細(xì)胞免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)計(jì)劃一、實(shí)驗(yàn)計(jì)劃概述

細(xì)胞免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)體外或體內(nèi)方法研究免疫細(xì)胞的生理功能、相互作用及調(diào)控機(jī)制。本計(jì)劃涵蓋實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、操作步驟、所需材料及預(yù)期結(jié)果，確保實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性、規(guī)范性與可行性。

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1.細(xì)胞樣本：人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）、T淋巴細(xì)胞亞群（CD4+、CD8+）

2.培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基，含10%胎牛血清（FBS）、100IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素

3.免疫熒光試劑：CD3、CD4、CD8抗體（鼠抗人），AlexaFluor標(biāo)記二抗

4.其他：流式細(xì)胞儀、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、無(wú)血清凍存液

（二）實(shí)驗(yàn)環(huán)境

1.操作前需使用75%乙醇對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面及器械進(jìn)行消毒

2.流式細(xì)胞術(shù)需在潔凈生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，避免污染

三、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）細(xì)胞分離與培養(yǎng)

1.PBMC分離：采用Ficoll-Paque梯度離心法分離PBMC，收集界面細(xì)胞

2.細(xì)胞計(jì)數(shù)：使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，調(diào)整至1×10^6/mL

3.培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)24-48小時(shí)

（二）免疫熒光染色

1.固定：收集細(xì)胞，加入4%多聚甲醛固定10分鐘

2.封閉：PBS緩沖液洗滌3次，加入5%山羊血清封閉30分鐘

3.一抗孵育：(1)CD3抗體（1:50稀釋）4℃孵育18小時(shí)(2)CD4抗體（1:50稀釋）4℃孵育18小時(shí)(3)CD8抗體（1:50稀釋）4℃孵育18小時(shí)

4.二抗孵育：PBS洗滌3次后，加入AlexaFluor488/594標(biāo)記的二抗（1:100稀釋），37℃避光孵育1小時(shí)

（三）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

1.設(shè)定門控：根據(jù)前向散射（FSC）和側(cè)向散射（SSC）參數(shù)設(shè)立細(xì)胞門

2.數(shù)據(jù)采集：每個(gè)樣本采集1×10^4個(gè)細(xì)胞，設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次

3.數(shù)據(jù)分析：使用FlowJo軟件分析細(xì)胞亞群比例及熒光強(qiáng)度

四、質(zhì)量控制要點(diǎn)

（一）細(xì)胞活力檢測(cè)

1.使用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力，要求≥95%

（二）抗體特異性驗(yàn)證

1.設(shè)置陰性對(duì)照（未加一抗），確認(rèn)染色特異性

2.使用已知陽(yáng)性樣本驗(yàn)證抗體結(jié)合效果

（三）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性

1.每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置至少3個(gè)技術(shù)重復(fù)

2.數(shù)據(jù)分析時(shí)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示

五、預(yù)期結(jié)果

（一）T細(xì)胞亞群分布

1.預(yù)計(jì)CD4+細(xì)胞占比30%-45%，CD8+細(xì)胞占比20%-30%

2.CD4+/CD8+比值維持在1.5-3.0范圍內(nèi)

（二）免疫熒光結(jié)果

1.CD3陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)98%以上

2.亞群染色符合文獻(xiàn)報(bào)道的熒光強(qiáng)度分布

六、安全注意事項(xiàng)

（一）生物安全

1.操作過(guò)程中全程佩戴手套，避免細(xì)胞交叉污染

2.實(shí)驗(yàn)廢棄物需經(jīng)高壓滅菌后處理

（二）設(shè)備安全

1.流式細(xì)胞儀每日校準(zhǔn)，確保激光參數(shù)穩(wěn)定

2.高壓滅菌鍋使用前檢查壓力表讀數(shù)

七、數(shù)據(jù)記錄與報(bào)告

（一）原始數(shù)據(jù)保存

1.流式數(shù)據(jù)以FCS格式導(dǎo)出，附帶實(shí)驗(yàn)參數(shù)文件

2.細(xì)胞圖像保存為TIFF格式

（二）結(jié)果報(bào)告模板

1.實(shí)驗(yàn)基本信息：樣本編號(hào)、實(shí)驗(yàn)日期、操作人員

2.關(guān)鍵指標(biāo)：細(xì)胞亞群比例、熒光強(qiáng)度分布圖

3.統(tǒng)計(jì)分析：采用t檢驗(yàn)或ANOVA評(píng)估組間差異

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**二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備**

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1.細(xì)胞樣本：

(1)人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）：新鮮采集的外周血需在4小時(shí)內(nèi)處理完畢，或使用淋巴細(xì)胞分離液（如Ficoll-PaquePremium）進(jìn)行密度梯度離心分離。建議采集健康志愿者血液，采血量根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求確定，通常為20-30mL。

(2)T淋巴細(xì)胞亞群（CD4+、CD8+）：分離純化后的PBMC需進(jìn)一步通過(guò)磁珠分選（如CD4+或CD8+Microbeads）或流式細(xì)胞術(shù)陰性depletion方法進(jìn)行亞群富集，純度需達(dá)到95%以上（通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)）。

2.培養(yǎng)基與試劑：

(1)RPMI-1640培養(yǎng)基：需使用無(wú)熱原水溶解，pH調(diào)至7.2-7.4，高壓滅菌（15psi,15分鐘）。

(2)胎牛血清（FBS）：選擇低ендотоксинbatches（<10EU/mL），56℃滅活30分鐘，分裝后-20℃凍存。使用前需通過(guò)0.22μm濾膜除菌。

(3)青霉素/鏈霉素：臨用前溶解于無(wú)菌水，濃度為10000IU/mL和10000μg/mL，分裝后-20℃凍存，使用前稀釋至工作濃度。

(4)細(xì)胞凍存液：無(wú)血清培養(yǎng)基（如RPMI-1640）+10%DMSO（分析級(jí)），混合均勻后分裝。

3.免疫熒光試劑：

(1)抗體：

-CD3-PE/Cy7抗體（鼠抗人）：工作濃度1:50-1:100，需驗(yàn)證其識(shí)別人CD3分子的特異性（通過(guò)與已知CD3陽(yáng)性細(xì)胞共孵育檢測(cè)）。

-CD4-AlexaFluor488抗體（鼠抗人）：工作濃度1:50-1:100，需驗(yàn)證其識(shí)別CD4+T細(xì)胞的特異性。

-CD8-APC抗體（鼠抗人）：工作濃度1:50-1:100，需驗(yàn)證其識(shí)別CD8+T細(xì)胞的特異性。

-同型對(duì)照抗體：鼠抗人IgG2a-PE/Cy7、IgG1-AlexaFluor488、IgG1-APC，工作濃度與對(duì)應(yīng)特異性抗體一致，用于排除非特異性結(jié)合。

(2)二抗：AlexaFluor標(biāo)記的二抗需在使用前通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證其無(wú)染色背景（陰性對(duì)照未加一抗時(shí)，目標(biāo)細(xì)胞區(qū)間的熒光強(qiáng)度應(yīng)低于背景閾值）。

(3)封閉劑：5%山羊血清（來(lái)源于非免疫動(dòng)物），需使用前通過(guò)0.22μm濾膜除菌。

(4)固定液：4%多聚甲醛（分析級(jí)，使用前需用0.1MPBS稀釋至工作濃度）。

(5)褪色劑：0.1%TritonX-100（分析級(jí)，用PBS溶解）。

4.其他：

(1)細(xì)胞計(jì)數(shù)板：改良Neubauer計(jì)數(shù)板，配備油鏡，用于精確計(jì)數(shù)細(xì)胞。

(2)移液器：不同量程的移液器（1mL、5mL、10mL），需定期校準(zhǔn)。

(3)吸頭：不同規(guī)格的滅菌吸頭（0.5mL、1mL、5mL），聚丙烯材質(zhì)優(yōu)先。

(4)培養(yǎng)皿：6孔/24孔塑料培養(yǎng)皿，UV透光材質(zhì)便于流式上樣。

(5)流式細(xì)胞儀：需提前預(yù)熱至少30分鐘，檢查激光功率、電壓及熒光通道是否正常。

（二）實(shí)驗(yàn)環(huán)境

1.操作前準(zhǔn)備：

(1)潔凈工作臺(tái)：使用前用75%乙醇徹底擦拭工作臺(tái)面、天平、離心機(jī)轉(zhuǎn)子等所有接觸表面，靜置30分鐘。

(2)個(gè)人防護(hù)：穿戴潔凈實(shí)驗(yàn)服、手套（一次性）、護(hù)目鏡。

(3)試劑檢查：核對(duì)所有試劑標(biāo)簽、有效期、儲(chǔ)存條件，確保無(wú)污染或變質(zhì)。

2.流式細(xì)胞術(shù)準(zhǔn)備：

(1)試劑配置：提前配置好固定液、封閉液、所有一抗、二抗的稀釋液，分裝于無(wú)菌EP管，標(biāo)記清晰。

(2)采樣管：準(zhǔn)備足夠數(shù)量的流式采樣管（FACSLysingSolution預(yù)處理的管子），每管加入100-200μL細(xì)胞懸液。

(3)設(shè)備參數(shù)：根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)設(shè)置流式細(xì)胞儀的激發(fā)波長(zhǎng)、檢測(cè)通道（如CD3-PE/Cy7設(shè)為1045nm/PE/Cy7）、熒光補(bǔ)償?shù)葏?shù)。

**三、實(shí)驗(yàn)步驟**

（一）細(xì)胞分離與培養(yǎng)

1.PBMC分離：

(1)抗凝：外周血采集后立即加入抗凝管（EDTA抗凝），混勻。

(2)梯度離心：將抗凝血緩慢加至Ficoll-Paque梯度液上層（約5-10mL），2000rpm離心20-30分鐘。

(3)收集界面：用移液器小心吸取PBMC富集層（淡黃色帶），棄去上清和底層紅細(xì)胞。

(4)洗滌：加入PBS（含0.5%FBS）重懸PBMC，1000rpm離心5分鐘。重復(fù)洗滌2次。

(5)收集細(xì)胞：最后一次洗滌后，用含10%FBS的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至所需濃度。

2.細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力檢測(cè)：

(1)計(jì)數(shù)：取少量細(xì)胞懸液滴加至計(jì)數(shù)板，油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞濃度（個(gè)/mL）。

(2)活力：取10μL細(xì)胞懸液與10μL臺(tái)盼藍(lán)混合，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞比例（活力>95%為合格）。

3.培養(yǎng)準(zhǔn)備：

(1)調(diào)整濃度：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求（如流式上樣量、增殖實(shí)驗(yàn)接種密度）調(diào)整細(xì)胞濃度。

(2)分裝：將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)皿（每孔1×10^6-1×10^7cells/mL），加入5mL培養(yǎng)基。

(3)CO2培養(yǎng)：置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼{(diào)整）。

（二）免疫熒光染色

1.細(xì)胞固定：

(1)收集細(xì)胞：從培養(yǎng)皿中吸棄培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的固定液（4%多聚甲醛PBS溶液），冰上孵育10-15分鐘。

(2)PBS洗滌：吸棄固定液，加入PBS洗滌3次，每次5分鐘。

2.細(xì)胞permeabilization（通透）：

(1)加入通透液：加入0.1%TritonX-100（PBS溶液），冰上孵育5-10分鐘。

(2)PBS洗滌：吸棄通透液，加入PBS洗滌3次，每次5分鐘。

3.封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)：

(1)加入封閉液：加入5%山羊血清（PBS溶液），室溫避光孵育30分鐘。

(2)PBS洗滌：吸棄封閉液，加入PBS洗滌3次，每次5分鐘。

4.一抗孵育：

(1)加入一抗：將細(xì)胞重懸于含相應(yīng)濃度一抗（CD3、CD4、CD8及同型對(duì)照抗體）的封閉液/PBS混合溶液中，4℃避光孵育18-24小時(shí)（建議用旋轉(zhuǎn)板孵育提高接觸效率）。

(2)PBS洗滌：吸棄一抗，加入PBS洗滌3次，每次5分鐘。

5.二抗孵育：

(1)加入二抗：將細(xì)胞重懸于含相應(yīng)濃度二抗（AlexaFluor標(biāo)記）的PBS溶液中，室溫避光孵育1小時(shí)。

(2)PBS洗滌：吸棄二抗，加入PBS洗滌3次，每次5分鐘。

6.細(xì)胞染色（可選）：

(1)若需DAPI復(fù)染細(xì)胞核：加入含1μg/mLDAPI（PBS溶液）的染色液，避光孵育5分鐘。

(2)PBS洗滌：吸棄DAPI，加入PBS洗滌1次。

7.保存：

(1)加入預(yù)冷甲醇：加入預(yù)冷甲醇（-20℃保存）固定5分鐘，使熒光更穩(wěn)定。

(2)PBS洗滌：吸棄甲醇，加入PBS洗滌1次。

(3)保存：加入100%甲醇或封片劑（如抗熒光淬滅封片劑）固定保存，-20℃或-80℃凍存。

（三）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

1.細(xì)胞重懸：

(1)吸取固定后的細(xì)胞懸液，用PBS重懸至適合上樣的濃度（通常1×10^6cells/mL）。

(2)加入采樣液：每管加入300-500μL流式采樣液（FACSLysingSolution，如BDFACSLysingSolution），充分混勻。

(3)避光孵育：室溫避光孵育15-30分鐘，使細(xì)胞裂解，釋放細(xì)胞內(nèi)抗原。

2.上樣與設(shè)置：

(1)等待裂解：孵育結(jié)束后，部分細(xì)胞可能形成細(xì)胞團(tuán)塊，可輕輕敲擊管底或用移液器吸打混勻。

(2)上樣：取100-200μL裂解后的細(xì)胞懸液上樣至流式采樣管中。

(3)設(shè)門：根據(jù)FSC/SSC參數(shù)設(shè)置細(xì)胞門（Gatingstrategy），排除細(xì)胞團(tuán)塊、死細(xì)胞（如AnnexinV/PI陰性）及背景熒光。

3.數(shù)據(jù)采集：

(1)激發(fā)設(shè)置：設(shè)置488nm（AlexaFluor488）、561nm（AlexaFluor594）激光通道，調(diào)整相應(yīng)的電壓和PMT。

(2)參數(shù)檢測(cè)：檢測(cè)CD3-PE/Cy7、CD4-AlexaFluor488、CD8-APC信號(hào)，以及對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照抗體信號(hào)?？蛇x檢測(cè)DAPI（細(xì)胞核）。

(3)收集事件：每個(gè)樣本收集至少1×10^4個(gè)細(xì)胞事件，確保統(tǒng)計(jì)量足夠。重復(fù)實(shí)驗(yàn)至少3次。

4.數(shù)據(jù)保存：

(1)文件格式：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)保存為FCS（FlowCytometryStandard）格式，附帶實(shí)驗(yàn)設(shè)置參數(shù)文件（.fcs,.fcsset）。

(2)圖像保存：保存相應(yīng)的散點(diǎn)圖（DotPlot）、直方圖（Histogram）及門控圖（GatingPlot）。

**四、質(zhì)量控制要點(diǎn)**

（一）細(xì)胞活力檢測(cè)

1.臺(tái)盼藍(lán)染色法：

(1)操作規(guī)范：取細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)混合，油鏡下區(qū)分死細(xì)胞（藍(lán)色）和活細(xì)胞（無(wú)色）。

(2)結(jié)果判斷：活細(xì)胞率應(yīng)≥95%為合格，低于90%需重新分離細(xì)胞。

2.AnnexinV/PI雙染（用于評(píng)估細(xì)胞凋亡/壞死）：

(1)染色流程：固定、通透后，加入AnnexinV-FITC和PI染料，避光孵育15分鐘。

(2)流式設(shè)置：檢測(cè)FITC（早期凋亡）、PI（晚期凋亡/壞死），設(shè)置門控區(qū)分壞死細(xì)胞（高PI）、活細(xì)胞（低PI）、早期凋亡（高FITC/低PI）、晚期凋亡（高FITC/高PI）。

（二）抗體特異性驗(yàn)證

1.陰性對(duì)照：

(1)設(shè)置：除目標(biāo)一抗外，其他所有試劑（封閉液、同型對(duì)照抗體等）均加入的對(duì)照孔。

(2)目的：確認(rèn)染色背景，排除非特異性結(jié)合。陰性對(duì)照細(xì)胞應(yīng)無(wú)目標(biāo)抗原陽(yáng)性信號(hào)。

2.陽(yáng)性對(duì)照：

(1)設(shè)置：已知表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞系或富集的陽(yáng)性細(xì)胞群體。

(2)目的：確認(rèn)抗體能識(shí)別目標(biāo)抗原，且熒光信號(hào)強(qiáng)度符合預(yù)期。

3.抗體交叉反應(yīng)檢測(cè)：

(1)設(shè)置：用不同抗體染色同一細(xì)胞群體，檢測(cè)是否存在非特異性信號(hào)。

(2)工具：WesternBlot或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗體是否與其他蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。

（三）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性

1.技術(shù)重復(fù)：

(1)要求：每個(gè)實(shí)驗(yàn)組（如不同細(xì)胞處理?xiàng)l件）至少設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

(2)分析：使用統(tǒng)計(jì)軟件（如GraphPadPrism）計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），評(píng)估實(shí)驗(yàn)重復(fù)性（R2或SD值應(yīng)<10%）。

2.樣本重復(fù)：

(1)要求：若條件允許，應(yīng)增加樣本來(lái)源數(shù)量，或使用不同批次的細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

(2)分析：比較不同樣本間的結(jié)果一致性，評(píng)估批次效應(yīng)。

**五、預(yù)期結(jié)果**

（一）T細(xì)胞亞群分布

1.PBMC初始群體：

(1)散點(diǎn)圖：FSCvsSSC顯示主要細(xì)胞群體（淋巴細(xì)胞），其余為雜質(zhì)（如單核細(xì)胞、粒細(xì)胞）。

(2)直方圖：CD3陽(yáng)性細(xì)胞應(yīng)占PBMC總量的>70%。

2.亞群比例：

(1)散點(diǎn)圖+門控：設(shè)置CD3+gate，分析CD4+和CD8+細(xì)胞在CD3+群體中的比例。

(2)預(yù)期值：CD4+細(xì)胞占比約30%-45%，CD8+細(xì)胞占比約20%-30%，CD4+/CD8+比值約1.5-3.0。

3.異質(zhì)性：

(1)亞群內(nèi)差異：可能存在記憶性T細(xì)胞（如CD45RA+/-）或活化T細(xì)胞（如CD25+表達(dá)）的亞群，需結(jié)合額外標(biāo)記檢測(cè)。

(2)統(tǒng)計(jì)意義：不同細(xì)胞群體（如健康供者vs特定狀態(tài)樣本）間的亞群比例差異需經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)（如ANOVA或t檢驗(yàn)，p<0.05認(rèn)為有顯著差異）。

（二）免疫熒光結(jié)果

1.熒光強(qiáng)度：

(1)對(duì)比：CD3+細(xì)胞應(yīng)顯示顯著PE/Cy7信號(hào)，CD4+細(xì)胞顯示AlexaFluor488信號(hào)，CD8+細(xì)胞顯示APC信號(hào)。

(2)特異性：同型對(duì)照抗體信號(hào)應(yīng)遠(yuǎn)低于特異性抗體信號(hào)（通常降低>95%）。

2.圖像質(zhì)量：

(1)清晰度：細(xì)胞輪廓清晰，熒光信號(hào)分布均勻。

(2)平行性：不同實(shí)驗(yàn)孔的細(xì)胞染色強(qiáng)度應(yīng)保持一致。

**六、安全注意事項(xiàng)**

（一）生物安全

1.個(gè)人防護(hù)：

(1)必須穿戴實(shí)驗(yàn)服、手套、護(hù)目鏡。處理有毒試劑（如甲醛、DMSO）時(shí)需佩戴耐化學(xué)品的防護(hù)手套。

(2)避免皮膚直接接觸細(xì)胞因子、固定液等。

2.操作規(guī)范：

(1)所有操作應(yīng)在潔凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，防止氣溶膠傳播。

(2)吸管尖端不應(yīng)伸出移液器頭，避免回吸污染。

3.廢棄物處理：

(1)細(xì)胞培養(yǎng)廢棄物需高壓滅菌后按醫(yī)療廢物處理。

(2)試劑空瓶、吸頭等銳器需放入專用銳器盒。

4.感染控制：

(1)使用一次性移液器吸頭，避免交叉污染。

(2)定期清潔工作臺(tái)面和設(shè)備表面。

（二）化學(xué)品安全

1.試劑危害：

(1)固定液（甲醛）：高刺激性，需在通風(fēng)櫥中操作，避免吸入蒸氣。

(2)通透液（TritonX-100）：易燃，避免接觸眼睛和皮膚。

(3)凍存液（DMSO）：刺激性強(qiáng)，操作時(shí)佩戴手套。

2.安全措施：

(1)所有化學(xué)品需儲(chǔ)存在指定位置，標(biāo)簽清晰。

(2)備有洗眼器、緊急噴淋裝置，并確保其功能正常。

(3)讀取化學(xué)品安全數(shù)據(jù)表（SDS），了解危害及防護(hù)措施。

（三）設(shè)備安全

1.流式細(xì)胞儀：

(1)定期檢查激光管老化情況，避免過(guò)熱或損壞。

(2)清潔流式池和光學(xué)元件，確保檢測(cè)準(zhǔn)確性。

2.離心機(jī)：

(1)使用前檢查轉(zhuǎn)子是否匹配，離心管是否合規(guī)。

(2)高速離心后需等待轉(zhuǎn)子完全停止再開(kāi)蓋。

**七、數(shù)據(jù)記錄與報(bào)告**

（一）原始數(shù)據(jù)保存

1.流式數(shù)據(jù)：

(1)格式：所有FCS文件需包含完整的實(shí)驗(yàn)元數(shù)據(jù)（實(shí)驗(yàn)日期、樣本ID、儀器參數(shù)、抗體信息等）。

(2)存儲(chǔ)：數(shù)據(jù)保存于專用云盤或服務(wù)器，定期備份。

2.圖像數(shù)據(jù)：

(1)格式：散點(diǎn)圖、直方圖等保存為TIFF或PDF格式，分辨率≥300DPI。

(2)標(biāo)注：圖像需包含實(shí)驗(yàn)組別、日期、處理?xiàng)l件等關(guān)鍵信息。

3.計(jì)算機(jī)記錄：

(1)實(shí)驗(yàn)日志：詳細(xì)記錄每日操作步驟、試劑批號(hào)、人員、觀察結(jié)果等。

(2)電子版：所有記錄需存檔至少2年。

（二）結(jié)果報(bào)告模板

1.標(biāo)題：實(shí)驗(yàn)名稱、日期、報(bào)告人。

2.摘要：簡(jiǎn)要說(shuō)明實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、方法、主要發(fā)現(xiàn)和結(jié)論。

3.實(shí)驗(yàn)方法：

(1)細(xì)胞分離：詳細(xì)描述分離方法、試劑和參數(shù)。

(2)染色流程：列出所有試劑、濃度、孵育時(shí)間和條件。

(3)流式設(shè)置：記錄激光、檢測(cè)通道、電壓等關(guān)鍵參數(shù)。

4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

(1)圖表：附上代表性散點(diǎn)圖、直方圖、門控圖，并標(biāo)注關(guān)鍵區(qū)域（如亞群比例）。

(2)數(shù)據(jù)：列出主要實(shí)驗(yàn)指標(biāo)（如亞群百分比、熒光強(qiáng)度均值±SD）。

(3)統(tǒng)計(jì)分析：描述使用的統(tǒng)計(jì)方法及結(jié)果（p值等）。

5.討論：

(1)結(jié)果解釋：分析數(shù)據(jù)背后的生物學(xué)意義。

(2)誤差分析：討論可能影響結(jié)果的因素（如細(xì)胞活力、抗體特異性）。

6.結(jié)論：總結(jié)實(shí)驗(yàn)的主要發(fā)現(xiàn)及其潛在應(yīng)用價(jià)值。

7.附件：

(1)原始數(shù)據(jù)：關(guān)鍵FCS文件和圖像。

(2)SDS文件：所用試劑的安全數(shù)據(jù)表。

一、實(shí)驗(yàn)計(jì)劃概述

細(xì)胞免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)體外或體內(nèi)方法研究免疫細(xì)胞的生理功能、相互作用及調(diào)控機(jī)制。本計(jì)劃涵蓋實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、操作步驟、所需材料及預(yù)期結(jié)果，確保實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性、規(guī)范性與可行性。

二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1.細(xì)胞樣本：人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）、T淋巴細(xì)胞亞群（CD4+、CD8+）

2.培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基，含10%胎牛血清（FBS）、100IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素

3.免疫熒光試劑：CD3、CD4、CD8抗體（鼠抗人），AlexaFluor標(biāo)記二抗

4.其他：流式細(xì)胞儀、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、無(wú)血清凍存液

（二）實(shí)驗(yàn)環(huán)境

1.操作前需使用75%乙醇對(duì)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面及器械進(jìn)行消毒

2.流式細(xì)胞術(shù)需在潔凈生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，避免污染

三、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）細(xì)胞分離與培養(yǎng)

1.PBMC分離：采用Ficoll-Paque梯度離心法分離PBMC，收集界面細(xì)胞

2.細(xì)胞計(jì)數(shù)：使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，調(diào)整至1×10^6/mL

3.培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)24-48小時(shí)

（二）免疫熒光染色

1.固定：收集細(xì)胞，加入4%多聚甲醛固定10分鐘

2.封閉：PBS緩沖液洗滌3次，加入5%山羊血清封閉30分鐘

3.一抗孵育：(1)CD3抗體（1:50稀釋）4℃孵育18小時(shí)(2)CD4抗體（1:50稀釋）4℃孵育18小時(shí)(3)CD8抗體（1:50稀釋）4℃孵育18小時(shí)

4.二抗孵育：PBS洗滌3次后，加入AlexaFluor488/594標(biāo)記的二抗（1:100稀釋），37℃避光孵育1小時(shí)

（三）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

1.設(shè)定門控：根據(jù)前向散射（FSC）和側(cè)向散射（SSC）參數(shù)設(shè)立細(xì)胞門

2.數(shù)據(jù)采集：每個(gè)樣本采集1×10^4個(gè)細(xì)胞，設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次

3.數(shù)據(jù)分析：使用FlowJo軟件分析細(xì)胞亞群比例及熒光強(qiáng)度

四、質(zhì)量控制要點(diǎn)

（一）細(xì)胞活力檢測(cè)

1.使用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞活力，要求≥95%

（二）抗體特異性驗(yàn)證

1.設(shè)置陰性對(duì)照（未加一抗），確認(rèn)染色特異性

2.使用已知陽(yáng)性樣本驗(yàn)證抗體結(jié)合效果

（三）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性

1.每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置至少3個(gè)技術(shù)重復(fù)

2.數(shù)據(jù)分析時(shí)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示

五、預(yù)期結(jié)果

（一）T細(xì)胞亞群分布

1.預(yù)計(jì)CD4+細(xì)胞占比30%-45%，CD8+細(xì)胞占比20%-30%

2.CD4+/CD8+比值維持在1.5-3.0范圍內(nèi)

（二）免疫熒光結(jié)果

1.CD3陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)98%以上

2.亞群染色符合文獻(xiàn)報(bào)道的熒光強(qiáng)度分布

六、安全注意事項(xiàng)

（一）生物安全

1.操作過(guò)程中全程佩戴手套，避免細(xì)胞交叉污染

2.實(shí)驗(yàn)廢棄物需經(jīng)高壓滅菌后處理

（二）設(shè)備安全

1.流式細(xì)胞儀每日校準(zhǔn)，確保激光參數(shù)穩(wěn)定

2.高壓滅菌鍋使用前檢查壓力表讀數(shù)

七、數(shù)據(jù)記錄與報(bào)告

（一）原始數(shù)據(jù)保存

1.流式數(shù)據(jù)以FCS格式導(dǎo)出，附帶實(shí)驗(yàn)參數(shù)文件

2.細(xì)胞圖像保存為TIFF格式

（二）結(jié)果報(bào)告模板

1.實(shí)驗(yàn)基本信息：樣本編號(hào)、實(shí)驗(yàn)日期、操作人員

2.關(guān)鍵指標(biāo)：細(xì)胞亞群比例、熒光強(qiáng)度分布圖

3.統(tǒng)計(jì)分析：采用t檢驗(yàn)或ANOVA評(píng)估組間差異

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**二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備**

（一）實(shí)驗(yàn)材料

1.細(xì)胞樣本：

(1)人外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）：新鮮采集的外周血需在4小時(shí)內(nèi)處理完畢，或使用淋巴細(xì)胞分離液（如Ficoll-PaquePremium）進(jìn)行密度梯度離心分離。建議采集健康志愿者血液，采血量根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求確定，通常為20-30mL。

(2)T淋巴細(xì)胞亞群（CD4+、CD8+）：分離純化后的PBMC需進(jìn)一步通過(guò)磁珠分選（如CD4+或CD8+Microbeads）或流式細(xì)胞術(shù)陰性depletion方法進(jìn)行亞群富集，純度需達(dá)到95%以上（通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)）。

2.培養(yǎng)基與試劑：

(1)RPMI-1640培養(yǎng)基：需使用無(wú)熱原水溶解，pH調(diào)至7.2-7.4，高壓滅菌（15psi,15分鐘）。

(2)胎牛血清（FBS）：選擇低ендотоксинbatches（<10EU/mL），56℃滅活30分鐘，分裝后-20℃凍存。使用前需通過(guò)0.22μm濾膜除菌。

(3)青霉素/鏈霉素：臨用前溶解于無(wú)菌水，濃度為10000IU/mL和10000μg/mL，分裝后-20℃凍存，使用前稀釋至工作濃度。

(4)細(xì)胞凍存液：無(wú)血清培養(yǎng)基（如RPMI-1640）+10%DMSO（分析級(jí)），混合均勻后分裝。

3.免疫熒光試劑：

(1)抗體：

-CD3-PE/Cy7抗體（鼠抗人）：工作濃度1:50-1:100，需驗(yàn)證其識(shí)別人CD3分子的特異性（通過(guò)與已知CD3陽(yáng)性細(xì)胞共孵育檢測(cè)）。

-CD4-AlexaFluor488抗體（鼠抗人）：工作濃度1:50-1:100，需驗(yàn)證其識(shí)別CD4+T細(xì)胞的特異性。

-CD8-APC抗體（鼠抗人）：工作濃度1:50-1:100，需驗(yàn)證其識(shí)別CD8+T細(xì)胞的特異性。

-同型對(duì)照抗體：鼠抗人IgG2a-PE/Cy7、IgG1-AlexaFluor488、IgG1-APC，工作濃度與對(duì)應(yīng)特異性抗體一致，用于排除非特異性結(jié)合。

(2)二抗：AlexaFluor標(biāo)記的二抗需在使用前通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證其無(wú)染色背景（陰性對(duì)照未加一抗時(shí)，目標(biāo)細(xì)胞區(qū)間的熒光強(qiáng)度應(yīng)低于背景閾值）。

(3)封閉劑：5%山羊血清（來(lái)源于非免疫動(dòng)物），需使用前通過(guò)0.22μm濾膜除菌。

(4)固定液：4%多聚甲醛（分析級(jí)，使用前需用0.1MPBS稀釋至工作濃度）。

(5)褪色劑：0.1%TritonX-100（分析級(jí)，用PBS溶解）。

4.其他：

(1)細(xì)胞計(jì)數(shù)板：改良Neubauer計(jì)數(shù)板，配備油鏡，用于精確計(jì)數(shù)細(xì)胞。

(2)移液器：不同量程的移液器（1mL、5mL、10mL），需定期校準(zhǔn)。

(3)吸頭：不同規(guī)格的滅菌吸頭（0.5mL、1mL、5mL），聚丙烯材質(zhì)優(yōu)先。

(4)培養(yǎng)皿：6孔/24孔塑料培養(yǎng)皿，UV透光材質(zhì)便于流式上樣。

(5)流式細(xì)胞儀：需提前預(yù)熱至少30分鐘，檢查激光功率、電壓及熒光通道是否正常。

（二）實(shí)驗(yàn)環(huán)境

1.操作前準(zhǔn)備：

(1)潔凈工作臺(tái)：使用前用75%乙醇徹底擦拭工作臺(tái)面、天平、離心機(jī)轉(zhuǎn)子等所有接觸表面，靜置30分鐘。

(2)個(gè)人防護(hù)：穿戴潔凈實(shí)驗(yàn)服、手套（一次性）、護(hù)目鏡。

(3)試劑檢查：核對(duì)所有試劑標(biāo)簽、有效期、儲(chǔ)存條件，確保無(wú)污染或變質(zhì)。

2.流式細(xì)胞術(shù)準(zhǔn)備：

(1)試劑配置：提前配置好固定液、封閉液、所有一抗、二抗的稀釋液，分裝于無(wú)菌EP管，標(biāo)記清晰。

(2)采樣管：準(zhǔn)備足夠數(shù)量的流式采樣管（FACSLysingSolution預(yù)處理的管子），每管加入100-200μL細(xì)胞懸液。

(3)設(shè)備參數(shù)：根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)設(shè)置流式細(xì)胞儀的激發(fā)波長(zhǎng)、檢測(cè)通道（如CD3-PE/Cy7設(shè)為1045nm/PE/Cy7）、熒光補(bǔ)償?shù)葏?shù)。

**三、實(shí)驗(yàn)步驟**

（一）細(xì)胞分離與培養(yǎng)

1.PBMC分離：

(1)抗凝：外周血采集后立即加入抗凝管（EDTA抗凝），混勻。

(2)梯度離心：將抗凝血緩慢加至Ficoll-Paque梯度液上層（約5-10mL），2000rpm離心20-30分鐘。

(3)收集界面：用移液器小心吸取PBMC富集層（淡黃色帶），棄去上清和底層紅細(xì)胞。

(4)洗滌：加入PBS（含0.5%FBS）重懸PBMC，1000rpm離心5分鐘。重復(fù)洗滌2次。

(5)收集細(xì)胞：最后一次洗滌后，用含10%FBS的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至所需濃度。

2.細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力檢測(cè)：

(1)計(jì)數(shù)：取少量細(xì)胞懸液滴加至計(jì)數(shù)板，油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞濃度（個(gè)/mL）。

(2)活力：取10μL細(xì)胞懸液與10μL臺(tái)盼藍(lán)混合，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞比例（活力>95%為合格）。

3.培養(yǎng)準(zhǔn)備：

(1)調(diào)整濃度：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求（如流式上樣量、增殖實(shí)驗(yàn)接種密度）調(diào)整細(xì)胞濃度。

(2)分裝：將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)皿（每孔1×10^6-1×10^7cells/mL），加入5mL培養(yǎng)基。

(3)CO2培養(yǎng)：置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時(shí)（根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼{(diào)整）。

（二）免疫熒光染色

1.細(xì)胞固定：

(1)收集細(xì)胞：從培養(yǎng)皿中吸棄培養(yǎng)基，加入預(yù)冷的固定液（4%多聚甲醛PBS溶液），冰上孵育10-15分鐘。

(2)PBS洗滌：吸棄固定液，加入PBS洗滌3次，每次5分鐘。

2.細(xì)胞permeabilization（通透）：

(1)加入通透液：加入0.1%TritonX-100（PBS溶液），冰上孵育5-10分鐘。

(2)PBS洗滌：吸棄通透液，加入PBS洗滌3次，每次5分鐘。

3.封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)：

(1)加入封閉液：加入5%山羊血清（PBS溶液），室溫避光孵育30分鐘。

(2)PBS洗滌：吸棄封閉液，加入PBS洗滌3次，每次5分鐘。

4.一抗孵育：

(1)加入一抗：將細(xì)胞重懸于含相應(yīng)濃度一抗（CD3、CD4、CD8及同型對(duì)照抗體）的封閉液/PBS混合溶液中，4℃避光孵育18-24小時(shí)（建議用旋轉(zhuǎn)板孵育提高接觸效率）。

(2)PBS洗滌：吸棄一抗，加入PBS洗滌3次，每次5分鐘。

5.二抗孵育：

(1)加入二抗：將細(xì)胞重懸于含相應(yīng)濃度二抗（AlexaFluor標(biāo)記）的PBS溶液中，室溫避光孵育1小時(shí)。

(2)PBS洗滌：吸棄二抗，加入PBS洗滌3次，每次5分鐘。

6.細(xì)胞染色（可選）：

(1)若需DAPI復(fù)染細(xì)胞核：加入含1μg/mLDAPI（PBS溶液）的染色液，避光孵育5分鐘。

(2)PBS洗滌：吸棄DAPI，加入PBS洗滌1次。

7.保存：

(1)加入預(yù)冷甲醇：加入預(yù)冷甲醇（-20℃保存）固定5分鐘，使熒光更穩(wěn)定。

(2)PBS洗滌：吸棄甲醇，加入PBS洗滌1次。

(3)保存：加入100%甲醇或封片劑（如抗熒光淬滅封片劑）固定保存，-20℃或-80℃凍存。

（三）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

1.細(xì)胞重懸：

(1)吸取固定后的細(xì)胞懸液，用PBS重懸至適合上樣的濃度（通常1×10^6cells/mL）。

(2)加入采樣液：每管加入300-500μL流式采樣液（FACSLysingSolution，如BDFACSLysingSolution），充分混勻。

(3)避光孵育：室溫避光孵育15-30分鐘，使細(xì)胞裂解，釋放細(xì)胞內(nèi)抗原。

2.上樣與設(shè)置：

(1)等待裂解：孵育結(jié)束后，部分細(xì)胞可能形成細(xì)胞團(tuán)塊，可輕輕敲擊管底或用移液器吸打混勻。

(2)上樣：取100-200μL裂解后的細(xì)胞懸液上樣至流式采樣管中。

(3)設(shè)門：根據(jù)FSC/SSC參數(shù)設(shè)置細(xì)胞門（Gatingstrategy），排除細(xì)胞團(tuán)塊、死細(xì)胞（如AnnexinV/PI陰性）及背景熒光。

3.數(shù)據(jù)采集：

(1)激發(fā)設(shè)置：設(shè)置488nm（AlexaFluor488）、561nm（AlexaFluor594）激光通道，調(diào)整相應(yīng)的電壓和PMT。

(2)參數(shù)檢測(cè)：檢測(cè)CD3-PE/Cy7、CD4-AlexaFluor488、CD8-APC信號(hào)，以及對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照抗體信號(hào)?？蛇x檢測(cè)DAPI（細(xì)胞核）。

(3)收集事件：每個(gè)樣本收集至少1×10^4個(gè)細(xì)胞事件，確保統(tǒng)計(jì)量足夠。重復(fù)實(shí)驗(yàn)至少3次。

4.數(shù)據(jù)保存：

(1)文件格式：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)保存為FCS（FlowCytometryStandard）格式，附帶實(shí)驗(yàn)設(shè)置參數(shù)文件（.fcs,.fcsset）。

(2)圖像保存：保存相應(yīng)的散點(diǎn)圖（DotPlot）、直方圖（Histogram）及門控圖（GatingPlot）。

**四、質(zhì)量控制要點(diǎn)**

（一）細(xì)胞活力檢測(cè)

1.臺(tái)盼藍(lán)染色法：

(1)操作規(guī)范：取細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)混合，油鏡下區(qū)分死細(xì)胞（藍(lán)色）和活細(xì)胞（無(wú)色）。

(2)結(jié)果判斷：活細(xì)胞率應(yīng)≥95%為合格，低于90%需重新分離細(xì)胞。

2.AnnexinV/PI雙染（用于評(píng)估細(xì)胞凋亡/壞死）：

(1)染色流程：固定、通透后，加入AnnexinV-FITC和PI染料，避光孵育15分鐘。

(2)流式設(shè)置：檢測(cè)FITC（早期凋亡）、PI（晚期凋亡/壞死），設(shè)置門控區(qū)分壞死細(xì)胞（高PI）、活細(xì)胞（低PI）、早期凋亡（高FITC/低PI）、晚期凋亡（高FITC/高PI）。

（二）抗體特異性驗(yàn)證

1.陰性對(duì)照：

(1)設(shè)置：除目標(biāo)一抗外，其他所有試劑（封閉液、同型對(duì)照抗體等）均加入的對(duì)照孔。

(2)目的：確認(rèn)染色背景，排除非特異性結(jié)合。陰性對(duì)照細(xì)胞應(yīng)無(wú)目標(biāo)抗原陽(yáng)性信號(hào)。

2.陽(yáng)性對(duì)照：

(1)設(shè)置：已知表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞系或富集的陽(yáng)性細(xì)胞群體。

(2)目的：確認(rèn)抗體能識(shí)別目標(biāo)抗原，且熒光信號(hào)強(qiáng)度符合預(yù)期。

3.抗體交叉反應(yīng)檢測(cè)：

(1)設(shè)置：用不同抗體染色同一細(xì)胞群體，檢測(cè)是否存在非特異性信號(hào)。

(2)工具：WesternBlot或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)抗體是否與其他蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。

（三）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性

1.技術(shù)重復(fù)：

(1)要求：每個(gè)實(shí)驗(yàn)組（如不同細(xì)胞處理?xiàng)l件）至少設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

(2)分析：使用統(tǒng)計(jì)軟件（如GraphPadPrism）計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），評(píng)估實(shí)驗(yàn)重復(fù)性（R2或SD值應(yīng)<10%）。

2.樣本重復(fù)：

(1)要求：若條件允許，應(yīng)增加樣本來(lái)源數(shù)量，或使用不同批次的細(xì)胞進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

(2)分析：比較不同樣本間的結(jié)果一致性，評(píng)估批次效應(yīng)。

**五、預(yù)期結(jié)果**

（一）T細(xì)胞亞群分布

1.PBMC初始群體：

(1)散點(diǎn)圖：FSCvsSSC顯示主要細(xì)胞群體（淋巴細(xì)胞），其余為雜質(zhì)（如單核細(xì)胞、粒細(xì)胞）。

(2)直方圖：CD3陽(yáng)性細(xì)胞應(yīng)占PBMC總量的>70%。

2.亞群比例：

(1)散點(diǎn)圖+門控：設(shè)置CD3+gate，分析CD4+和CD8+細(xì)胞在CD3+群體中的比例。

(2)預(yù)期值：CD4+細(xì)胞占比約30%-45%，CD8+細(xì)胞占比約20%-30%，CD4+/CD8+比值約1.5-3.0。

3.異質(zhì)性：

(1)亞群內(nèi)差異：可能存在記憶性T細(xì)胞（如CD45RA+/-）或活化T細(xì)胞（如CD25+表達(dá)）的亞群，需結(jié)合額外標(biāo)記檢測(cè)。

(2)統(tǒng)計(jì)意義：不同細(xì)胞群體（如健康供者vs特定狀