第61課時(shí)基因工程的基本工具和基本操作程序1.概述基因工程是在微生物學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等學(xué)科基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。2.闡明重組DNA技術(shù)的三種基本工具。3.闡明基因工程的基本操作程序。課標(biāo)要求考情分析1.基因工程的基本工具2023·新課標(biāo)·T6

2021·全國(guó)乙·T38

2021·湖北·T72.基因工程的基本操作程序2023·全國(guó)乙·T38

2023·全國(guó)甲·T38

2023·湖北·T4

2023·廣東·T202021·廣東·T22內(nèi)容索引考點(diǎn)一基因工程的基本工具考點(diǎn)二

基因工程的基本操作程序課時(shí)精練考點(diǎn)一基因工程的基本工具1.基因工程的概念DNA分子轉(zhuǎn)基因遺傳特性生物類型基因重組2.基因工程的誕生和發(fā)展(1)肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不僅證明了DNA是遺傳物質(zhì)，還證明了DNA可在同種生物不同個(gè)體之間

。(2)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出和

的證明。(3)中心法則的確立。(4)

的破譯。轉(zhuǎn)移半保留復(fù)制遺傳密碼(5)基因轉(zhuǎn)移載體的發(fā)現(xiàn)。

的發(fā)現(xiàn)為DNA的切割、連接以及功能基因的獲得創(chuàng)造了條件。(6)

體外重組的實(shí)現(xiàn)。(7)重組DNA表達(dá)實(shí)驗(yàn)的成功。(8)DNA測(cè)序和合成技術(shù)的發(fā)明。(9)

技術(shù)的發(fā)明。(10)

技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因的定點(diǎn)插入、敲除或替換。限制酶、DNA連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶DNAPCR基因組編輯3.重組DNA技術(shù)的基本工具(1)限制性內(nèi)切核酸酶(簡(jiǎn)稱“限制酶”)原核生物數(shù)千特定核苷酸序列磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵提醒

①限制酶的識(shí)別序列一般由6個(gè)核苷酸組成，少數(shù)由4個(gè)、8個(gè)或其他數(shù)量的核苷酸組成。②限制酶作用的化學(xué)鍵只能是磷酸二酯鍵。③在切割含目的基因的DNA分子時(shí)，需用限制酶切割兩次此DNA分子，產(chǎn)生4個(gè)末端。只有這樣才能使目的基因的兩端都有可連接的黏性末端或平末端。(2)DNA連接酶磷酸二酯鍵大腸桿菌黏性末端黏性末端(3)載體環(huán)狀雙鏈DNA分子噬菌體有一個(gè)至多個(gè)自我復(fù)制受體DNA標(biāo)記(1)基因工程是人工操作導(dǎo)致的染色體變異，變異是不定向的(

)提示基因工程是人工操作導(dǎo)致的基因重組，變異是定向的?！?2)DNA連接酶可以連接目的基因與載體的氫鍵，形成重組DNA(

)提示DNA連接酶可以將雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的磷酸二酯鍵?！?3)限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具酶(

)提示限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和質(zhì)粒是基因工程中常用的三種工具，前兩者屬于工具酶，質(zhì)粒屬于載體?！?4)質(zhì)粒通常采用抗生素合成基因作為標(biāo)記基因(

)提示質(zhì)粒上的抗生素抗性基因常作為標(biāo)記基因，便于重組DNA分子的篩選?！翆奶K云金桿菌中獲取的Bt基因轉(zhuǎn)入棉花細(xì)胞內(nèi)培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的過程中，需借助多種分子工具且經(jīng)歷多個(gè)操作步驟。實(shí)驗(yàn)人員使用限制酶EcoRⅠ和Nhe

Ⅰ切割質(zhì)粒。如圖表示常用的限制酶識(shí)別序列和切割位點(diǎn)以及質(zhì)粒上的限制酶切割位點(diǎn)。請(qǐng)思考以下問題：(1)請(qǐng)用圖示法寫出限制酶EcoRⅠ和Nhe

Ⅰ切割后形成黏性末端的過程。提示限制酶EcoRⅠ：限制酶Nhe

Ⅰ：(2)切割圖示中的目的基因應(yīng)選用哪類限制酶？請(qǐng)說明理由。提示用限制酶Mun

Ⅰ和Spe

Ⅰ切割目的基因。限制酶Mun

Ⅰ和EcoRⅠ切割后形成的黏性末端相同，限制酶Nhe

Ⅰ和Spe

Ⅰ切割后形成的黏性末端相同，實(shí)驗(yàn)人員使用限制酶EcoRⅠ和Nhe

Ⅰ切割質(zhì)粒，應(yīng)選用Mun

Ⅰ和Spe

Ⅰ切割目的基因。限制酶的選擇(1)不破壞目的基因原則：如圖甲中可選擇PstⅠ，而不選擇SmaⅠ。(2)保留標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子、復(fù)制原點(diǎn)原則：質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因，所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu)，如圖乙中不選擇SmaⅠ。若載體上有兩個(gè)及以上的標(biāo)記基因，則可合理對(duì)其中一些標(biāo)記基因進(jìn)行酶切破壞，從而達(dá)到比一個(gè)標(biāo)記基因更高的篩選成功率，防止只有一個(gè)標(biāo)記基因時(shí)出現(xiàn)的“假陽性”(即未成功導(dǎo)入目的基因的載體也能正常表達(dá)標(biāo)記基因，造成無效篩選)。(3)善用“雙酶切”，注意方向性：目的基因所在序列和載體上存在多種酶切位點(diǎn)時(shí)，一般需要選擇在目的基因所在序列和載體上都存在切割位點(diǎn)的兩種不同的限制酶，對(duì)目的基因所在序列和載體進(jìn)行剪切，即“雙酶切法”。其優(yōu)點(diǎn)和作用是：①防止目的基因環(huán)化；②避免目的基因與載體反向連接，即用DNA連接酶連接后形成的重組DNA分子上，目的基因和載體啟動(dòng)子的方向(或描述為“RNA聚合酶的某著名企業(yè)方向”)必須是相同的，否則目的基因?qū)牒鬅o法正常表達(dá)。如圖甲、乙也可選擇Pst

Ⅰ和EcoR

Ⅰ兩種限制酶。(4)巧用“同尾酶”：同尾酶指來源不同，但能產(chǎn)生相同黏性末端的限制酶。當(dāng)不適合選擇某種限制酶時(shí)，可用其同尾酶替換，以獲得相同的黏性末端?？枷蛞槐嫖龌蚬こ痰幕竟ぞ?.限制性內(nèi)切核酸酶HindⅢ和XhoⅠ的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)分別為A↓AGCTT和C↓TCGAG，下列相關(guān)敘述正確的是A.兩種限制酶是在同一種生物中分離出來的B.兩種限制酶切割DNA形成的黏性末端相同C.用HindⅢ酶切割含目的基因的DNA片段和用XhoⅠ酶切割質(zhì)粒后，目

的基因和質(zhì)粒能連接成重組質(zhì)粒D.實(shí)驗(yàn)中可通過控制反應(yīng)時(shí)間、酶的濃度等控制酶切效果12√限制酶命名是用生物屬名的頭一個(gè)字母與種名的頭兩個(gè)字母組成的，由此可知HindⅢ和XhoⅠ是從不同的生物中分離得到的，A錯(cuò)誤；兩種限制酶識(shí)別和切割的序列分別為A↓AGCTT和C↓TCGAG，則兩者切割后形成的黏性末端分別是AGCT－、TCGA－，B錯(cuò)誤；兩種限制酶切割形成的黏性末端不同，無法連接成重組質(zhì)粒，C錯(cuò)誤。122.(2024·高三調(diào)研)質(zhì)粒是基因工程中最常用的載體，質(zhì)粒有標(biāo)記基因(如圖所示)，通過標(biāo)記基因可以推知外源基因(目的基因)是否轉(zhuǎn)移成功。質(zhì)粒上箭頭表示三種限制酶的酶切位點(diǎn)。外源基因插入的位置不同，細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況不同。如表是外源基因插入(插入點(diǎn)有a、b、c)后細(xì)菌的生長(zhǎng)情況。下列有關(guān)敘述正確的是項(xiàng)目細(xì)菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況細(xì)菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況①能生長(zhǎng)不能生長(zhǎng)②能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)③不能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)12A.質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)上有RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)B.①②③三種重組后細(xì)菌的外源基因插入點(diǎn)①是a，②是c，③是bC.質(zhì)粒被一種限制酶切開時(shí)，被水解的磷酸二酯鍵有2個(gè)D.將外源基因與質(zhì)粒連接時(shí)需用DNA聚合酶√12項(xiàng)目細(xì)菌在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況細(xì)菌在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況①能生長(zhǎng)不能生長(zhǎng)②能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)③不能生長(zhǎng)能生長(zhǎng)質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)上有DNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，A錯(cuò)誤；①②③三種重組后細(xì)菌的外源基因插入點(diǎn)①是b，②是c，③是a，B錯(cuò)誤；將外源基因與質(zhì)粒連接時(shí)需用DNA連接酶，D錯(cuò)誤。12與DNA有關(guān)的幾種酶的比較返回考點(diǎn)二基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取(1)目的基因：在基因工程的設(shè)計(jì)和操作中，用于改變受體細(xì)胞

或獲得預(yù)期

等的基因。(2)篩選合適的目的基因①?gòu)南嚓P(guān)的已知

的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。②利用

和序列比對(duì)工具進(jìn)行篩選。性狀表達(dá)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和功能清晰序列數(shù)據(jù)庫(kù)(3)目的基因的獲?、偃斯ず铣赡康幕颉＂赑CR

和擴(kuò)增目的基因a.PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))：是一項(xiàng)根據(jù)

的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種

與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行

的技術(shù)。b.PCR反應(yīng)的條件：一定的

、DNA模板、2種

、4種_____

、

DNA聚合酶，以及能自動(dòng)調(diào)控

的儀器。獲取DNA半保留復(fù)制組分大量復(fù)制緩沖溶液引物脫氧核苷酸耐高c.PCR擴(kuò)增的過程90單鏈50引物72耐高DNA聚合酶d.PCR產(chǎn)物的鑒定：常采用

來鑒定。③通過構(gòu)建

來獲取目的基因。2.基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因

，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。瓊脂糖凝膠電泳在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代(2)基因表達(dá)載體的組成及作用啟動(dòng)子標(biāo)記基因(3)構(gòu)建過程提醒

啟動(dòng)子、終止子、起始密碼子、終止密碼子對(duì)比項(xiàng)目啟動(dòng)子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)DNADNAmRNAmRNA位置目的基因上游目的基因下游mRNA首端mRNA尾端功能RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停下來翻譯的起始信號(hào)(編碼氨基酸)翻譯的結(jié)束信號(hào)(正常情況下，不編碼氨基酸)生物種類植物動(dòng)物微生物常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、_____________顯微注射法

處理法受體細(xì)胞_____________________原核細(xì)胞3.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞花粉管通道法Ca2＋體細(xì)胞或受精卵受精卵生物種類植物動(dòng)物微生物轉(zhuǎn)化過程將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T－DNA中→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上→表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2＋處理細(xì)胞→細(xì)胞處于一種能吸收境中DNA分子的生理狀態(tài)→基因表達(dá)載體導(dǎo)入辨析

(1)轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。此處“轉(zhuǎn)化”與肺炎鏈球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中的“轉(zhuǎn)化”含義相同，實(shí)質(zhì)都是基因重組。(2)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接和兩次導(dǎo)入第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受體細(xì)胞的染色體DNA上；第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌，第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。4.目的基因的檢測(cè)與鑒定(1)目的基因一定是編碼蛋白質(zhì)的基因(

)提示目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子?！?2)真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖溶液中一般要添加Mg2＋(

)√(3)基因表達(dá)載體中的啟動(dòng)子和終止子決定著翻譯的開始與結(jié)束(

)提示啟動(dòng)子和終止子決定著轉(zhuǎn)錄的開始與結(jié)束?！?4)Ti質(zhì)粒上的T－DNA可與植物受體細(xì)胞的染色體DNA整合在一起(

)√(5)為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)只能以受精卵為受體(

)提示為培育抗除草劑的作物新品種，導(dǎo)入抗除草劑基因時(shí)能以受精卵為受體，也能以體細(xì)胞為受體?！?6)檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞可用抗原—抗體雜交技術(shù)(

)提示檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法是PCR等技術(shù)?！?.Bt抗蟲蛋白基因(簡(jiǎn)稱Bt基因)是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉較為合適的目的基因，篩選Bt基因后可以利用PCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行大量擴(kuò)增?；卮鹣铝袉栴}：(1)什么是引物？DNA復(fù)制時(shí)為什么需要引物？提示引物是指一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。在DNA擴(kuò)增時(shí)，DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA，只能從引物的3′端延伸DNA鏈，因此復(fù)制DNA時(shí)應(yīng)加入兩種引物。(2)PCR擴(kuò)增Bt基因需要知道Bt基因的全部核苷酸序列嗎？提示不需要，只要知道Bt基因兩端的部分核苷酸序列即可(以便根據(jù)這部分序列合成兩種引物)。(3)為檢測(cè)Bt基因在轉(zhuǎn)基因抗蟲棉細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)錄，科研人員提取棉花細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過程獲得總cDNA，通過PCR技術(shù)可在總cDNA中專一性地?cái)U(kuò)增出Bt基因的cDNA，原因是什么？提示引物是依據(jù)Bt毒蛋白基因的一段已知序列設(shè)計(jì)合成的(或引物能與Bt基因的cDNA特異性結(jié)合)。(4)PCR擴(kuò)增過程中的循環(huán)圖示與規(guī)律如圖所示，若一個(gè)Bt毒蛋白基因在PCR中經(jīng)過n輪循環(huán)，理論上得到多少個(gè)DNA分子？含引物的DNA分子多少個(gè)？含其中一種引物的DNA分子多少個(gè)？同時(shí)含兩種引物的DNA分子多少個(gè)？共需要消耗多少個(gè)引物？含不等長(zhǎng)脫氧核苷酸鏈的DNA分子多少個(gè)？含等長(zhǎng)脫氧核苷酸鏈的DNA分子多少個(gè)？提示經(jīng)過n輪循環(huán)，得到2n個(gè)DNA分子，含引物的DNA分子2n個(gè)，含其中一種引物的DNA分子數(shù)(2n－1)個(gè)，同時(shí)含兩種引物的DNA分子(2n－2)個(gè)，共需要消耗(2n＋1－2)個(gè)引物。含不等長(zhǎng)脫氧核苷酸鏈的DNA分子2n個(gè)，含等長(zhǎng)脫氧核苷酸鏈的DNA分子(2n－2n)個(gè)。(5)PCR擴(kuò)增Bt基因的過程中需要解旋酶嗎？并說明理由。所需要的DNA聚合酶應(yīng)具有什么特點(diǎn)？提示不需要解旋酶，因?yàn)镻CR過程中，DNA雙鏈在高可完成解旋。由于PCR過程高，故所需要的DNA聚合酶應(yīng)具有耐高點(diǎn)。2.據(jù)圖分析抗蟲棉的培育過程。(1)該過程中的目的基因是

，載體是

。(2)基因工程中，往往使用兩種限制酶切割目的基因，這樣做的原因是什么？Bt基因Ti質(zhì)粒提示為了避免目的基因和載體的自身環(huán)化和反向連接。(3)為了保證目的基因在受體細(xì)胞中能正確表達(dá)，對(duì)目的基因在質(zhì)粒中的插入位點(diǎn)有什么要求？提示目的基因應(yīng)插入啟動(dòng)子與終止子之間。(4)該實(shí)例中，導(dǎo)入目的基因的方法是

。為什么目的基因可以整合到染色體的DNA上？提示由于Ti質(zhì)粒上的T－DNA可轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞且能整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上，而目的基因又插入T－DNA，所以目的基因可以整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(5)將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞時(shí)，能否僅把目的基因整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上？為什么？提示一般不能。如果僅把目的基因整合到線粒體DNA或葉綠體DNA上，由于細(xì)胞分裂可能導(dǎo)致目的基因丟失，無法穩(wěn)定遺傳。(6)該實(shí)例中，檢測(cè)目的基因是否成功表達(dá)的常見方法有哪些？

提示抗原—抗體雜交、用棉葉飼喂棉鈴蟲?？枷蚨嫖龌蚬こ痰幕静僮鞒绦?.(2023·湖北，4)用氨芐青霉素抗性基因(AmpR)、四環(huán)素抗性基因(TetR)作為標(biāo)記基因構(gòu)建的質(zhì)粒如圖所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的質(zhì)粒，構(gòu)建基因表達(dá)載體(重組質(zhì)粒)，并轉(zhuǎn)化到受體菌中。下列敘述錯(cuò)誤的是A.若用HindⅢ酶切，目的基因轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同B.若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，

不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切，可通過DNA凝膠電泳技術(shù)鑒定重

組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否D.若用SphⅠ酶切，攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)和Tet的培養(yǎng)基中能形成菌落34√若用HindⅢ酶切，目的基因可能正向插入，也可能反向插入，轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物可能不同，A正確；若用PvuⅠ酶切，重組質(zhì)粒和質(zhì)粒中都有四環(huán)素抗性基因(TetR)，因此在含Tet(四環(huán)素)培養(yǎng)基中的菌落，不一定含有目的基因，B正確；34DNA凝膠電泳技術(shù)可以分離出不同大小的DNA片段，重組質(zhì)粒的大小與原質(zhì)粒不同，能夠鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功與否，C正確；Sph

Ⅰ的酶切位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因中，若用SphⅠ酶切，重組質(zhì)粒中含氨芐青霉素抗性基因(AmpR)，因此攜帶目的基因的受體菌在含Amp(氨芐青霉素)的培養(yǎng)基中能形成菌落，在含Tet的培養(yǎng)基中不能形成菌落，D錯(cuò)誤。344.(不定項(xiàng))(2024·濱州高三模擬)土壤農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，Ti質(zhì)粒上的T－DNA片段轉(zhuǎn)入植物的基因組。利用農(nóng)桿菌以Ti質(zhì)粒作為載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，下列相關(guān)敘述不正確的是A.目的基因應(yīng)插入T－DNA片段外，以防止破壞T－DNAB.用Ca2＋處理農(nóng)桿菌，以利于其侵染植物細(xì)胞C.Ti質(zhì)粒是一種環(huán)狀DNA分子，沒有雙螺旋結(jié)構(gòu)D.可以用PCR技術(shù)檢測(cè)外源DNA是否整合到植物的染色體DNA上34√√√在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，需要將目的基因插入到T－DNA片段上，有利于介導(dǎo)外源DNA整合到植物的染色體DNA上，A錯(cuò)誤；農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞不需要用Ca2＋處理，B錯(cuò)誤；Ti質(zhì)粒是一種環(huán)狀DNA分子，是存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的DNA，具有雙螺旋結(jié)構(gòu)，C錯(cuò)誤。341.(選擇性必修3P67)基因工程：按照人們的愿望，通過

等技術(shù)，賦予生物新的

，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的________________

。2.(選擇性必修3P71)限制酶能夠識(shí)別

，并且使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。3.(選擇性必修3P72)載體上有特殊的標(biāo)記基因，便于__________________。轉(zhuǎn)基因遺傳特性生物類型和生物產(chǎn)品雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列重組DNA分子的篩選4.(選擇性必修3P77)PCR反應(yīng)需要在一定的緩沖溶液中才能進(jìn)行，需提供

、

、4種

和耐高

。5.(選擇性必修3P77)真核細(xì)胞和細(xì)菌的

都需要Mg2＋激活。因此，PCR反應(yīng)緩沖液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段______________

，引物的作用是________________

。DNA模板2種引物脫氧核苷酸DNA聚合酶DNA聚合酶能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸6.(選擇性必修3P80)基因表達(dá)載體的構(gòu)建的目的：使目的基因__________

，同時(shí)，使目的基因能夠___________

?；虮磉_(dá)載體是載體的一種，除目的基因、

外，還必須含有啟動(dòng)子、終止子等。啟動(dòng)子是

識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因

，最終表達(dá)出人類需要的

。7.(選擇性必修3P81)轉(zhuǎn)化：________________________________________

。在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代表達(dá)和發(fā)揮作用標(biāo)記基因RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出mRNA蛋白質(zhì)目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程8.(選擇性必修3P81～82)將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法是

、

；導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞的方法是

；導(dǎo)入微生物細(xì)胞的方法是

處理法。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法顯微注射法Ca2＋9.(選擇性必修3P82)目的基因的檢測(cè)與鑒定：首先是分子水平的檢測(cè)，包括通過

等技術(shù)檢測(cè)棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或檢測(cè)Bt基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA；從轉(zhuǎn)基因棉花中提取

，用相應(yīng)的____進(jìn)行

，檢測(cè)Bt基因是否翻譯成Bt抗蟲蛋白等。其次，還需要進(jìn)行個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。例如，通過_______________________

來確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度。PCR蛋白質(zhì)抗體抗原—抗體雜交采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲10.如圖為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)為：HindⅢ(A↓AGCTT)、PvitⅡ(CAG↓CTG)、KpnⅠ(G↓GTACC)、EcoRⅠ(G↓AATTC)、PstⅠ(CTGCA↓G)、BamHⅠ(G↓GATCC)。為使phb2基因(該基因序列不含圖中限制酶的識(shí)別序列)與載體正確連接，在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入

和

兩種不同限制酶的識(shí)別序列。將經(jīng)過這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時(shí)，可選用________

(填“E.coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”)。返回Pvit

ⅡEcoRⅠT4DNA連接酶課時(shí)精練一、選擇題：每小題給出的四個(gè)選項(xiàng)中只有一個(gè)符合題目要求。1.(2024·長(zhǎng)沙高三調(diào)研)基因工程中需使用多種工具酶，幾種限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列說法正確的是A.限制酶Sma

Ⅰ和EcoRV切

割形成的末端，可以通過

E.coli

DNA連接酶相互連接B.DNA連接酶、DNA聚合酶和RNA聚合酶均可催化磷酸二酯鍵的形成C.限制酶EcoRⅠ進(jìn)行一次切割，會(huì)切斷2個(gè)磷酸二酯鍵，形成1個(gè)游離的5′末端D.若兩種限制酶的識(shí)別序列相同，則形成的末端一定能通過DNA連接酶相互

連接√12345678910111213限制酶Sma

Ⅰ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，可以通過T4DNA連接酶相互連接，E.coliDNA連接酶只能連接互補(bǔ)的黏性末端，A錯(cuò)誤；一個(gè)限制酶切割一次，使DNA雙鏈斷開，會(huì)有2個(gè)磷酸二酯鍵斷裂，形成2個(gè)游離的5′末端，C錯(cuò)誤；若兩種限制酶的識(shí)別序列相同，但由于切割位點(diǎn)不同，切割形成的末端不同，不一定能通過DNA連接酶相互連接，D錯(cuò)誤。123456789101112132.(2023·新課標(biāo)，6)某同學(xué)擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn))和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。12345678910111213下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接√12345678910111213酶3切割后得到的是平末端，應(yīng)該用T4DNA連接酶連接，A不符合題意；質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到黏性末端，二者不能連接，B不符合題意；12345678910111213質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接后，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達(dá)載體的構(gòu)建方案最合理且高效，C符合題意；12345678910111213若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達(dá)載體缺少標(biāo)記基因，無法進(jìn)行后續(xù)的篩選，D不符合題意。123456789101112133.(2024·泰州高三質(zhì)檢)RT－PCR是將RNA逆轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)，可利用此技術(shù)獲取目的基因，具體過程如圖所示。下列說法不正確的是A.設(shè)計(jì)擴(kuò)增目的基因的引物時(shí)需

考慮目的基因兩端的堿基序列B.G/C含量高的引物在與模板鏈

結(jié)合時(shí)，復(fù)性的高C.該技術(shù)用于對(duì)某些微量RNA病毒的檢測(cè)，可提高檢測(cè)的靈敏度D.過程Ⅰ需要加入緩沖液、原料、TaqDNA聚合酶和引物A等√12345678910111213過程Ⅰ是逆轉(zhuǎn)錄過程，所以需要加入緩沖液、原料、逆轉(zhuǎn)錄酶和引物A等，D錯(cuò)誤。123456789101112134.(2024·青島高三二模)轉(zhuǎn)基因植物中標(biāo)記基因的剔除可有效防止基因污染，剔除常用分離剔除法和重組剔除法。分離剔除法是在轉(zhuǎn)基因時(shí)將目的基因和標(biāo)記基因分別構(gòu)建在兩個(gè)Ti質(zhì)粒上，通過共轉(zhuǎn)化得到轉(zhuǎn)基因植物后讓其自交得到不含標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因個(gè)體；重組剔除法利用Cre/LoxP重組酶系統(tǒng)，Cre酶能有效剔除重組載體中含有標(biāo)記基因的序列，只留下一個(gè)LoxP位點(diǎn)，具體原理如圖。下列說法不正確的是12345678910111213A.利用分離剔除法時(shí)，目的基因和標(biāo)記基因都應(yīng)插到Ti質(zhì)粒的T－DNA

序列B.分離剔除時(shí)目的基因和標(biāo)

記基因插到植物細(xì)胞的同

源染色體或非同源染色體

上均可成功C.上述重組載體中啟動(dòng)子1在農(nóng)桿菌中可發(fā)揮作用，而在植物細(xì)胞中不能

發(fā)揮作用D.經(jīng)重組剔除后的標(biāo)記基因，因沒有啟動(dòng)子而無法啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄12345678910111213√Ti質(zhì)粒的T－DNA可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，并且整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，所以利用分離剔除法時(shí)，目的基因和標(biāo)記基因都應(yīng)插到Ti質(zhì)粒的T－DNA序列，進(jìn)而成功整合到受體細(xì)胞染色體DNA上，A正確；12345678910111213分離剔除時(shí)目的基因和標(biāo)記基因插到植物細(xì)胞的同源染色體或非同源染色體上最終均可獲得不含標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因個(gè)體，即均可成功，B正確；12345678910111213重組剔除時(shí)，Cre酶基因應(yīng)該在植物細(xì)胞中表達(dá)，故上述重組載體中啟動(dòng)子1在農(nóng)桿菌中不能發(fā)揮作用，而在植物細(xì)胞中能發(fā)揮作用，C錯(cuò)誤；由圖可知，經(jīng)重組剔除后的標(biāo)記基因沒有啟動(dòng)子，無法啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄，D正確。123456789101112135.(2024·聊城高三聯(lián)考)如圖是培育抗除草劑玉米的技術(shù)路線圖，含有內(nèi)含子的報(bào)告基因只能在真核生物中正確表達(dá)，其產(chǎn)物能催化無色物質(zhì)K呈現(xiàn)藍(lán)色。轉(zhuǎn)化過程中愈傷組織表面常殘留農(nóng)桿菌，會(huì)導(dǎo)致未轉(zhuǎn)化的愈傷組織可能在含除草劑的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。下列相關(guān)敘述正確的是12345678910111213A.過程①中除草劑抗性基因插入T－DNA中，導(dǎo)致T－DNA片段失活B.過程①用兩種限制酶就可防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化C.過程②用Ca2＋處理，使農(nóng)桿菌細(xì)胞壁通透性改變，使其處于能吸收周

圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)D.過程③應(yīng)在培養(yǎng)基中加入除草劑和物質(zhì)K√12345678910111213過程①中除草劑抗性基因插入T－DNA中，不會(huì)導(dǎo)致T－DNA片段失活，A錯(cuò)誤；過程①使用兩種限制酶，且這兩種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端不同，才可以防止酶切產(chǎn)物自身環(huán)化，B錯(cuò)誤；12345678910111213過程③應(yīng)在培養(yǎng)基中加入除草劑和物質(zhì)K，除草劑是用來檢測(cè)目的基因是否正確表達(dá)，物質(zhì)K是用來檢測(cè)目的基因有沒有導(dǎo)入植物細(xì)胞中，加入除草劑可保留轉(zhuǎn)化的愈傷組織和附著農(nóng)桿菌但未轉(zhuǎn)化的愈傷組織，其中變藍(lán)的為轉(zhuǎn)化的愈傷組織，D正確。123456789101112136.(2024·揚(yáng)州高三一模)我國(guó)科學(xué)家利用Xba

Ⅰ和Sac

Ⅰ兩種限制酶，并運(yùn)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將富含賴氨酸的蛋白質(zhì)編碼基因(含678bp)導(dǎo)入某植物細(xì)胞，再經(jīng)植物組織培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株，使賴氨酸的含量比對(duì)照組明顯提高，如圖表示相關(guān)培育過程(質(zhì)粒的其他部位和目的基因均無Xba

Ⅰ、Sac

Ⅰ、HindⅢ的識(shí)別位點(diǎn))，下列說法不正確的是12345678910111213A.一個(gè)內(nèi)含目的基因的模板DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增4次，共產(chǎn)生8個(gè)等長(zhǎng)DNA分子B.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的常用方法C.植物組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基需添加卡那霉素以便篩選轉(zhuǎn)基因植株D.使用Sac

Ⅰ和HindⅢ切割重組質(zhì)粒后能得到1500bp左右的片段√12345678910111213一個(gè)內(nèi)含目的基因的模板DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增4次共產(chǎn)生等長(zhǎng)的DNA分子數(shù)24－2×4＝8(個(gè))，A正確；因?yàn)椴迦胫参锛?xì)胞染色體上的是質(zhì)粒的T－DNA，而卡那霉素抗性基因不在此片段上，導(dǎo)入成功的植物細(xì)胞對(duì)卡那霉素?zé)o抗性，C錯(cuò)誤；12345678910111213根據(jù)切割目的基因的限制酶在質(zhì)粒上的切割位點(diǎn)，可知由于重組質(zhì)粒上移除1900bp而補(bǔ)充了含678bp的目的基因，加上未移除的822bp，所以用SacⅠ和HindⅢ切割重組質(zhì)粒后，可得到822＋678＝1500(bp)左右的新片段，D正確。123456789101112137.(2024·永州高三三模)自然界中很少出現(xiàn)藍(lán)色的花，天然藍(lán)色花產(chǎn)生的主要原因是花瓣細(xì)胞液泡中花青素在堿性條件下顯藍(lán)色。我國(guó)科學(xué)家利用鏈霉菌的靛藍(lán)合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)構(gòu)建基因表達(dá)載體(如圖)，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入白玫瑰中，在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中形成穩(wěn)定顯色的靛藍(lán)。12345678910111213下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是A.題述獲得藍(lán)色玫瑰的方案中不

需要轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因B.將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)使用的

限制酶是Pme

Ⅰ和BamHⅠC.同時(shí)使用Spe

Ⅰ和Sac

Ⅰ能提高idgS基因和Ti質(zhì)粒的重組效率D.sfp和idgS基因具有各自的啟動(dòng)子，表達(dá)是相互獨(dú)立進(jìn)行的√12345678910111213靛藍(lán)能夠穩(wěn)定顯色，不受pH的影響，故本題方案中不需要轉(zhuǎn)入能調(diào)控液泡pH的基因，A正確；將sfp基因插入Ti質(zhì)粒時(shí)若使用的限制酶是Pme

Ⅰ和BamHⅠ，則會(huì)將終止子一同切除，故只能用BamHⅠ，B錯(cuò)誤。12345678910111213二、選擇題：每小題給出的四個(gè)選項(xiàng)中有一個(gè)或多個(gè)符合題目要求。8.(2024·湘潭高三質(zhì)檢)限制酶和DNA連接酶是基因工程的工具酶，下列說法正確的是A.DNA連接酶能將單個(gè)核苷酸加到已有的核苷酸片段上形成磷酸二酯鍵B.限制酶只能切割雙鏈DNA片段，不能切割某著名企業(yè)花葉病毒的核酸C.只有用相同限制酶處理含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒，才能形成重組

質(zhì)粒D.限制酶主要從原核生物中分離純化而來，不能剪切自身的DNA12345678910111213√√DNA連接酶連接的是兩個(gè)DNA片段，A錯(cuò)誤；用不同的限制酶處理含目的基因的DNA片段和質(zhì)粒，也可能形成相同的黏性末端，進(jìn)而形成重組質(zhì)粒，C錯(cuò)誤；限制酶主要從原核生物中分離純化而來，但是因?yàn)樵松顳NA分子中不存在該酶的識(shí)別序列或識(shí)別序列已經(jīng)被修飾，所以不能剪切自身的DNA，D正確。123456789101112139.(2024·益陽高三聯(lián)考)某課題組為得到青蒿素產(chǎn)量高的新品系，使青蒿素合成過程中的某一關(guān)鍵酶基因fps在野生青蒿中過量表達(dá)，其過程如圖所示。下列有關(guān)敘述正確的是A.也可用PCR技術(shù)直接擴(kuò)增RNA來獲取目的基因B.酶1、酶2和酶3作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵C.本過程中，可以采用一種、兩種甚至四種酶2D.通過PCR技術(shù)可檢測(cè)fps基因是否表達(dá)出蛋白質(zhì)√12345678910111213√PCR技術(shù)不能直接擴(kuò)增RNA來獲取目的基因，A錯(cuò)誤；據(jù)圖可知，酶1表示逆轉(zhuǎn)錄酶，酶2表示限制酶，酶3表示DNA連接酶，酶1、酶2和酶3作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵，B正確；12345678910111213不同的限制酶切割可能產(chǎn)生相同的黏性末端，因此為了成功構(gòu)建表達(dá)載體，可以采用一種、兩種甚至四種酶2切割含fps基因的DNA片段和質(zhì)粒a，C正確；進(jìn)行抗原—抗體雜交可檢測(cè)fps基因是否表達(dá)出蛋白質(zhì)，D錯(cuò)誤。1234567891011121310.(2024·濰坊高三質(zhì)檢)圖甲為培育轉(zhuǎn)基因生物時(shí)選用的載體，圖乙是含有目的基因的一段DNA序列，圖中標(biāo)注了相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)。下列敘述錯(cuò)誤的是A.若通過PCR技術(shù)提取該目的基

因，應(yīng)該選用引物a和引物cB.構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)應(yīng)選用BamHⅠ

和HindⅢ這兩種限制酶C.若將基因表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌中，需用Ca2＋處理大腸桿菌D.只利用含四環(huán)素的培養(yǎng)基就可以直接篩選出成功導(dǎo)入表達(dá)載體的受體細(xì)胞123456789101112√13√根據(jù)圖甲可知，BamHⅠ會(huì)導(dǎo)致兩種抗性基因都被破壞，所以不宜選用BamHⅠ，為防止目的基因自身環(huán)化，可選用Bcl

Ⅰ和HindⅢ兩種限制酶切割，B錯(cuò)誤；由于選擇Bcl

Ⅰ和HindⅢ這兩種限制酶，破壞了氨芐青霉素抗性基因，但沒有破壞四環(huán)素抗性基因，因此應(yīng)該先用含四環(huán)素的培養(yǎng)基篩選出含有基因表達(dá)載體和普通質(zhì)粒的大腸桿菌，再用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基篩選含重組質(zhì)粒的大腸桿菌，D錯(cuò)誤。12345678910111213三、非選擇題11.(2021·全國(guó)乙，38)用重組DNA技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過程中要使用多種工具酶，其中4種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點(diǎn)如圖所示。12345678910111213回答下列問題：(1)常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶，上圖中_______________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接，上圖中________________________________切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。12345678910111213EcoRⅠ、Pst

ⅠEcoRⅠ、Pst

Ⅰ、Sma

Ⅰ和EcoRⅤ限制酶EcoRⅠ和Pst

Ⅰ切割形成的是黏性末端，限制酶Sma

Ⅰ和EcoRⅤ切割形成的是平末端，E.coliDNA連接酶來源于大腸桿菌，只能將雙鏈DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來，而T4DNA連接酶來源于T4噬菌體，可用于連接黏性末端和平末端，但連接效率較低。因此圖中EcoRⅠ和Pst

Ⅰ切割后的DNA片段(黏性末端)可以用E.coliDNA連接酶連接，除了這兩種限制酶切割的DNA片段，限制酶Sma

Ⅰ和EcoRⅤ切割后的DNA片段(平末端)也可以用T4DNA連接酶連接。12345678910111213DNA連接酶將兩個(gè)DNA片段連接形成磷酸二酯鍵。(2)DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是____________。12345678910111213磷酸二酯鍵(3)重組DNA技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中__________；質(zhì)粒DNA分子上有_______________________，便于外源DNA的插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因(如某種抗生素抗性基因)，利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是__________________________________________________________________________。自我復(fù)制一至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)

用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞12345678910111213質(zhì)粒是小型環(huán)狀的DNA分子，常作為基因表達(dá)的載體，首先質(zhì)粒上含有復(fù)制原點(diǎn)，能保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中自我復(fù)制。質(zhì)粒DNA分子上有一個(gè)至多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，便于目的基因的導(dǎo)入。質(zhì)粒上的標(biāo)記基因便于重組DNA分子的篩選，具體做法是用含有該抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細(xì)胞，能夠存活的即為含有質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞。12345678910111213(4)表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指___________________________________________________________________________________________。

位于基因上游的一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，是RNA聚合酶識(shí)別及結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄過程12345678910111213啟動(dòng)子是一段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的上游，它是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達(dá)出人類需要的蛋白質(zhì)。12.(2024·常德高三調(diào)研)金屬硫蛋白(MT)是一類廣泛存在于動(dòng)植物中具有金屬結(jié)合能力的蛋白質(zhì)，決定該蛋白質(zhì)合成的基因結(jié)構(gòu)如圖1所示，其中A鏈為編碼鏈、B鏈為模板鏈?？蒲腥藛T利用圖2所示質(zhì)粒構(gòu)建棗樹的MT基因重組DNA分子并導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞，獲得對(duì)重金屬鎘(Cd)具有吸附能力和耐受能力的MT工程菌。回答下列問題：12345678910111213注：Xho

Ⅰ、Kpn

Ⅰ、Pst

Ⅰ為不同限制酶的識(shí)別位點(diǎn)；LacZ基因編碼產(chǎn)生的β－半乳糖苷酶可以催化無色物質(zhì)X－gal產(chǎn)生藍(lán)色物質(zhì)使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，否則菌落為白色；AmpR基因?yàn)榘逼S青霉素抗性基因。12345678910111213(1)獲取目的基因：提取棗樹細(xì)胞的_______，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。為了使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物按照正確的方向與已被酶切的載體連接，克隆MT基因時(shí)應(yīng)選擇的引物組合是_______________，并在其____(填“5′”或“3′”)端分別添加限制酶______________的識(shí)別序列。mRNA引物Ⅱ和引物Ⅲ5′Kpn

Ⅰ和Xho

ⅠPCR過程中，引物與模板鏈的3′端結(jié)合，因此應(yīng)當(dāng)選擇引物Ⅱ和引物Ⅲ，這樣才能使耐高DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸。由題干可知，B鏈為模板鏈，轉(zhuǎn)錄是沿著模板鏈的3′→5′方向進(jìn)行的，應(yīng)將MT基因的左端與啟動(dòng)子一側(cè)連接，由于目的基因12345678910111213中含有Pst

Ⅰ的識(shí)別序列，不宜選用Pst

Ⅰ，同時(shí)為了保證MT基因正向連接到質(zhì)粒上，應(yīng)當(dāng)在MT基因兩側(cè)添加不同的限制酶識(shí)別序列，故在引物Ⅱ和引物Ⅲ末端添加的限制酶序列分別是Kpn

Ⅰ和Xho

Ⅰ限制酶識(shí)別序列。引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾，故限制酶的識(shí)別序列應(yīng)加在引物的5′端。12345678910111213(2)構(gòu)建重組DNA分子：?jiǎn)?dòng)子是____________識(shí)別并結(jié)合的部位?；蚬こ讨袠?gòu)建用于原核生物的表達(dá)載體時(shí)，常用的啟動(dòng)子不包括以下哪一項(xiàng)？_____。A.噬菌體基因啟動(dòng)子

B.乳酸菌基因啟動(dòng)子C.大腸桿菌基因啟動(dòng)子 D.棗樹MT基因啟動(dòng)子RNA聚合酶D12345678910111213啟動(dòng)子是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終表達(dá)出人類需要的蛋白質(zhì)。乳酸菌和大腸桿菌都是原核生物，它們的啟動(dòng)子可以用于構(gòu)建原核生物的表達(dá)載體；噬菌體是寄生于細(xì)菌中的病毒，噬菌體基因啟動(dòng)子可用于構(gòu)建原核生物表達(dá)載體；棗樹MT基因啟動(dòng)子不適合用于構(gòu)建原核生物表達(dá)載體。12345678910111213(3)導(dǎo)入、篩選和鑒定MT工程菌。①將得到的混合物導(dǎo)入到用______處理的大腸桿菌完成______實(shí)驗(yàn)。Ca2＋轉(zhuǎn)化12345678910111213大腸桿菌是原核生物，需要Ca2＋處理，使其處于一種收境中DNA分子的生理狀態(tài)，完成將基因表達(dá)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程，即轉(zhuǎn)化。12345678910111213②將菌液稀釋并涂布在含X－gal和氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)后，隨機(jī)挑取______的單菌落可獲得MT工程菌。白色12345678910111213在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，導(dǎo)入了空白質(zhì)粒和重組質(zhì)粒的大腸桿菌都可以形成菌落，但導(dǎo)入重組質(zhì)粒的大腸桿菌Lac