快速增殖的需求；橋粒則加強(qiáng)了細(xì)胞間的連接，使得細(xì)胞之間能夠緊密結(jié)合，形成相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞群體，這對(duì)于腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中維持細(xì)胞團(tuán)的完整性具有重要意義。此外，786-O細(xì)胞還表達(dá)甲狀旁腺激素（PTH）樣肽，這種肽具有PTH樣活性，分子量約為6000道爾頓。PTH樣肽的表達(dá)可能參與了786-O細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控、代謝調(diào)節(jié)以及與周圍組織的相互作用等過(guò)程，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。在腎癌研究領(lǐng)域，786-O細(xì)胞被廣泛應(yīng)用，成為了一種重要的研究模型。其主要優(yōu)勢(shì)在于，它來(lái)源于原發(fā)性透明細(xì)胞腺癌組織，能夠較為真實(shí)地模擬腎癌在人體內(nèi)的生物學(xué)行為和分子特征。通過(guò)對(duì)786-O細(xì)胞的研究，可以深入了解腎癌的發(fā)病機(jī)制，例如研究癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等過(guò)程中涉及的信號(hào)通路和分子靶點(diǎn)；評(píng)估各種潛在治療方法和藥物的療效，包括化療藥物、靶向藥物、免疫治療藥物等對(duì)786-O細(xì)胞的作用效果，為臨床治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)；還可以利用786-O細(xì)胞構(gòu)建動(dòng)物模型，進(jìn)一步研究腎癌在體內(nèi)的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及對(duì)治療的反應(yīng)，為開發(fā)新的治療策略和藥物提供有力支持。1.3姜黃素研究現(xiàn)狀姜黃素，作為一種從姜科、天南星科植物根莖中提取的天然多酚類化合物，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中早有應(yīng)用，具有悠久的使用歷史。姜黃屬植物如姜黃、莪術(shù)、郁金等，在亞洲地區(qū)被廣泛用于烹飪和藥用，其主要活性成分姜黃素，賦予了這些植物獨(dú)特的藥用價(jià)值。在古代印度醫(yī)學(xué)阿育吠陀中，姜黃被用于治療多種疾病，包括炎癥、消化問題等，姜黃素被認(rèn)為是發(fā)揮這些功效的關(guān)鍵成分。現(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有廣泛的生物活性。它具有強(qiáng)大的抗氧化作用，能夠清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。在炎癥反應(yīng)中，姜黃素可以抑制炎癥因子的釋放，調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗炎作用。例如，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，給予姜黃素處理的炎癥模型動(dòng)物，其體內(nèi)炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的表達(dá)水平明顯降低，炎癥癥狀得到緩解。姜黃素還在心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的防治中展現(xiàn)出潛在的作用，如降低血脂、改善認(rèn)知功能等。在抗腫瘤領(lǐng)域，姜黃素的研究備受關(guān)注。大量的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，姜黃素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。它可以通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗癌功效，包括抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、抑制腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲以及抑制腫瘤血管生成等。在細(xì)胞增殖方面，姜黃素能夠?qū)⒛[瘤細(xì)胞周期阻滯于不同時(shí)期，如G2/M期、S期或G1期，從而抑制癌細(xì)胞的分裂和增殖。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）等，來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，姜黃素可以激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。它能夠上調(diào)促凋亡蛋白如Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白如Bcl-2的表達(dá)，改變細(xì)胞內(nèi)的凋亡平衡，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，姜黃素還可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，減少腫瘤細(xì)胞向周圍組織和遠(yuǎn)處器官的擴(kuò)散。通過(guò)調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等相關(guān)蛋白的表達(dá)，姜黃素能夠降低腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力，從而抑制其遷移和侵襲行為。在抗腎癌研究中，姜黃素同樣展現(xiàn)出了良好的效果。研究表明，姜黃素能夠抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，在對(duì)人腎癌細(xì)胞786-O的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著姜黃素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，786-O細(xì)胞的增殖活性明顯受到抑制。姜黃素還能誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯，將786-O細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，使細(xì)胞無(wú)法順利進(jìn)入分裂期，從而抑制細(xì)胞增殖。在細(xì)胞遷移和侵襲方面，姜黃素通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-9、TIMP-1和TIMP-2等蛋白的表達(dá)，抑制786-O細(xì)胞的遷移和侵襲能力。姜黃素還能調(diào)節(jié)多個(gè)與腎癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K/Akt、STAT3和NF-κB等，來(lái)發(fā)揮抗癌作用。通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，姜黃素可以減少細(xì)胞的增殖和存活信號(hào)，從而抑制腎癌細(xì)胞的生長(zhǎng)；抑制STAT3信號(hào)通路，能夠阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖和抗凋亡信號(hào)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；抑制NF-κB的活性，姜黃素可以調(diào)節(jié)多種生長(zhǎng)因子的表達(dá)，進(jìn)而抑制腎癌的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。然而，姜黃素在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)，如生物利用度低、分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定性差等問題，限制了其臨床應(yīng)用。為了解決這些問題，研究人員正在嘗試將姜黃素與其他化合物或納米顆粒結(jié)合，以提高其藥物效果和生物利用度，為腎癌的治療提供更有效的策略。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞株人腎癌細(xì)胞786-O購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。細(xì)胞凍存于液氮中，在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，從液氮中取出凍存管，迅速放入37℃水浴鍋中，不斷搖晃，使其在1-2分鐘內(nèi)快速解凍。隨后，將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有4-6mL完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、1%雙抗）的離心管中，1000rpm離心3-5分鐘，棄去上清液，再用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，需要進(jìn)行傳代操作。具體步驟為，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用不含鈣、鎂離子的PBS緩沖液輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向培養(yǎng)瓶中加入1-2mL0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將培養(yǎng)瓶放入37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時(shí)，迅速將培養(yǎng)瓶拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞完全脫落。加入3-4mL含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其均勻分散，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心3-5分鐘，棄去上清液。用適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:2-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的T25培養(yǎng)瓶中，加入適量的完全培養(yǎng)基，放回37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。2.1.2主要試劑與儀器姜黃素（純度≥95%）購(gòu)自Sigma公司，用無(wú)菌DMSO溶解配制成100mM的母液，-20℃避光保存，使用時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗（青霉素-鏈霉素混合液）均購(gòu)自Gibco公司，用于細(xì)胞的培養(yǎng)，為細(xì)胞提供適宜的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境和防止微生物污染。MTT試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司，用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)甲臜的吸光度值，可間接反映細(xì)胞的增殖情況。AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD公司，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡，AnnexinV是一種Ca2?依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力，在細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，AnnexinV可以與之結(jié)合，而PI是一種核酸染料，不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在細(xì)胞凋亡晚期和壞死細(xì)胞中，PI可以進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinV-FITC和PI的雙染情況，可區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物公司，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布，其原理是利用DNA染料（如PI）與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，根據(jù)DNA含量的不同來(lái)區(qū)分不同時(shí)期的細(xì)胞，G1期細(xì)胞DNA含量為2n，S期細(xì)胞DNA含量介于2n-4n之間，G2/M期細(xì)胞DNA含量為4n。二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific），能夠精確控制溫度、濕度和CO?濃度，為細(xì)胞提供穩(wěn)定的培養(yǎng)環(huán)境，維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。酶標(biāo)儀（BioTek），用于檢測(cè)MTT實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞增殖活性，通過(guò)測(cè)量特定波長(zhǎng)下的吸光度值，對(duì)細(xì)胞增殖情況進(jìn)行量化分析。流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur），用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期，能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)，區(qū)分不同狀態(tài)的細(xì)胞群體。倒置顯微鏡（Olympus），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的變化，如細(xì)胞的貼壁情況、形態(tài)變化等。離心機(jī)（Eppendorf），用于細(xì)胞的離心分離，在細(xì)胞傳代、凍存、檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)步驟中，通過(guò)離心將細(xì)胞與培養(yǎng)基或其他試劑分離，方便后續(xù)操作。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)將人腎癌細(xì)胞786-O接種于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素-鏈霉素混合液，青霉素終濃度為100U/mL，鏈霉素終濃度為100μg/mL）的RPMI-1640培養(yǎng)基中。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱內(nèi)濕度保持在95%左右，為細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。每2-3天更換一次培養(yǎng)基，以去除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢物，補(bǔ)充新鮮的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用不含鈣、鎂離子的PBS緩沖液輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。然后加入適量的0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將培養(yǎng)瓶放入37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下密切觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時(shí)，迅速將培養(yǎng)瓶拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞完全脫落。加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其均勻分散，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心3-5分鐘，棄去上清液。用適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:2-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的完全培養(yǎng)基，放回37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，代謝活躍，對(duì)藥物的反應(yīng)較為敏感，能夠更準(zhǔn)確地反映藥物的作用效果。2.2.2姜黃素處理細(xì)胞將姜黃素用無(wú)菌DMSO溶解，配制成100mM的母液，由于姜黃素在溶液中穩(wěn)定性較差，尤其是在光照和高溫條件下容易分解，所以母液需保存在-20℃的環(huán)境中并嚴(yán)格避光，以確保其活性。在使用前，用預(yù)熱至37℃的完全培養(yǎng)基將母液稀釋成不同濃度的工作液，濃度分別設(shè)置為0μM（對(duì)照組，僅含等體積的DMSO，DMSO終濃度不超過(guò)0.1%，以排除DMSO對(duì)細(xì)胞的影響）、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的786-O細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁。貼壁后的細(xì)胞分別加入不同濃度的姜黃素工作液，每孔100μL，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置只加完全培養(yǎng)基和細(xì)胞的空白對(duì)照組，以及只加完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)基對(duì)照組。將96孔板放回培養(yǎng)箱中，分別培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)，用于后續(xù)的MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率；以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞貼壁，貼壁后加入不同濃度的姜黃素工作液，每孔2mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡；以每瓶5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于T25培養(yǎng)瓶中，加入5mL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞貼壁，貼壁后加入不同濃度的姜黃素工作液，每瓶5mL，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，用于蛋白免疫印跡法（WB）檢測(cè)蛋白表達(dá)。2.2.3檢測(cè)指標(biāo)與方法MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率：在姜黃素處理786-O細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)。從培養(yǎng)箱中取出96孔板，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)。此時(shí)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶會(huì)將MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。4小時(shí)后，小心吸去上清液，注意避免吸到細(xì)胞和甲臜結(jié)晶，每孔加入150μLDMSO，振蕩10-15分鐘，使甲臜結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值）。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式為：細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=[1-（實(shí)驗(yàn)組OD值-培養(yǎng)基對(duì)照組OD值）/（空白對(duì)照組OD值-培養(yǎng)基對(duì)照組OD值）]×100%。通過(guò)計(jì)算不同濃度姜黃素處理組在不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線，以評(píng)估姜黃素對(duì)786-O細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和凋亡：收集經(jīng)不同濃度姜黃素處理相應(yīng)時(shí)間后的6孔板中的786-O細(xì)胞。對(duì)于貼壁細(xì)胞，先用不含鈣、鎂離子的PBS緩沖液輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，去除殘留的培養(yǎng)基，然后加入適量的0.25%（w/v）胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時(shí)，迅速加入含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其均勻分散，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中。對(duì)于懸浮細(xì)胞，可直接將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管。將離心管在1000rpm條件下離心5分鐘，棄去上清液，用PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心，重復(fù)洗滌細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和消化液。細(xì)胞周期檢測(cè)：將洗滌后的細(xì)胞沉淀用預(yù)冷的70%乙醇固定，4℃冰箱中固定過(guò)夜。固定后的細(xì)胞在1000rpm條件下離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2-3次。加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PI）、100μg/mLRNaseA的染色緩沖液，37℃避光孵育30分鐘。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA含量的變化，區(qū)分不同時(shí)期的細(xì)胞，G1期細(xì)胞DNA含量為2n，S期細(xì)胞DNA含量介于2n-4n之間，G2/M期細(xì)胞DNA含量為4n。用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算各時(shí)期細(xì)胞的比例，以了解姜黃素對(duì)786-O細(xì)胞周期分布的影響。細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用AnnexinV-FITC/PI雙染法。將洗滌后的細(xì)胞沉淀用1×BindingBuffer重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入到5mL流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μL1×BindingBuffer，輕輕混勻。在1小時(shí)內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，AnnexinV是一種Ca2?依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力，在細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，AnnexinV可以與之結(jié)合，而PI是一種核酸染料，不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在細(xì)胞凋亡晚期和壞死細(xì)胞中，PI可以進(jìn)入細(xì)胞與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinV-FITC和PI的雙染情況，可區(qū)分正常細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）。用FlowJo軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算凋亡細(xì)胞（早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞）的比例，以研究姜黃素對(duì)786-O細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。蛋白免疫印跡法（WB）檢測(cè)蛋白表達(dá)：收集經(jīng)不同濃度姜黃素處理相應(yīng)時(shí)間后的T25培養(yǎng)瓶中的786-O細(xì)胞。棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞3次，以去除殘留的培養(yǎng)基。向培養(yǎng)瓶中加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30分鐘，期間輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使裂解液充分接觸細(xì)胞。用細(xì)胞刮將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上刮下，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至離心管中。在4℃條件下，12000rpm離心15分鐘，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書操作，先配制不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后將標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)蛋白樣品加入到96孔板中，每孔加入適量的BCA工作液，37℃孵育30分鐘。使用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出待測(cè)蛋白樣品的濃度。取適量的蛋白樣品，加入5×上樣緩沖液，混勻后，在100℃金屬浴中煮5-10分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度，一般采用10%-12%的分離膠和5%的濃縮膠。電泳時(shí)，先在80V恒壓下進(jìn)行濃縮膠電泳，當(dāng)?shù)鞍讟悠愤M(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，在冰浴條件下，以250mA恒流轉(zhuǎn)移1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫封閉1-2小時(shí)，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后的PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次5分鐘。然后將膜與一抗孵育，一抗為針對(duì)目的蛋白的特異性抗體，如Bax、Bcl-2、CyclinB1等，按照抗體說(shuō)明書的稀釋比例，用5%BSA稀釋一抗，將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過(guò)夜。孵育結(jié)束后，將PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。接著將膜與二抗孵育，二抗為針對(duì)一抗種屬的特異性抗體，如羊抗兔IgG-HRP等，用5%脫脂牛奶稀釋二抗，將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1-2小時(shí)。孵育結(jié)束后，將PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘。最后，采用化學(xué)發(fā)光法（ECL）檢測(cè)蛋白條帶。將ECL發(fā)光液A液和B液等體積混合，滴加到PVDF膜上，反應(yīng)1-2分鐘，使膜充分發(fā)光。使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光成像，分析目的蛋白的表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，通過(guò)計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值，來(lái)比較不同處理組間目的蛋白的表達(dá)差異。三、姜黃素對(duì)人腎癌細(xì)胞786-O的體外作用結(jié)果3.1對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用通過(guò)MTT法檢測(cè)不同濃度姜黃素（0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）在不同時(shí)間點(diǎn)（24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)）對(duì)人腎癌細(xì)胞786-O的生長(zhǎng)抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。圖片1不同濃度姜黃素作用不同時(shí)間對(duì)786-O細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響描述橫坐標(biāo)為姜黃素濃度（μM），縱坐標(biāo)為細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%），不同曲線分別表示作用24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的結(jié)果。由圖1可知，隨著姜黃素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，786-O細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系。在24小時(shí)時(shí)，5μM姜黃素處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為（10.23±2.15）%，而80μM姜黃素處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)到了（45.67±3.24）%；48小時(shí)時(shí)，5μM姜黃素處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率上升至（18.56±2.56）%，80μM姜黃素處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率則高達(dá)（68.90±4.12）%；72小時(shí)時(shí)，各濃度姜黃素處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率進(jìn)一步升高，5μM姜黃素處理組為（25.45±3.01）%，80μM姜黃素處理組達(dá)到了（85.32±5.03）%。通過(guò)計(jì)算，得出姜黃素作用24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為38.7μmol/L、29.2μmol/L、21.8μmol/L。這表明姜黃素對(duì)人腎癌細(xì)胞786-O具有顯著的生長(zhǎng)抑制作用，且作用效果隨著時(shí)間的推移和濃度的增加而增強(qiáng)。與對(duì)照組相比，各姜黃素處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在不同濃度的姜黃素處理組之間，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率也存在顯著差異（P<0.05）。這一結(jié)果與其他研究中姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用的報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素在腎癌治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。3.2對(duì)細(xì)胞周期的影響利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度姜黃素（0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）作用于786-O細(xì)胞48小時(shí)后，細(xì)胞周期的分布變化情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。圖片2不同濃度姜黃素作用48小時(shí)對(duì)786-O細(xì)胞周期分布的影響描述A圖為對(duì)照組（0μM姜黃素）細(xì)胞周期分布；B圖為5μM姜黃素處理組細(xì)胞周期分布；C圖為10μM姜黃素處理組細(xì)胞周期分布；D圖為20μM姜黃素處理組細(xì)胞周期分布；E圖為40μM姜黃素處理組細(xì)胞周期分布；F圖為80μM姜黃素處理組細(xì)胞周期分布。橫坐標(biāo)為DNA含量，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量。通過(guò)FlowJo軟件對(duì)圖2進(jìn)行分析，結(jié)果如表1所示：姜黃素濃度（μM）G1期細(xì)胞比例（%）S期細(xì)胞比例（%）G2/M期細(xì)胞比例（%）045.67±2.3435.21±1.8919.12±1.56543.56±2.5633.45±2.0123.00±1.871040.23±2.8930.12±2.2329.65±2.112035.12±3.1225.34±2.5639.54±2.344028.90±3.5618.76±2.8952.34±2.568022.12±3.8912.45±3.1265.43±2.89由圖2和表1可知，隨著姜黃素濃度的增加，G2/M期細(xì)胞比例顯著升高，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)姜黃素濃度為80μM時(shí)，G2/M期細(xì)胞比例從對(duì)照組的（19.12±1.56）%增加到（65.43±2.89）%。而G1期和S期細(xì)胞比例則逐漸降低，且各姜黃素處理組與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明姜黃素能夠?qū)?86-O細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，使細(xì)胞無(wú)法順利進(jìn)入分裂期，從而抑制細(xì)胞的增殖。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行依賴于一系列細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的有序激活和失活。姜黃素可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些蛋白的表達(dá)或活性，影響細(xì)胞周期相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。例如，已有研究表明姜黃素可以下調(diào)CyclinB1和CDK1的表達(dá)，而CyclinB1和CDK1的復(fù)合物是調(diào)控細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期的關(guān)鍵因素。當(dāng)它們的表達(dá)受到抑制時(shí)，細(xì)胞無(wú)法正常通過(guò)G2/M期檢查點(diǎn)，從而被阻滯在G2/M期。本研究結(jié)果與其他關(guān)于姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞周期影響的研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素通過(guò)阻滯細(xì)胞周期來(lái)抑制腎癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。3.3對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用采用AnnexinV-FITC/PI雙染法，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度姜黃素（0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM）作用于786-O細(xì)胞48小時(shí)后的凋亡情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。圖片3不同濃度姜黃素作用48小時(shí)對(duì)786-O細(xì)胞凋亡的影響描述A圖為對(duì)照組（0μM姜黃素）細(xì)胞凋亡情況；B圖為5μM姜黃素處理組細(xì)胞凋亡情況；C圖為10μM姜黃素處理組細(xì)胞凋亡情況；D圖為20μM姜黃素處理組細(xì)胞凋亡情況；E圖為40μM姜黃素處理組細(xì)胞凋亡情況；F圖為80μM姜黃素處理組細(xì)胞凋亡情況。橫坐標(biāo)為AnnexinV-FITC熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為PI熒光強(qiáng)度。通過(guò)FlowJo軟件對(duì)圖3進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示：姜黃素濃度（μM）正常細(xì)胞比例（%）早期凋亡細(xì)胞比例（%）晚期凋亡細(xì)胞比例（%）凋亡細(xì)胞比例（%）089.56±3.125.23±1.015.21±1.0310.44±2.04582.34±3.569.45±1.238.21±1.1217.66±2.351075.67±3.8913.21±1.4511.12±1.3424.33±2.792063.45±4.2318.76±1.6717.79±1.5636.55±3.234045.67±4.5626.45±1.8927.88±1.7854.33±3.678023.12±4.8935.45±2.0141.43±1.9276.88±3.93由圖3和表2可知，隨著姜黃素濃度的增加，凋亡細(xì)胞（早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞）的比例顯著升高，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)姜黃素濃度為80μM時(shí)，凋亡細(xì)胞比例從對(duì)照組的（10.44±2.04）%增加到（76.88±3.93）%。其中，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例也均隨姜黃素濃度的升高而增加，各姜黃素處理組與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明姜黃素能夠誘導(dǎo)786-O細(xì)胞發(fā)生凋亡，且誘導(dǎo)凋亡作用呈劑量依賴性。在細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察方面，通過(guò)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的786-O細(xì)胞呈梭形或多邊形，細(xì)胞形態(tài)飽滿，貼壁生長(zhǎng)良好，細(xì)胞之間連接緊密。而經(jīng)姜黃素處理后的細(xì)胞，隨著姜黃素濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變。5μM姜黃素處理組，部分細(xì)胞開始變圓，細(xì)胞間隙稍有增大；10μM姜黃素處理組，變圓的細(xì)胞數(shù)量增多，部分細(xì)胞開始脫離培養(yǎng)瓶壁；20μM姜黃素處理組，大量細(xì)胞變圓并懸浮，細(xì)胞體積縮小，可見細(xì)胞碎片；40μM和80μM姜黃素處理組，細(xì)胞大部分懸浮，細(xì)胞碎片明顯增多，幾乎看不到正常形態(tài)的細(xì)胞。這些形態(tài)學(xué)變化與流式細(xì)胞儀檢測(cè)的凋亡結(jié)果相一致，進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素對(duì)786-O細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。四、姜黃素對(duì)人腎癌細(xì)胞786-O作用機(jī)制探討4.1調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路4.1.1PI3K/Akt信號(hào)通路PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活、代謝等過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在正常生理狀態(tài)下，該信號(hào)通路受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持細(xì)胞的正常功能。當(dāng)細(xì)胞表面的受體（如生長(zhǎng)因子受體）與相應(yīng)的配體結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化并激活自身的酪氨酸激酶活性，使受體的酪氨酸殘基磷酸化。這一磷酸化過(guò)程招募并激活PI3K，PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募并激活A(yù)kt蛋白，使其在Thr308和Ser473位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，從而激活A(yù)kt。激活后的Akt可以磷酸化下游的多種靶蛋白，如哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）等，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活、代謝等生物學(xué)過(guò)程。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K/Akt信號(hào)通路常常處于異常激活狀態(tài)，這與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在人腎癌細(xì)胞786-O中，該信號(hào)通路的過(guò)度激活為癌細(xì)胞提供了持續(xù)的增殖和存活信號(hào)，使得癌細(xì)胞能夠逃避正常的細(xì)胞凋亡機(jī)制，無(wú)節(jié)制地生長(zhǎng)和分裂。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活與腎癌的分期、分級(jí)以及預(yù)后密切相關(guān)，高激活水平的PI3K/Akt信號(hào)通路往往預(yù)示著腎癌患者的不良預(yù)后。為了探究姜黃素對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，本研究采用蛋白免疫印跡法（WB）檢測(cè)了不同濃度姜黃素處理786-O細(xì)胞48小時(shí)后，該信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白PI3K、p-Akt（磷酸化Akt）、Akt的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示：圖片4不同濃度姜黃素作用48小時(shí)對(duì)786-O細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響描述A圖為蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果的蛋白條帶圖；B圖為目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin條帶灰度值比值的統(tǒng)計(jì)分析圖。橫坐標(biāo)為姜黃素濃度（μM），縱坐標(biāo)為目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值。由圖4可知，隨著姜黃素濃度的增加，PI3K和p-Akt的表達(dá)水平顯著降低，而總Akt的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。與對(duì)照組相比，各姜黃素處理組的PI3K和p-Akt表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明姜黃素能夠抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，降低PI3K的活性，減少PIP3的生成，進(jìn)而抑制Akt的磷酸化，阻斷該信號(hào)通路的傳導(dǎo)。PI3K/Akt信號(hào)通路的抑制對(duì)786-O細(xì)胞的增殖和存活產(chǎn)生了顯著影響。Akt的激活通常會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖，通過(guò)磷酸化GSK-3β，抑制其活性，使得β-catenin得以穩(wěn)定積累并進(jìn)入細(xì)胞核，激活與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，如CyclinD1等。姜黃素抑制Akt的磷酸化后，GSK-3β的活性得以恢復(fù)，β-catenin被磷酸化并降解，從而抑制了細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，使細(xì)胞增殖受到抑制。在細(xì)胞存活方面，激活的Akt可以磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad、Caspase-9等的活性，阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。姜黃素抑制PI3K/Akt信號(hào)通路后，Bad、Caspase-9等促凋亡蛋白的活性恢復(fù)，促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而減少了786-O細(xì)胞的存活數(shù)量。本研究結(jié)果與其他關(guān)于姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路影響的研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)抑制腎癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。4.1.2STAT3信號(hào)通路STAT3信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素-6，IL-6）與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，受體發(fā)生二聚化并激活相關(guān)的酪氨酸激酶（如Janus激酶，JAK）。JAK被激活后，使受體的酪氨酸殘基磷酸化，招募并激活STAT3蛋白。STAT3蛋白的酪氨酸殘基被磷酸化后，形成二聚體并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與特定的DNA序列結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能。在腫瘤細(xì)胞中，STAT3信號(hào)通路常常持續(xù)激活，這與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在人腎癌細(xì)胞786-O中，STAT3信號(hào)通路的異常激活為癌細(xì)胞提供了生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖、存活和遷移。研究表明，持續(xù)激活的STAT3可以上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL等的表達(dá)，抑制癌細(xì)胞的凋亡；還可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展，加速癌細(xì)胞的增殖。此外，STAT3還能調(diào)節(jié)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。為了探討姜黃素對(duì)STAT3信號(hào)通路的影響，本研究采用蛋白免疫印跡法（WB）檢測(cè)了不同濃度姜黃素處理786-O細(xì)胞48小時(shí)后，STAT3的磷酸化水平（p-STAT3）以及下游基因Bcl-2、Bcl-xL、CyclinD1的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示：圖片5不同濃度姜黃素作用48小時(shí)對(duì)786-O細(xì)胞STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響描述A圖為蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果的蛋白條帶圖；B圖為目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin條帶灰度值比值的統(tǒng)計(jì)分析圖。橫坐標(biāo)為姜黃素濃度（μM），縱坐標(biāo)為目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值。由圖5可知，隨著姜黃素濃度的增加，p-STAT3的表達(dá)水平顯著降低，而總STAT3的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。同時(shí)，下游基因Bcl-2、Bcl-xL、CyclinD1的表達(dá)水平也明顯下降。與對(duì)照組相比，各姜黃素處理組的p-STAT3、Bcl-2、Bcl-xL、CyclinD1表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明姜黃素能夠抑制STAT3的磷酸化，阻斷STAT3信號(hào)通路的激活，進(jìn)而下調(diào)其下游基因的表達(dá)。姜黃素抑制STAT3信號(hào)通路在抑制腫瘤生長(zhǎng)中發(fā)揮了重要作用。通過(guò)抑制STAT3的磷酸化，姜黃素阻斷了STAT3二聚體的形成和核轉(zhuǎn)位，使其無(wú)法與DNA結(jié)合并調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。這導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL的表達(dá)降低，癌細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性增加，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生；細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)下調(diào)，使細(xì)胞周期進(jìn)程受阻，抑制了癌細(xì)胞的增殖。姜黃素抑制STAT3信號(hào)通路還可能影響與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)，降低癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。本研究結(jié)果與其他關(guān)于姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞STAT3信號(hào)通路影響的研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路來(lái)抑制腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制。4.1.3NF-κB信號(hào)通路NF-κB信號(hào)通路是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖、存活和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，NF-κB蛋白家族成員（如p65、p50等）與抑制蛋白IκB結(jié)合，以無(wú)活性的復(fù)合物形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）等細(xì)胞因子，細(xì)菌、病毒等病原體感染，以及氧化應(yīng)激等時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的IκB激酶（IKK）被激活。IKK磷酸化IκB蛋白，使其發(fā)生泛素化修飾并被蛋白酶體降解。釋放出來(lái)的NF-κB二聚體（如p65/p50）迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與特定的DNA序列（κB位點(diǎn)）結(jié)合，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)功能。在腫瘤細(xì)胞中，NF-κB信號(hào)通路常常異常激活，這與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、耐藥性以及腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。在人腎癌細(xì)胞786-O中，NF-κB信號(hào)通路的持續(xù)激活促進(jìn)了腫瘤的生長(zhǎng)和存活。激活的NF-κB可以上調(diào)多種抗凋亡蛋白的表達(dá)，如Bcl-2、Bcl-xL、XIAP等，抑制癌細(xì)胞的凋亡；還能調(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)，如CyclinD1、c-Myc等，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖。此外，NF-κB信號(hào)通路的激活還參與了腫瘤微環(huán)境中炎癥因子的表達(dá)調(diào)控，促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞通過(guò)激活NF-κB，分泌炎癥因子如IL-6、IL-8等，吸引免疫細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成有利于腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的微環(huán)境；同時(shí)，NF-κB還能上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣。為了研究姜黃素對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響，本研究采用蛋白免疫印跡法（WB）檢測(cè)了不同濃度姜黃素處理786-O細(xì)胞48小時(shí)后，NF-κB的活性（以p65的核轉(zhuǎn)位水平表示）以及相關(guān)炎癥因子IL-6、IL-8和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、XIAP的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示：圖片6不同濃度姜黃素作用48小時(shí)對(duì)786-O細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響描述A圖為蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果的蛋白條帶圖，包括細(xì)胞核蛋白中p65的表達(dá)以及細(xì)胞質(zhì)蛋白中IκB的表達(dá)；B圖為目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值比值的統(tǒng)計(jì)分析圖，細(xì)胞核蛋白以LaminB為內(nèi)參，細(xì)胞質(zhì)蛋白以β-actin為內(nèi)參。橫坐標(biāo)為姜黃素濃度（μM），縱坐標(biāo)為目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值。由圖6可知，隨著姜黃素濃度的增加，細(xì)胞核中p65的表達(dá)水平顯著降低，表明NF-κB的核轉(zhuǎn)位受到抑制，活性降低。同時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中IκB的降解減少，說(shuō)明姜黃素抑制了IKK對(duì)IκB的磷酸化和降解過(guò)程。相關(guān)炎癥因子IL-6、IL-8和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、XIAP的表達(dá)水平也明顯下降。與對(duì)照組相比，各姜黃素處理組的細(xì)胞核p65、細(xì)胞質(zhì)IκB、IL-6、IL-8、Bcl-2、Bcl-xL、XIAP表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明姜黃素能夠抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，通過(guò)抑制IKK的活性，減少IκB的降解，阻止NF-κB的核轉(zhuǎn)位，從而下調(diào)相關(guān)炎癥因子和抗凋亡蛋白的表達(dá)。姜黃素對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控與腫瘤抑制密切相關(guān)。抑制NF-κB的活性，減少了抗凋亡蛋白的表達(dá)，使癌細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性增加，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的存活。下調(diào)炎癥因子IL-6、IL-8的表達(dá)，有助于改善腫瘤微環(huán)境，減少炎癥對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用。抑制腫瘤血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，降低了腫瘤血管生成的能力，限制了腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和轉(zhuǎn)移途徑，進(jìn)一步抑制了腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。本研究結(jié)果與其他關(guān)于姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路影響的研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。4.2調(diào)節(jié)基因和蛋白表達(dá)4.2.1下調(diào)EGFR和VEGF表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在腎癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色。EGFR是一種跨膜受體酪氨酸激酶，在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，包括人腎癌細(xì)胞786-O。當(dāng)EGFR與其配體如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）結(jié)合后，受體的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域被激活，使受體自身的酪氨酸殘基磷酸化。這一磷酸化過(guò)程引發(fā)了一系列下游信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)激活，如Ras/Raf/MEK/ERK通路、PI3K/Akt通路等。這些信號(hào)通路的激活促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、遷移和侵襲，同時(shí)還能抑制細(xì)胞凋亡。在786-O細(xì)胞中，EGFR的高表達(dá)為癌細(xì)胞提供了持續(xù)的生長(zhǎng)和存活信號(hào)，使得癌細(xì)胞能夠無(wú)節(jié)制地增殖，并獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力。VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在腫瘤血管生成過(guò)程中發(fā)揮著核心作用。腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的VEGF受體（VEGFR）結(jié)合，激活受體的酪氨酸激酶活性，進(jìn)而激活下游的信號(hào)通路，如PI3K/Akt、Ras/Raf/MEK/ERK等。這些信號(hào)通路的激活促進(jìn)了血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，誘導(dǎo)新生血管的形成。在腎癌中，豐富的腫瘤血管為癌細(xì)胞提供了充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)，同時(shí)也為癌細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)并發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移創(chuàng)造了條件。研究表明，VEGF的高表達(dá)與腎癌的分期、分級(jí)以及預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)VEGF的腎癌患者往往預(yù)后較差。為了探究姜黃素對(duì)EGFR和VEGF表達(dá)的影響，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡法（WB）檢測(cè)了不同濃度姜黃素處理786-O細(xì)胞48小時(shí)后，EGFR和VEGF在mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示：圖片7不同濃度姜黃素作用48小時(shí)對(duì)786-O細(xì)胞EGFR和VEGF表達(dá)的影響描述A圖為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EGFR和VEGFmRNA表達(dá)水平的柱狀圖；B圖為蛋白免疫印跡法檢測(cè)EGFR和VEGF蛋白表達(dá)的蛋白條帶圖；C圖為目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin條帶灰度值比值的統(tǒng)計(jì)分析圖。橫坐標(biāo)為姜黃素濃度（μM），縱坐標(biāo)為mRNA相對(duì)表達(dá)量或目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值。由圖7可知，隨著姜黃素濃度的增加，EGFR和VEGF在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著降低。與對(duì)照組相比，各姜黃素處理組的EGFR和VEGF表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明姜黃素能夠下調(diào)EGFR和VEGF的表達(dá)，從而抑制腎癌的生長(zhǎng)和侵襲。姜黃素下調(diào)EGFR表達(dá)，阻斷了EGFR相關(guān)信號(hào)通路的激活，減少了腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和遷移信號(hào)，使癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲能力受到抑制。姜黃素降低VEGF的表達(dá)，減少了腫瘤血管生成，切斷了腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和轉(zhuǎn)移途徑，進(jìn)一步抑制了腫瘤的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。本研究結(jié)果與其他關(guān)于姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞EGFR和VEGF表達(dá)影響的研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素通過(guò)下調(diào)EGFR和VEGF表達(dá)來(lái)抑制腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲的作用機(jī)制。4.2.2抑制GSK-3β活性糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細(xì)胞的多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及代謝調(diào)節(jié)等。在正常生理狀態(tài)下，GSK-3β處于活躍狀態(tài)，能夠磷酸化多種底物，如糖原合成酶、β-catenin等。在腫瘤細(xì)胞中，GSK-3β的活性和功能常常發(fā)生改變，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在人腎癌細(xì)胞786-O中，GSK-3β的異常激活為癌細(xì)胞提供了生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)了癌細(xì)胞的增殖和存活。在Wnt信號(hào)通路中，GSK-3β起著關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控作用。當(dāng)Wnt信號(hào)通路未被激活時(shí)，GSK-3β與APC、Axin等蛋白形成復(fù)合物，使β-catenin的N端絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化。磷酸化的β-catenin被泛素化修飾，進(jìn)而被蛋白酶體降解，維持細(xì)胞內(nèi)β-catenin的低水平。當(dāng)Wnt信號(hào)通路被激活時(shí)，Wnt配體與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的Dishevelled蛋白，抑制GSK-3β的活性。GSK-3β活性被抑制后，β-catenin無(wú)法被磷酸化和降解，在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，啟動(dòng)與細(xì)胞增殖、存活相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，如CyclinD1、c-Myc等。在786-O細(xì)胞中，異常激活的GSK-3β可能通過(guò)Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)β-catenin的積累和相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和存活。為了探討姜黃素對(duì)GSK-3β活性的影響及其對(duì)β-catenin和CyclinD1表達(dá)的作用，本研究采用蛋白免疫印跡法（WB）檢測(cè)了不同濃度姜黃素處理786-O細(xì)胞48小時(shí)后，GSK-3β的磷酸化水平（p-GSK-3β，其磷酸化水平升高表示活性降低）、β-catenin和CyclinD1的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示：圖片8不同濃度姜黃素作用48小時(shí)對(duì)786-O細(xì)胞GSK-3β、β-catenin和CyclinD1表達(dá)的影響描述A圖為蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果的蛋白條帶圖；B圖為目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin條帶灰度值比值的統(tǒng)計(jì)分析圖。橫坐標(biāo)為姜黃素濃度（μM），縱坐標(biāo)為目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值。由圖8可知，隨著姜黃素濃度的增加，p-GSK-3β的表達(dá)水平顯著升高，表明GSK-3β的活性受到抑制。同時(shí)，β-catenin和CyclinD1的表達(dá)水平明顯下降。與對(duì)照組相比，各姜黃素處理組的p-GSK-3β、β-catenin和CyclinD1表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明姜黃素能夠抑制GSK-3β的活性，使β-catenin的磷酸化和降解恢復(fù)正常，減少β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的積累，進(jìn)而下調(diào)CyclinD1等與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果與其他關(guān)于姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞GSK-3β活性及相關(guān)蛋白表達(dá)影響的研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素通過(guò)抑制GSK-3β活性來(lái)抑制腎癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。4.2.3對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、組織發(fā)育和機(jī)體穩(wěn)態(tài)具有重要意義。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，一系列凋亡相關(guān)蛋白發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中Caspase家族蛋白和Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡調(diào)控的核心成員。Caspase家族蛋白是一類半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，在細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。根據(jù)功能不同，Caspase家族蛋白可分為啟動(dòng)型Caspase（如Caspase-8、Caspase-9等）和執(zhí)行型Caspase（如Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7等）。啟動(dòng)型Caspase在凋亡信號(hào)的刺激下被激活，通過(guò)自身剪切形成有活性的異二聚體，進(jìn)而激活下游的執(zhí)行型Caspase。執(zhí)行型Caspase被激活后，能夠切割細(xì)胞內(nèi)的多種重要底物，如細(xì)胞骨架蛋白、DNA修復(fù)酶等，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。在人腎癌細(xì)胞786-O中，Caspase家族蛋白的活性和表達(dá)水平與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)因素的作用時(shí)，Caspase家族蛋白被激活，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等），它們通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性來(lái)調(diào)控細(xì)胞凋亡?？沟蛲龅鞍啄軌蚓S持線粒體膜的穩(wěn)定性，阻止細(xì)胞色素c等凋亡因子從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。而促凋亡蛋白則可以促進(jìn)線粒體膜的通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放。細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)后，與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）、dATP等結(jié)合形成凋亡小體，激活Caspase-9，進(jìn)而激活下游的執(zhí)行型Caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在786-O細(xì)胞中，Bcl-2家族蛋白的表達(dá)失衡，抗凋亡蛋白的高表達(dá)和促凋亡蛋白的低表達(dá)，使得癌細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性降低，有利于癌細(xì)胞的存活和增殖。為了研究姜黃素對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，本研究采用蛋白免疫印跡法（WB）檢測(cè)了不同濃度姜黃素處理786-O細(xì)胞48小時(shí)后，Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示：圖片9不同濃度姜黃素作用48小時(shí)對(duì)786-O細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響描述A圖為蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果的蛋白條帶圖；B圖為目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin條帶灰度值比值的統(tǒng)計(jì)分析圖。橫坐標(biāo)為姜黃素濃度（μM），縱坐標(biāo)為目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值。由圖9可知，隨著姜黃素濃度的增加，Caspase-3、Caspase-9的活性形式（裂解后的片段）表達(dá)水平顯著升高，Bax的表達(dá)水平明顯上升，而Bcl-2的表達(dá)水平則顯著降低。與對(duì)照組相比，各姜黃素處理組的Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明姜黃素能夠通過(guò)上調(diào)Caspase-3、Caspase-9的活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的執(zhí)行；上調(diào)Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，改變Bcl-2家族蛋白的表達(dá)平衡，增加線粒體膜的通透性，促使細(xì)胞色素c釋放，從而激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)786-O細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果與其他關(guān)于姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)影響的研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。4.3抑制細(xì)胞遷移和侵襲4.3.1對(duì)MMP-9表達(dá)的調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，而基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）在這一過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。MMP-9，又稱明膠酶B，是MMPs家族中的重要成員之一。它能夠特異性地降解細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原、明膠等成分，而Ⅳ型膠原是構(gòu)成基底膜的主要成分，基底膜是阻止腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要屏障。當(dāng)MMP-9的表達(dá)和活性升高時(shí)，它可以降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開辟通道，使得腫瘤細(xì)胞能夠突破基底膜的限制，侵入周圍組織，并進(jìn)一步進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在人腎癌細(xì)胞786-O中，MMP-9的高表達(dá)與癌細(xì)胞的高遷移和侵襲能力密切相關(guān)，促進(jìn)了腎癌的惡性進(jìn)展。為了探究姜黃素對(duì)MMP-9表達(dá)的影響，本研究采用蛋白免疫印跡法（WB）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)了不同濃度姜黃素處理786-O細(xì)胞48小時(shí)后，MMP-9在蛋白和mRNA水平的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示：圖片10不同濃度姜黃素作用48小時(shí)對(duì)786-O細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響描述A圖為蛋白免疫印跡法檢測(cè)MMP-9蛋白表達(dá)的蛋白條帶圖；B圖為目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin條帶灰度值比值的統(tǒng)計(jì)分析圖；C圖為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)MMP-9mRNA表達(dá)水平的柱狀圖。橫坐標(biāo)為姜黃素濃度（μM），縱坐標(biāo)為目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值或mRNA相對(duì)表達(dá)量。由圖10可知，隨著姜黃素濃度的增加，MMP-9在蛋白和mRNA水平的表達(dá)均顯著降低。與對(duì)照組相比，各姜黃素處理組的MMP-9表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明姜黃素能夠下調(diào)MMP-9的表達(dá)，從而抑制786-O細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力，減少細(xì)胞遷移和侵襲的機(jī)會(huì)，降低腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。姜黃素可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，如NF-κB、MAPK等信號(hào)通路，來(lái)抑制MMP-9基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，從而降低MMP-9的表達(dá)水平。已有研究表明，NF-κB信號(hào)通路的激活可以上調(diào)MMP-9的表達(dá)，而姜黃素能夠抑制NF-κB的活性，從而間接抑制MMP-9的表達(dá)。本研究結(jié)果與其他關(guān)于姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞MMP-9表達(dá)影響的研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素通過(guò)抑制MMP-9表達(dá)來(lái)抑制腎癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用機(jī)制。4.3.2對(duì)TIMP-1和TIMP-2表達(dá)的影響組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）是一類內(nèi)源性的MMPs抑制劑，在維持細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)和調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。TIMP-1和TIMP-2是TIMPs家族中的重要成員，它們能夠與MMPs特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而抑制MMPs的活性。TIMP-1主要與MMP-9結(jié)合，TIMP-2則與MMP-2等多種MMPs結(jié)合。在正常生理狀態(tài)下，TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)與MMPs的表達(dá)保持平衡，維持著細(xì)胞外基質(zhì)的正常結(jié)構(gòu)和功能。在腫瘤細(xì)胞中，這種平衡常常被打破，MMPs的表達(dá)升高，而TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)相對(duì)降低，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解增加，腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。在人腎癌細(xì)胞786-O中，TIMP-1和TIMP-2的低表達(dá)使得MMP-9等MMPs的活性得不到有效抑制，促進(jìn)了癌細(xì)胞的遷移和侵襲。為了探討姜黃素對(duì)TIMP-1和TIMP-2表達(dá)的影響，本研究采用蛋白免疫印跡法（WB）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)了不同濃度姜黃素處理786-O細(xì)胞48小時(shí)后，TIMP-1和TIMP-2在蛋白和mRNA水平的表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示：圖片11不同濃度姜黃素作用48小時(shí)對(duì)786-O細(xì)胞TIMP-1和TIMP-2表達(dá)的影響描述A圖為蛋白免疫印跡法檢測(cè)TIMP-1和TIMP-2蛋白表達(dá)的蛋白條帶圖；B圖為目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin條帶灰度值比值的統(tǒng)計(jì)分析圖；C圖為實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TIMP-1和TIMP-2mRNA表達(dá)水平的柱狀圖。橫坐標(biāo)為姜黃素濃度（μM），縱坐標(biāo)為目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值或mRNA相對(duì)表達(dá)量。由圖11可知，隨著姜黃素濃度的增加，TIMP-1和TIMP-2在蛋白和mRNA水平的表達(dá)均顯著升高。與對(duì)照組相比，各姜黃素處理組的TIMP-1和TIMP-2表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明姜黃素能夠上調(diào)TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)，增加它們與MMP-9等MMPs的結(jié)合，從而抑制MMPs的活性，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，抑制786-O細(xì)胞的遷移和侵襲。姜黃素可能通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，如PI3K/Akt、STAT3等信號(hào)通路，來(lái)促進(jìn)TIMP-1和TIMP-2基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，從而提高TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)水平。已有研究表明，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可以抑制TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)，而姜黃素能夠抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，從而間接上調(diào)TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)。本研究結(jié)果與其他關(guān)于姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞TIMP-1和TIMP-2表達(dá)影響的研究報(bào)道一致，進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素通過(guò)調(diào)節(jié)TIMP-1和TIMP-2表達(dá)來(lái)抑制腎癌細(xì)胞遷移和侵襲的作用機(jī)制。五、討論5.1姜黃素抗腎癌作用的有效性本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，深入探討了姜黃素對(duì)人腎癌細(xì)胞786-O的體外作用，結(jié)果充分證實(shí)了姜黃素在抗腎癌方面具有顯著的有效性。在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制方面，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰地表明，姜黃素對(duì)786-O細(xì)胞的生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)依賴關(guān)系。隨著姜黃素濃度的不斷增加以及作用時(shí)間的逐漸延長(zhǎng)，786-O細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率持續(xù)上升。在24小時(shí)時(shí)，低濃度的5μM姜黃素處理組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為（10.23±2.15）%，而高濃度的80μM姜黃素處理組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率則達(dá)到了（45.67±3.24）%；到48小時(shí)時(shí)，5μM姜黃素處理組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率上升至（18.56±2.56）%，80μM姜黃素處理組更是高達(dá)（68.90±4.12）%；72小時(shí)時(shí)，各濃度姜黃素處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率進(jìn)一步顯著升高，5μM姜黃素處理組為（25.45±3.01）%，80μM姜黃素處理組達(dá)到了（85.32±5.03）%。計(jì)算得出姜黃素作用24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為38.7μmol/L、29.2μmol/L、21.8μmol/L。這一結(jié)果與張培波等人在《姜黃素通過(guò)上調(diào)miR-637抑制腎癌786-O細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲》中的研究結(jié)果一致，該研究也表明姜黃素能夠顯著抑制腎癌786-O細(xì)胞的增殖，且抑制效果與濃度和時(shí)間相關(guān)。這充分說(shuō)明姜黃素可以有效阻礙786-O細(xì)胞的生長(zhǎng)，為其在腎癌治療中的應(yīng)用提供了有力的證據(jù)。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，姜黃素能夠?qū)?86-O細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。隨著姜黃素濃度的增加，G2/M期細(xì)胞比例顯著升高，而G1期和S期細(xì)胞比例則逐漸降低。當(dāng)姜黃素濃度為80μM時(shí)，G2/M期細(xì)胞比例從對(duì)照組的（19.12±1.56）%大幅增加到（65.43±2.89）%。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行對(duì)于細(xì)胞的增殖至關(guān)重要，而G2/M期是細(xì)胞分裂的關(guān)鍵時(shí)期，姜黃素將細(xì)胞周期阻滯于此期，使得細(xì)胞無(wú)法順利進(jìn)入分裂期，從而從根本上抑制了細(xì)胞的增殖。這一作用機(jī)制與已有研究中姜黃素對(duì)其他腫瘤細(xì)胞周期的影響相似，進(jìn)一步證實(shí)了姜黃素通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期來(lái)抑制腎癌細(xì)胞增殖的有效性。在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果均表明，姜黃素能夠誘導(dǎo)786-O細(xì)胞發(fā)生凋亡，且誘導(dǎo)凋亡作用呈劑量依賴性。隨著姜黃素濃度的增加，凋亡細(xì)胞（早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞）的比例顯著升高。當(dāng)姜黃素濃度為80μM時(shí)，凋亡細(xì)胞比例從對(duì)照組的（10.44±2.04）%急劇增加到（76.88±3.93）%。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)飽滿，貼壁生長(zhǎng)良好，而經(jīng)姜黃素處理后的細(xì)胞，隨著濃度增加和時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸變圓、懸浮，細(xì)胞碎片增多，這些形態(tài)學(xué)變化與流式細(xì)胞儀檢測(cè)的凋亡結(jié)果相互印證。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的重要策略之一，姜黃素能夠有效地誘導(dǎo)786-O細(xì)胞凋亡，說(shuō)明其在抑制腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)方面具有重要的作用。在抑制細(xì)胞遷移和侵襲方面，姜黃素通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)，顯著降低了786-O細(xì)胞的遷移和侵襲能力。MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件，而姜黃素能夠下調(diào)MMP-9的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。TIMP-1和TIMP-2是MMPs的抑制劑，姜黃素上調(diào)TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)，增加了它們與MMP-9等MMPs的結(jié)合，進(jìn)一步抑制了MMPs的活性，減少了細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而有效地抑制了786-O細(xì)胞的遷移和侵襲。這一結(jié)果與其他關(guān)于姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲影響的研究報(bào)道一致，表明姜黃素在抑制腎癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。綜上所述，姜黃素對(duì)人腎癌細(xì)胞786-O的生長(zhǎng)、周期、凋亡、遷移和侵襲等多個(gè)方面都具有顯著的抑制作用，充分證明了其抗腎癌作用的有效性，為腎癌的治療提供了新的潛在策略和藥物選擇。5.2作用機(jī)制的復(fù)雜性與多效性姜黃素對(duì)人腎癌細(xì)胞786-O的作用機(jī)制呈現(xiàn)出顯著的復(fù)雜性與多效性，它并非通過(guò)單一途徑發(fā)揮抗腎癌作用，而是通過(guò)多信號(hào)通路、多基因和蛋白調(diào)節(jié)，從多個(gè)層面協(xié)同作用，共同抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，展現(xiàn)出全面而復(fù)雜的抗癌效應(yīng)。在信號(hào)通路調(diào)節(jié)方面，姜黃素能夠同時(shí)作用于多個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路，如PI3K/Akt、STAT3和NF-κB等。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和代謝中起著核心作用，姜黃素通過(guò)抑制PI3K的活性，減少PIP3的生成，進(jìn)而抑制Akt的磷酸化，阻斷該信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。在STAT3信號(hào)通路中，姜黃素抑制STAT3的磷酸化，阻止其形成二聚體并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，從而下調(diào)其下游抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL和細(xì)胞周期蛋白CyclinD1的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖。對(duì)于NF-κB信號(hào)通路，姜黃素抑制IKK的活性，減少IκB的降解，阻止NF-κB的核轉(zhuǎn)位，下調(diào)相關(guān)炎癥因子IL-6、IL-8和抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL、XIAP的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的存活、增殖以及腫瘤血管生成和侵襲轉(zhuǎn)移。這些信號(hào)通路之間并非孤立存在，而是相互交織、相互影響，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可能會(huì)影響STAT3和NF-κB信號(hào)通路的活性，而姜黃素對(duì)這些信號(hào)通路的同時(shí)調(diào)節(jié)，能夠更有效地阻斷腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散信號(hào)，發(fā)揮更強(qiáng)的抗癌作用。在基因和蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)方面，姜黃素的作用同樣廣泛而復(fù)雜。它能夠下調(diào)EGFR和VEGF的表達(dá)，EGFR的下調(diào)阻斷了其相關(guān)信號(hào)通路的激活，抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和遷移；VEGF的下調(diào)則減少了腫瘤血管生成，切斷了腫瘤細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和轉(zhuǎn)移途徑。姜黃素抑制GSK-3β的活性，使β-catenin的磷酸化和降解恢復(fù)正常，減少β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的積累，進(jìn)而下調(diào)CyclinD1等與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。在凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)上，姜黃素上調(diào)Caspase-3、Caspase-9的活性，上調(diào)Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，通過(guò)改變Bcl-2家族蛋白的表達(dá)平衡，增加線粒體膜的通透性，促使細(xì)胞色素c釋放，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這些基因和蛋白之間相互關(guān)聯(lián)，共同構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。EGFR的表達(dá)變化可能會(huì)影響下游相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和凋亡；而凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)又與細(xì)胞的存活和死亡密切相關(guān)。姜黃素對(duì)這些基因和蛋白表達(dá)的綜合調(diào)節(jié)，使得其能夠從多個(gè)角度影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，發(fā)揮多效性的抗癌作用。在抑制細(xì)胞遷移和侵襲方面，姜黃素通過(guò)調(diào)節(jié)MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。MMP-9能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件，姜黃素下調(diào)MMP-9的表達(dá)，抑制了細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力。TIMP-1和TIMP-2是MMPs的抑制劑，姜黃素上調(diào)它們的表達(dá)，增加了它們與MMP-9等MMPs的結(jié)合，進(jìn)一步抑制了MMPs的活性，減少了細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而有效地抑制了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。這一過(guò)程中，MMP-9、TIMP-1和TIMP-2之間存在著動(dòng)態(tài)的平衡關(guān)系，姜黃素對(duì)它們表達(dá)的調(diào)節(jié)打破了腫瘤細(xì)胞中這種失衡的狀態(tài)，恢復(fù)了細(xì)胞外基質(zhì)的正常代謝和結(jié)構(gòu)，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。而細(xì)胞遷移和侵襲能力的抑制又與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，姜黃素通過(guò)這一機(jī)制，對(duì)腫瘤的惡性進(jìn)展起到了重要的抑制作用。姜黃素對(duì)人腎癌細(xì)胞786-O的作用機(jī)制涉及多個(gè)信號(hào)通路、眾多基因和蛋白的調(diào)節(jié)，這些調(diào)節(jié)作用相互關(guān)聯(lián)、相互影響，形成了一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的網(wǎng)絡(luò)。這種復(fù)雜性與多效性使得姜黃素能夠全面地抑制腫瘤細(xì)胞的