專題突破10綜合PCR的基因工程問(wèn)題闡述常規(guī)PCR、重疊延伸PCR、熒光定量PCR等的過(guò)程與原理，舉例說(shuō)明不同的PCR技術(shù)有著不同的應(yīng)用。課標(biāo)要求考情分析幾種不同PCR的應(yīng)用2023·江蘇·T22

2023·山東·T25

2022·江蘇·T24

2022·山東·T252021·全國(guó)甲·T38

2021·山東·T25

2020·北京·T12

2020·江蘇·T33類型一利用PCR技術(shù)獲取目的基因基本模型獲取目的基因是基因工程操作的第一步。獲取目的基因的方法有多種，現(xiàn)在常用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因。PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫(xiě)。它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。該技術(shù)由等人于1985年發(fā)明，為此，于1993年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。典例突破1.“X基因”是DNA分子上一個(gè)有遺傳效應(yīng)的片段，若要用PCR技術(shù)特異性地拷貝“X基因”，需在PCR反應(yīng)中加入兩種引物，兩種引物及其與模板鏈的結(jié)合位置如圖1所示。下列敘述錯(cuò)誤的是典例突破A.第一輪復(fù)制得到2個(gè)DNA分子，

即①②各一個(gè)B.第二輪復(fù)制得到4個(gè)DNA分子，

即①②③④各一個(gè)C.第四輪復(fù)制得到16個(gè)DNA分子，

其中有4個(gè)X基因D.經(jīng)五輪循環(huán)后產(chǎn)物中有五種不

同的DNA分子√據(jù)圖分析可知，第一輪復(fù)制形成2個(gè)DNA分子，即①②各一個(gè)，A正確；第二輪復(fù)制得到22＝4(個(gè))DNA分子，即①?gòu)?fù)制得①和③、②復(fù)制得②和④，即得到①②③④各一個(gè)，B正確；典例突破第四輪復(fù)制得到16個(gè)DNA分子，其中有8個(gè)⑤(X基因)，C錯(cuò)誤；經(jīng)五輪循環(huán)后共形成32個(gè)DNA分子，其中①②各一個(gè)，③④各四個(gè)，22個(gè)⑤，故產(chǎn)物中有五種不同的DNA分子，D正確。典例突破類型二利用PCR技術(shù)鑒定目的基因的連接方式基本模型檢測(cè)目的基因在受體細(xì)胞內(nèi)是否穩(wěn)定存在是基因工程操作的重要步驟，可以借助載體上的標(biāo)記基因、PCR技術(shù)和核酸分子雜交技術(shù)等方法鑒定受體細(xì)胞中是否轉(zhuǎn)入了目的基因。在實(shí)際操作中，PCR技術(shù)不僅可以精準(zhǔn)地鑒定受體細(xì)胞是否轉(zhuǎn)入目的基因，還可以通過(guò)引物的巧妙設(shè)計(jì)鑒定目的基因的連接方式。2.(2019·江蘇，33節(jié)選)為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是______。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段，原因是_________________。典例突破乙、丙目的基因反向連接分析題圖可知，理論上可以選擇的引物組合有甲和丙、乙和丙兩種情況。如果選擇甲和丙這對(duì)引物，則無(wú)論目的基因是否正確插入，擴(kuò)增的片段都是50＋300＋100＝450(bp)，不符合要求；如果選擇乙和丙這對(duì)引物，正向連接和反向連接后所得結(jié)果不同，所以應(yīng)選擇乙和丙這對(duì)引物進(jìn)行PCR鑒定。如果目的基因和質(zhì)粒反向連接，則引物乙會(huì)出現(xiàn)在重組質(zhì)粒的外側(cè)，此時(shí)若加入引物甲和乙，則可以擴(kuò)增出300＋100＝400(bp)的片段。典例突破重疊延伸PCR技術(shù)是指在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用具有互補(bǔ)末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，通過(guò)重疊鏈的延伸，將不同來(lái)源的片段重疊拼接起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。該技術(shù)在基因的定點(diǎn)突變、長(zhǎng)片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的擴(kuò)增等方面有著獨(dú)特的應(yīng)用。類型三利用PCR技術(shù)引導(dǎo)基因定點(diǎn)突變基本模型3.水蛭素是一種蛋白質(zhì)，可用于預(yù)防和治療血栓。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用重疊延伸PCR技術(shù)在水蛭素基因中的特定位點(diǎn)引入特定突變，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密碼子為AAC、AAU)替換為賴氨酸(密碼子為AAA、AAG)，從而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如圖。注：圖中的引物2和3的突起處代表與模板鏈不能互補(bǔ)的突變位點(diǎn)。典例突破(1)由以上事例可知，要對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，需要通過(guò)________________________來(lái)完成。(2)若擬突變位點(diǎn)的堿基對(duì)為A－T，則需要讓其突變?yōu)開(kāi)_____________才能達(dá)到目的。引物2的突變位點(diǎn)(突起處)應(yīng)設(shè)計(jì)為_(kāi)_______(假設(shè)引物為單鏈DNA)。因(或基因定點(diǎn)突變)改造基典例突破T－A或C－GA或G若擬突變位點(diǎn)的堿基對(duì)為A－T，則需要讓其突變?yōu)門(mén)－A或C－G，對(duì)應(yīng)的密碼子由AAU變成AAA或由AAC變成AAG，可使天冬酰胺替換為賴氨酸。典例突破(3)在第一階段獲得2種具有重疊片段DNA的過(guò)程中，引物1、引物2組成的反應(yīng)系統(tǒng)和引物3、引物4組成的反應(yīng)系統(tǒng)中均進(jìn)行一次復(fù)制，共產(chǎn)生____種DNA分子。該階段必須將引物1、2和引物3、4置于不同反應(yīng)系統(tǒng)中，這是因?yàn)開(kāi)_________________________________________________________。典例突破3

引物2和3中存在互補(bǔ)配對(duì)片段，置于同一反應(yīng)系統(tǒng)時(shí)會(huì)結(jié)合而失去作用若兩個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)均進(jìn)行一次復(fù)制，

則會(huì)產(chǎn)生3種不同的DNA分子，因?yàn)橐?和4產(chǎn)生的DNA分子是一樣的。典例突破(4)利用重疊延伸PCR技術(shù)還可以將兩個(gè)不同來(lái)源的DNA片段拼接起來(lái)。有人想利用該技術(shù)把基因M和N拼接在一起，設(shè)計(jì)基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在設(shè)計(jì)這4種引物時(shí)，特別要注意的問(wèn)題是_________________________________________________________________。典例突破M2中的一種引物與N1、N2中的一種引物必須具有互補(bǔ)配對(duì)的片段M1、重疊互補(bǔ)引物的設(shè)計(jì)是重疊延伸PCR技術(shù)成功的關(guān)鍵。拼接基因M和N時(shí)，設(shè)計(jì)引物時(shí)需要注意的是，需要找到兩種基因的重疊部分，即M1、M2中的一種引物與N1、N2中的一種引物必須具有互補(bǔ)配對(duì)的片段。典例突破利用PCR技術(shù)進(jìn)行基因擴(kuò)增時(shí)，為了便于設(shè)計(jì)引物，要求目的基因兩側(cè)的序列是已知的。當(dāng)DNA的某些序列已知，而需要擴(kuò)增已知序列兩端的未知序列時(shí)，可采用反向PCR技術(shù)。類型四利用PCR技術(shù)擴(kuò)增未知基因序列基本模型4.(2020·江蘇，33節(jié)選)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡(jiǎn)捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖(以EcoRⅠ酶切為例)：典例突破請(qǐng)據(jù)圖回答問(wèn)題：(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種______________________酶，它通過(guò)識(shí)別特定的___________切割特定位點(diǎn)。典例突破內(nèi)切核酸(或限制)限制性核苷酸序列(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3′－羥基與5′－磷酸間形成____________；PCR循環(huán)中，升95℃是為了獲得____________；TaqDNA聚合酶的作用是催化___________________________。典例突破DNA磷酸二酯鍵單鏈以DNA為模板的DNA鏈的延伸

DNA序列(某省市略了部分核苷酸序列)已知序列

PCR引物①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′(3)若如表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是________(從引物①②③④中選擇，填編號(hào))。典例突破②④PCR過(guò)程中，根據(jù)已知的DNA序列合成兩個(gè)引物，要注意模板鏈和引物的方向是相反的，引物的核苷酸序列要能夠和相應(yīng)模板的核苷酸序列發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，環(huán)狀DNA圖中顯示PCR過(guò)程是從已知DNA序列的兩端分別向相反方向形成子鏈，一個(gè)引物是與已知DNA序列的第一條鏈的左端互補(bǔ)結(jié)合，向右側(cè)方向延伸形成子鏈，該引物是④，另一個(gè)引物是與已知DNA序列的第二條鏈的右端互補(bǔ)結(jié)合，向左側(cè)方向延伸形成子鏈，該引物是②。典例突破病原體檢測(cè)是診斷和控制傳染病的重要手段，為迅速而準(zhǔn)確地確定病原體的存在和種類，發(fā)展了速檢測(cè)方法。PCR技術(shù)是一種基于DNA擴(kuò)增原理的快速病原體檢測(cè)方法，它能夠在幾小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增和檢測(cè)極小量的病原體DNA，并且具備高度的特異性和敏感性。類型五利用PCR技術(shù)快速檢測(cè)病原體基本模型由病毒RNA生成cDNA的過(guò)程屬于逆轉(zhuǎn)錄，需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化。5.猴痘是由猴痘病毒(一種RNA病毒)感染所致的一種病毒性人畜共患病，臨床上表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹、淋巴結(jié)腫大等。猴痘病毒感染的常規(guī)檢測(cè)方法是通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR鑒定。(1)首先，從樣本中提取病毒RNA，經(jīng)________酶作用生成cDNA；然后以cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，測(cè)定樣品中病毒核酸量。逆轉(zhuǎn)錄典例突破(2)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增目的基因，需額外添加熒光標(biāo)記探針(一小段單鏈DNA，可與目的基因中部序列特異性結(jié)合)。當(dāng)探針完整時(shí)，不產(chǎn)生熒光。在PCR過(guò)程中，與目的基因結(jié)合的探針被Taq

DNA聚合酶水解，R與Q分離后，R發(fā)出的熒光可被檢測(cè)到(如圖1)。①當(dāng)樣本中有目的基因時(shí)，引物和探針與目的基因復(fù)性時(shí)，通過(guò)_____________原則而特異性結(jié)合。典例突破堿基互補(bǔ)配對(duì)當(dāng)樣本中有目的基因時(shí)，引物和探針與目的基因復(fù)性時(shí)，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成氫鍵而特異性結(jié)合。典例突破②在PCR循環(huán)的延伸階段，TaqDNA聚合酶催化子鏈的合成并水解探針。檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)體系中DNA分子數(shù)呈________(填“正相關(guān)”或“反相關(guān)”)關(guān)系。典例突破正相關(guān)在PCR循環(huán)的延伸階段，TaqDNA聚合酶催化子鏈的合成并水解探針。根據(jù)題干信息“熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物數(shù)量完全同步”可知，檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度與反應(yīng)體系中DNA分子數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系。典例突破(3)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)猴痘病毒感染時(shí)，檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度變化如圖2所示。①與指數(shù)增長(zhǎng)期相比，線性增長(zhǎng)期目的基因數(shù)量的增長(zhǎng)率下降，原因可能有___________________________________________________________。典例突破TaqDNA聚合酶活性下降、引物濃度下降、原料dNTP濃度下降與指數(shù)增長(zhǎng)期相比，線性增長(zhǎng)期目的基因數(shù)量的增長(zhǎng)率下降，有可能是底物濃度降低導(dǎo)致的，也有可能是酶的活性緩慢下降導(dǎo)致的。典例突破樣本中初始模板越多時(shí)，達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)就越少，Ct值就越小。②Ct值的含義：在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。因此，當(dāng)樣本中初始模板越多時(shí)，Ct值就_______。典例突破越小Ct≤37判定為陽(yáng)性，Ct>40或無(wú)Ct值判定為陰性。圖2中熒光閾值大概是36，猴痘病毒核酸檢測(cè)結(jié)果應(yīng)判定為陽(yáng)性。③某新猴痘病毒核酸檢測(cè)說(shuō)明書(shū)標(biāo)明，Ct≤37判定為陽(yáng)性，Ct>40或無(wú)Ct值判定為陰性。圖2所示猴痘病毒核酸檢測(cè)結(jié)果應(yīng)判定為_(kāi)_______。典例突破陽(yáng)性(4)(多選)陰性結(jié)果也不能排除猴痘病毒感染，可能產(chǎn)生假陰性的因素有____。a.取樣太早，樣本中病毒量少，達(dá)不到實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)閾值b.樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解

c.病毒發(fā)生變異典例突破abc陰性結(jié)果也不能排除猴痘病毒感染，可能產(chǎn)生假陰性的因素有取樣太早，樣本中病毒量少，達(dá)不到實(shí)驗(yàn)時(shí)熒光PCR檢測(cè)閾值；樣本被污染，RNA酶將病毒RNA降解，從而導(dǎo)致樣本中病毒量少；病毒發(fā)生變異，檢測(cè)不出來(lái)，從而出現(xiàn)假陰性。典例突破課時(shí)精練一、選擇題：每小題給出的四個(gè)選項(xiàng)中只有一個(gè)符合題目要求。1.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因，其原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制類似(如圖所示)。圖中引物為單鏈DNA片段，它是子鏈合成延伸的基礎(chǔ)。下列敘述錯(cuò)誤的是A.用PCR方法擴(kuò)增目的基因時(shí)不需

知道基因的全部序列B.設(shè)計(jì)引物時(shí)需要避免引物之間形

成堿基互補(bǔ)配對(duì)而造成引物自連C.復(fù)性高可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)

得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物D.第四輪循環(huán)產(chǎn)物中同時(shí)含有引物

A和引物B的DNA片段所占的比例為15/161234567√89101112復(fù)性的目的是使引物與模板DNA結(jié)合，故復(fù)性高可能導(dǎo)致引物與模板DNA不能結(jié)合，因而使得PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，C正確；第四輪循環(huán)共形成16個(gè)DNA分子，產(chǎn)物中同時(shí)含有引物A和引物B的DNA片段所占的比例為14/16＝7/8，D錯(cuò)誤。1234567891011122.PCR引物的3′端為結(jié)合模板DNA的關(guān)鍵堿基，5′端無(wú)嚴(yán)格限制，可用于添加限制酶切點(diǎn)等序列。下列敘述正確的是A.PCR第5個(gè)循環(huán)，消耗了16對(duì)引物B.脫氧核苷酸作為擴(kuò)增的原料，會(huì)

依次連接到引物的5′端C.PCR反應(yīng)體系中需要加入脫氧核苷酸、耐高DNA聚合酶、Ca2＋等D.用圖中引物擴(kuò)增至少4個(gè)循環(huán)后才能獲得兩端均添加限制酶切點(diǎn)的目的

產(chǎn)物1234567√89101112進(jìn)行PCR時(shí)，擴(kuò)增是從引物的3′端延伸，因此脫氧核苷酸作為擴(kuò)增的原料會(huì)依次連接到引物的3′端，B錯(cuò)誤；PCR反應(yīng)體系中需要加入脫氧核苷酸、耐高DNA聚合酶和擴(kuò)增緩沖液(含Mg2＋)等物質(zhì)，不需要加Ca2＋，C錯(cuò)誤；用圖中引物擴(kuò)增至少3個(gè)循環(huán)后才能獲得兩端均添加限制酶切點(diǎn)的目的產(chǎn)物，D錯(cuò)誤。1234567891011123.(2024·威海高三模擬)重疊延伸PCR可實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)基因誘變，其操作過(guò)程如圖所示(凸起處代表突變位點(diǎn))。下列說(shuō)法正確的是A.過(guò)程①需要把兩對(duì)引物同時(shí)加入一

個(gè)擴(kuò)增體系以提高擴(kuò)增效率B.過(guò)程①需要2輪PCR才能得到圖中所

示PCR產(chǎn)物C.過(guò)程②的產(chǎn)物都可以完成延伸過(guò)程D.若過(guò)程④得到16個(gè)突變基因則需要

消耗15個(gè)通用引物RP21234567√89101112兩種突變引物能互補(bǔ)配對(duì)，因此過(guò)程①必須分兩個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)進(jìn)行，A錯(cuò)誤；過(guò)程①至少需要3輪PCR才能得到圖中所示PCR產(chǎn)物，B錯(cuò)誤；過(guò)程②獲得的產(chǎn)物不都可以完成延伸過(guò)程，因?yàn)樽渔溨荒軓囊锏?′端開(kāi)始延伸，C錯(cuò)誤；123456789101112若過(guò)程④得到16個(gè)突變基因，由于模板中不含有通用引物，則產(chǎn)生16個(gè)突變基因共需要消耗16×2－2＝30(個(gè))通用引物，而需要通用引物RP2的數(shù)量為30÷2＝15(個(gè))，D正確。1234567891011124.反向PCR是一種通過(guò)已知序列設(shè)計(jì)引物對(duì)未知序列(圖中L、R)進(jìn)行擴(kuò)增的技術(shù)，其過(guò)程如圖所示。下列相關(guān)敘述不正確的是A.過(guò)程①用同一種限制酶對(duì)未知序列兩端進(jìn)

行切割B.過(guò)程②需要使用DNA連接酶，形成磷酸二

酯鍵C.過(guò)程③PCR體系需要添加耐高DNA聚

合酶和解旋酶D.該技術(shù)可檢測(cè)T－DNA整合到植物染色體DNA的位置1234567√89101112過(guò)程③即PCR擴(kuò)增，PCR技術(shù)中DNA解旋是在高現(xiàn)的，不需要加入解旋酶，C錯(cuò)誤。1234567891011125.(2024·泰州高三聯(lián)考)IKK激酶參與動(dòng)物體內(nèi)免疫細(xì)胞的分化。臨床上發(fā)現(xiàn)某重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)患兒的IKKβ基因編碼區(qū)第1183位堿基T突變?yōu)镃。為研究該患兒發(fā)病機(jī)制，研究人員應(yīng)用大引物PCR定點(diǎn)誘變技術(shù)獲得突變基因，如圖所示。下列說(shuō)法錯(cuò)誤的是A.PCR1中使用的引物有引物A、引物CB.PCR2中使用的引物有引物B、大引物b鏈C.PCR1過(guò)程需要擴(kuò)增3輪才能獲得目標(biāo)產(chǎn)物D.PCR2過(guò)程中，為減少錯(cuò)誤DNA片段的產(chǎn)生可適

當(dāng)升高復(fù)性1234567√89101112在PCR1中，需要兩種引物，將來(lái)在切取IKKβ基因時(shí)，在基因的左側(cè)需要用限制酶HindⅢ來(lái)切割，在基因的右側(cè)用限制酶Sac

Ⅰ切割，因此在PCR1中結(jié)合到基因右端的引物選擇引物C，從題圖中看，另一個(gè)引物應(yīng)含有突變堿基C，所以選擇引物A，A正確；123456789101112在PCR2中，有一個(gè)引物結(jié)合到了基因的左端，應(yīng)含有限制酶HindⅢ識(shí)別的序列，所以要用到引物B，而另外的一個(gè)引物就是大引物中的一條鏈，它應(yīng)該結(jié)合到基因的右端，且從5′端到3′端的序列中開(kāi)始部位應(yīng)含有Sac

Ⅰ識(shí)別的序列，從圖中看，它是大引物的b鏈，B正確；123456789101112PCR1過(guò)程主要是為了獲得大引物，則擴(kuò)增2輪即可獲得目標(biāo)產(chǎn)物，C錯(cuò)誤；由于大引物較長(zhǎng)，含C與G的堿基較多，為減少非目的基因的獲得，在PCR2復(fù)性過(guò)程中應(yīng)適當(dāng)提高，便于引物與模板鏈的結(jié)合，D正確。1234567891011126.(2024·蘇州高三調(diào)研)熒光定量PCR技術(shù)可定量檢測(cè)樣本中DNA含量，用于病毒檢測(cè)。其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入引物的同時(shí)，加入與某條模板鏈互補(bǔ)的熒光探針。當(dāng)耐高DNA聚合酶催化子鏈延伸至探針處會(huì)水解探針，使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一次，就有一個(gè)熒光分子生成(如圖)。通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，可得Ct值(熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù))。下列相關(guān)敘述錯(cuò)誤的是A.PCR每個(gè)循環(huán)包括變性、復(fù)性(引物和模板結(jié)合)、

延伸3個(gè)階段B.耐高DNA聚合酶在該反應(yīng)中的作用是形成磷

酸二酯鍵C.最終監(jiān)測(cè)的熒光強(qiáng)度與起始時(shí)反應(yīng)管內(nèi)樣本DNA

的含量呈正相關(guān)D.Ct值越大表示被檢測(cè)樣本中病毒數(shù)目越多，患者危險(xiǎn)性更高1234567√89101112Ct值越小，說(shuō)明所需循環(huán)的次數(shù)越少，被檢測(cè)樣本中病毒數(shù)目越多，D錯(cuò)誤。123456789101112二、選擇題：每小題給出的四個(gè)選項(xiàng)中有一個(gè)或多個(gè)符合題目要求。7.(2024·衡陽(yáng)高三質(zhì)檢)研究人員用圖1中質(zhì)粒和圖2中含目的基因的片段構(gòu)建重組質(zhì)粒(圖中標(biāo)注了相關(guān)限制酶切割位點(diǎn))，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌后進(jìn)行篩選及PCR鑒定。下列敘述正確的是A.構(gòu)建重組質(zhì)粒的過(guò)程應(yīng)選用BamHⅠ

和HindⅢ兩種限制酶B.使用DNA連接酶將酶切后的質(zhì)粒和

目的基因片段進(jìn)行重組C.能在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存一

定是含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌D.利用PCR鑒定含目的基因的大腸桿菌時(shí)應(yīng)選用引物甲和引物丙1234567√√89101112用限制酶BamHⅠ切割會(huì)使質(zhì)粒中的兩種標(biāo)記基因都被破壞，宜選Bcl

Ⅰ和HindⅢ兩種限制酶切割，A錯(cuò)誤；能在添加四環(huán)素的培養(yǎng)基上生存的也可能是含有普通質(zhì)粒的大腸桿菌，C錯(cuò)誤。1234567891011128.(2024·南通高三調(diào)研)如圖是被農(nóng)桿菌侵染的水稻植株的DNA片段，研究者將其連接成環(huán)，并以此環(huán)為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出T－DNA插入位置兩側(cè)的未知序列，據(jù)此來(lái)確定T－DNA插入的具體位置。下列有關(guān)說(shuō)法正確的是A.農(nóng)桿菌在自然條件下主

要侵染單子葉植物和裸

子植物，T－DNA存在

于其Ti質(zhì)粒上B.利用圖中的引物②③組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列C.若擴(kuò)增循環(huán)n次，需要2n＋1－2個(gè)引物D.將擴(kuò)增出的未知序列與水稻基因組序列比對(duì)可確定T－DNA的插入位置1234567√√89101112農(nóng)桿菌在自然條件下主要侵染雙子葉植物和裸子植物，對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒(méi)有感染能力，A錯(cuò)誤；耐高DNA聚合酶可在引物的3′端延伸子鏈，因此利用圖中的引物①④組合可擴(kuò)增出兩側(cè)的未知序列，B錯(cuò)誤；123456789101112擴(kuò)增循環(huán)n次，得到2n個(gè)DNA分子，總單鏈數(shù)為2×2n即2n＋1條，只有最初的2條母鏈不需要引物，因此共需要2n＋1－2個(gè)引物，C正確；不同的DNA分子或DNA區(qū)段具有特異性，將擴(kuò)增出的未知序列與水稻基因組序列比對(duì)可確定T－DNA的插入位置，D正確。1234567891011129.實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR技術(shù)需要在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加熒光染料或熒光探針，熒光染料能特異性摻入DNA雙鏈中，從而發(fā)出熒光信號(hào)。在流感流行季節(jié)，對(duì)懷疑流感病毒感染的患者，可以通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR技術(shù)進(jìn)行核酸檢測(cè)。下列相關(guān)敘述不正確的是123456789101112A.圖中的探針可能是利用熒光分子

標(biāo)記的流感病毒獨(dú)特的基因序列B.核酸檢測(cè)是通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)

確定樣本中是否有病毒核酸的C.PCR技術(shù)利用了DNA雙鏈復(fù)制的

原理，需要解旋酶和耐高

DNA聚合酶的催化D.用熒光RT－PCR技術(shù)測(cè)定病毒的

核酸具有特異性1234567√89101112PCR技術(shù)利用了DNA雙鏈復(fù)制的原理，不需要解旋酶，可通過(guò)高DNA雙鏈解開(kāi)，但需要耐高DNA聚合酶的催化，C錯(cuò)誤。123456789101112三、非選擇題10.(2023·江蘇，22節(jié)選)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達(dá)，運(yùn)用重組酶技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒，如圖1所示。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時(shí)，配制的兩個(gè)反應(yīng)體系中不同的有____________，擴(kuò)增程序中最主要的不同是___________。模板、引物引物的設(shè)計(jì)123456789101112PCR反應(yīng)進(jìn)行的條件：引物、酶、dNTP、模板和緩沖液(其中需要Mg2＋)。分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增片段F1與片段F2時(shí)，配制的兩個(gè)反應(yīng)體系中不同的有模板(片段F1、片段F2)、引物。PCR過(guò)程需要兩種引物，能分別與目的基因兩條鏈的3′端通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合。引物設(shè)計(jì)是決定PCR反應(yīng)成敗的最主要因素。123456789101112(2)將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌。這一過(guò)程與傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程相比，無(wú)需使用的酶主要有________________________。限制酶、(T4)DNA連接酶123456789101112傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建需要使用限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)切割質(zhì)粒，使其具有與目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA連接酶將目的基因和質(zhì)粒連接成重組質(zhì)粒。將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在DNA連接酶的作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，不需要使用限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)。123456789101112(3)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯(cuò)誤的有________。A.稀釋涂布平板需控制每個(gè)平

板30～300個(gè)菌落B.抗性平板上未長(zhǎng)出菌落的原

因一般是培養(yǎng)基高C.抗性平板上常常會(huì)出現(xiàn)大量

雜菌形成的菌落D.抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落無(wú)需進(jìn)一步劃線純化ABC123456789101112用稀釋涂布平板法培養(yǎng)計(jì)數(shù)時(shí)，為了使結(jié)果更準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)為30～300的平板，A錯(cuò)誤；培養(yǎng)基冷卻后才接種，故抗性平板上未長(zhǎng)出菌落不是因?yàn)榕囵B(yǎng)基高，B錯(cuò)誤；123456789101112轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，一般含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌才能發(fā)展為菌落，故不會(huì)出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落，C錯(cuò)誤；稀釋涂布平板法和平板劃線法均為分離純化細(xì)菌的方法，用稀釋涂布平板法接種后在抗性平板上長(zhǎng)出的單菌落無(wú)需進(jìn)一步劃線純化，D正確。123456789101112EGFP為720bp，AnB1為390bp，二者的總大小為720＋390＝1100(bp)，用引物F1－F和F2－R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其大小接近于P1、P2，根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有P3、P4。(4)為了驗(yàn)證平板上菌落中的質(zhì)粒是否符合設(shè)計(jì)，用不同菌落的質(zhì)粒為模板、用引物F1－F和F2－R進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，質(zhì)粒P1～P4的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2。根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有________。P3、P4123456789101112(5)對(duì)于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過(guò)基因測(cè)序確認(rèn)，原因是_____________________________________________________________________。1234567

電泳只能檢測(cè)DNA分子的大小(長(zhǎng)度)，無(wú)法確定待檢測(cè)DNA分子的堿基序列89101112瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)僅能用于分析待檢測(cè)DNA分子的大小，無(wú)法確定待檢測(cè)DNA分子的堿基序列，因此對(duì)于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預(yù)期的質(zhì)粒，通常需進(jìn)一步通過(guò)基因測(cè)序確認(rèn)。12345678910111211.基因工程在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用發(fā)展迅速，我國(guó)轉(zhuǎn)基因作物的種植面積在世界有較高排名。請(qǐng)回答下列相關(guān)問(wèn)題：(1)目的基因的篩選與獲取是基因工程的第一步。為提高機(jī)會(huì)和可能，目的基因往往從相關(guān)的___________________的基因中進(jìn)行篩選。1234567已知結(jié)構(gòu)和功能清晰89101112(2)目的基因可以人工合成、從中獲取，還可以利用PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增。如圖1展示了PCR技術(shù)獲取和擴(kuò)增目的基因的原理，請(qǐng)分析回答下列問(wèn)題：①PCR技術(shù)利用了DNA半保留復(fù)制原理和_____________原理。PCR的一次循環(huán)包括變性、復(fù)性和延伸三個(gè)過(guò)程，復(fù)性的作用是______________________________________。1234567堿基互補(bǔ)配對(duì)互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈結(jié)合使引物通過(guò)堿基89101112②將一個(gè)DNA分子進(jìn)行擴(kuò)增，理論上目的基因最早在第______次循環(huán)后獲得；第5次循環(huán)后，可擴(kuò)增得到______個(gè)目的基因。123456732289101112(3)反向PCR可用于擴(kuò)增未知序列，其原理如圖所示。圖中鏈狀DNA分子內(nèi)側(cè)是已知序列，外側(cè)為未知序列。請(qǐng)回答相關(guān)問(wèn)題：①EcoRⅠ酶切后得到的—AATT稱為黏性末端，“黏性”的含義是___________________________________________，EcoRⅠ切割得到黏性末端的原因是_______________________________。1234567兩個(gè)切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中心軸線兩側(cè)末端互補(bǔ)的堿基之間可以自發(fā)形成氫鍵89101112②不直接在圖2中DNA分子的兩端設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行擴(kuò)增，原因是_________________________________。③圖4中環(huán)狀DNA進(jìn)行PCR的過(guò)程中，沿引物A延伸子鏈的延伸方向是______(填“順時(shí)針”或“逆時(shí)針”)，PCR產(chǎn)物______(填“含有”或“不含”)EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)。1234567端序列未知，無(wú)法設(shè)計(jì)引物含有DNA兩逆時(shí)針8910111212.乙烯受體是乙烯感受和轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的初始元件，廣泛存在于各種植物中，并決定植物各種組織對(duì)乙烯反應(yīng)的敏感性。通過(guò)對(duì)多種植物研究表明，鈍化植物對(duì)外源乙烯的敏感性比抑制內(nèi)源乙烯的生物合成更為有效地延長(zhǎng)植物的采后壽命?？茖W(xué)家從草莓中提取乙烯受體Ers1基因，通過(guò)基因工程將Ers1基因反向連接在啟動(dòng)子后，篩選轉(zhuǎn)入反義Ers1基因的草莓，達(dá)到延長(zhǎng)儲(chǔ)藏期的效果。回答下列問(wèn)題：123456789101112(1)草莓DNA的提?。喝〔葺仓耆~片，置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨至粉碎后，加入400μLSDSDNA提取液繼續(xù)研磨，提取液中含有_____________可防止DNA被水解。待充分研磨后收集至離心管中，離心后?、儆诹硪桓蓛綦x心管中，加入200μL異丙醇，離心10min之后棄去管中的②，加入80μL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，離心5min之后取③保存。過(guò)程中的①②③分別是______________________(填“上清液”或“沉淀”)。1234567酶抑制劑DNA上清液、上清液、沉淀89101112為防止DNA被水解，提取液中應(yīng)加入DNA酶抑制劑。DNA在2mol/L的氯化鈉溶液中溶解度高，不溶于乙醇和異丙醇，待充分研磨后收集至離心管中，離心后沉淀為殘?jiān)?，DNA溶解于提取液中，故取上清液(①)于另一干凈離心管中，加入200μL異丙醇，離心10min之后棄去管中的上清液(②)，加入80μL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，離心5min之后取沉淀(③)保存。123456789101112(2)通過(guò)上述方法獲得DNA后，需要通過(guò)PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增Ers1基因(如圖1)。為使目的基因與質(zhì)粒連接，在設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增Ers1基因時(shí)需添加限制酶XhoⅠ的識(shí)別序列(5′－CTCGAG－3′)。已知Ers1基因左端①處的堿基序列為－TTCCAATTTTAA－，則其中一種引物設(shè)計(jì)的序列是5′_______________________3′。在PCR體系中，加入的dNTP可提供___________。PCR產(chǎn)物通過(guò)電泳進(jìn)行分離后，可割下______回收擴(kuò)增的Ers1基因。1234567CTCGAGTTCCAATTTTAA原料和能量凝膠89101112圖中磷酸基團(tuán)連接處為5′端，“－OH”連接處為3′端，由題意可知，Ers1基因左端①處的堿基序列為5′－TTCCAATTTTAA－3′，在設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增Ers1基因時(shí)需添加限制酶Xho

Ⅰ的識(shí)別序列(5′－CTCGAG－3′)，故其中一種引物設(shè)計(jì)的序列是5′－CTCGAGTTCCAATTTTAA－3′。在PCR