土壤生物采集實驗手冊土壤生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，涵蓋微生物、線蟲、節(jié)肢動物、環(huán)節(jié)動物等多個類群，其群落結(jié)構(gòu)與功能直接反映土壤健康狀況。為規(guī)范土壤生物采集流程，確保樣本代表性與數(shù)據(jù)準確性，本手冊基于野外調(diào)查與實驗室操作經(jīng)驗，系統(tǒng)闡述從前期準備到樣本處理的全流程操作要點。一、實驗前準備（一）工具與試劑配備1.基礎采集工具：需根據(jù)目標生物類群選擇適配工具。微生物采集需無菌不銹鋼土鉆（直徑5cm，長度30cm）、無菌鋁盒（50mL）、一次性無菌手套（無粉丁腈材質(zhì)）；線蟲采集常用小型取土鏟（寬10cm，厚2mm）、塑料自封袋（25×35cm，厚0.08mm）；中小型節(jié)肢動物（如螨類、跳蟲）需Tullgren干漏斗裝置（包括40目篩網(wǎng)、25W白熾燈、500mL玻璃收集瓶）；大型土壤動物（如蚯蚓、馬陸）需尖頭鐵鍬（刃寬20cm）、軟毛刷（毛長1.5cm）、塑料托盤（50×30cm）。所有金屬工具使用前需用75%乙醇擦拭3遍，微生物采樣工具需額外經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。2.保存與固定試劑：微生物樣本需臨時保存于4℃冰盒（內(nèi)置藍冰，容量2L）；線蟲固定液為4%福爾馬林溶液（甲醛:水=1:24），或用70%乙醇（含5%甘油防干縮）；中小型節(jié)肢動物保存液為75%乙醇（含2%甘油），大型動物可用5%福爾馬林溶液（需提前用碳酸氫鈉中和至pH7.0）。所有試劑需提前分裝于50mL離心管（微生物）、250mL廣口瓶（線蟲）、500mL細口瓶（節(jié)肢動物），標注名稱與配制日期。3.輔助工具：包括GPS定位儀（精度±1m）、土壤濕度計（測量范圍0-100%）、pH試紙（范圍4.0-9.0）、卷尺（5m）、記錄板（防水材質(zhì)）、油性記號筆（耐酒精）、標簽紙（防水防油）。（二）采樣點規(guī)劃采樣點選擇需兼顧代表性與均勻性。若為區(qū)域生態(tài)調(diào)查，應覆蓋不同植被類型（如森林、草地、農(nóng)田）、土壤類型（如紅壤、黑土、褐土）及地形（平地、坡地、洼地）；若為污染監(jiān)測，需在污染區(qū)（核心區(qū)、過渡區(qū)）與對照區(qū)（距離污染源500m外）設置樣點。每個樣地至少設置5個重復樣點，樣點間距≥10m（避免重疊干擾）。采樣前需用GPS記錄樣點經(jīng)緯度（精確至秒），測量海拔（±5m）、坡度（量角器測量）、坡向（羅盤確定），記錄優(yōu)勢植物種類（如草本為狗尾草、灌木為荊條）及覆蓋度（目測法分5級：0-20%、20-40%…80-100%）。二、現(xiàn)場采集操作（一）微生物采集1.分層采樣：微生物主要分布于0-20cm土層，需按0-10cm（表層）、10-20cm（亞表層）分層采集。清除地表凋落物（厚度＞2cm時用毛刷輕掃），用無菌土鉆垂直插入土壤至目標深度，旋轉(zhuǎn)取出土芯（避免擠壓），剔除石塊、根系等雜物，迅速裝入無菌鋁盒（裝至8分滿，預留膨脹空間）。每個樣點采集3個土芯（間距50cm），混合后取20g作為該層樣本，重復3次。2.避免交叉污染：每采集完一個樣點，土鉆需用75%乙醇擦拭，待酒精揮發(fā)后再用于下一樣點。鋁盒密封前需用記號筆標注樣點編號（如S1-0-10，S代表土壤，1為樣點號，0-10為深度）、時間（精確至分鐘）、采集人。樣本需立即放入冰盒（溫度保持4±1℃），24小時內(nèi)送實驗室處理。（二）線蟲采集1.土樣獲?。壕€蟲多分布于0-30cm土層，以10-20cm最密集。用取土鏟挖取20×20×30cm的土坑，從坑壁分層（0-10cm、10-20cm、20-30cm）取土，每層取500g（約一捧），裝入自封袋（排出空氣后密封）。注意避免土壤過干（濕度＜10%時線蟲活性低）或過濕（＞60%時易黏連），若遇雨天需等待地表干燥24小時后再采樣。2.臨時保存：自封袋外標注樣點編號（如N1-10-20，N代表線蟲）、深度、時間，置于陰涼處（溫度≤25℃），4小時內(nèi)送至實驗室。若需長途運輸，可加入濕潤濾紙（保持濕度80%），避免陽光直射。（三）中小型節(jié)肢動物采集（螨類、跳蟲）1.Tullgren干漏斗法：適用于干燥或半干燥土壤。采集時取500g原狀土（保留土壤結(jié)構(gòu)），剔除直徑＞2cm的石塊，放入漏斗篩網(wǎng)（篩孔2mm），漏斗下接收集瓶（內(nèi)裝75%乙醇）。開啟白熾燈（距土樣20cm），調(diào)節(jié)溫度至35±2℃（用溫度計監(jiān)測），持續(xù)48小時。節(jié)肢動物因趨濕避光向下移動，落入收集瓶保存。2.Baermann濕漏斗法：適用于濕潤土壤（如沼澤、稻田）。將土樣包裹于紗布（100目），放入漏斗（內(nèi)裝蒸餾水至浸沒土樣2/3），漏斗下接離心管（內(nèi)裝少量水）。靜置24小時，線蟲、緩步動物等因重力下沉至離心管，取出離心管后低速離心（1000r/min，5分鐘），上清液棄去，沉淀用固定液保存。（四）大型土壤動物采集（蚯蚓、馬陸）1.手撿法：在樣點內(nèi)挖取50×50×30cm的土坑，將土壤分層（0-10cm、10-20cm、20-30cm）倒在塑料托盤上，用軟毛刷輕撥土壤，挑出可見動物（體長＞2mm）。注意動作輕柔，避免損傷蚯蚓體壁（易斷裂）。2.甲醛誘導法：若手撿法遺漏率高（如蚯蚓鉆入深層），可在樣點表面均勻噴灑0.5%甲醛溶液（每平方米2L），5-10分鐘后蚯蚓因刺激爬出地表，用鑷子夾?。ū苊庵苯佑檬郑乐桂ひ何廴荆?。采集后立即用清水沖洗（30秒），去除體表甲醛。三、樣本處理與保存1.微生物：實驗室需在48小時內(nèi)處理，稱取1g土樣加入9mL無菌水，震蕩10分鐘（200r/min），梯度稀釋（10?1至10??）后涂布平板（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基），30℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)菌落形成單位（CFU）。2.線蟲：將500g土樣加入2000mL水，攪拌后靜置30秒（粗顆粒下沉），將上層懸浮液過200目篩（孔徑75μm），再用500目篩（孔徑30μm）收集線蟲。收集物經(jīng)離心（2000r/min，10分鐘）后，用4%福爾馬林固定，保存于10mL離心管（標注編號、日期）。3.節(jié)肢動物：Tullgren漏斗收集液需在72小時內(nèi)更換新鮮75%乙醇（避免揮發(fā)導致樣本干燥），用體視顯微鏡（10-40倍）分類計數(shù)，記錄類群（如甲螨、跳蟲）及數(shù)量。4.大型動物：用5%福爾馬林固定24小時后，轉(zhuǎn)移至70%乙醇長期保存（福爾馬林易使標本變硬）。蚯蚓需舒展身體（用玻棒輕撥），避免卷曲影響形態(tài)觀察；馬陸需保持附肢完整（用細鑷子整理）。四、數(shù)據(jù)記錄與注意事項（一）記錄要求需建立標準化記錄表，包含以下內(nèi)容：-樣點信息：編號、經(jīng)緯度、海拔、地形（平地/坡地）、坡度（°）、坡向（東/南/西/北）；-環(huán)境參數(shù)：日期（年/月/日）、時間（時:分）、天氣（晴/陰/雨）、氣溫（℃）、土壤濕度（%）、pH值；-植被信息：優(yōu)勢種（如楊樹、小麥）、覆蓋度（%）、凋落物厚度（cm）；-采集信息：深度（cm）、工具（土鉆/鐵鍬）、樣本量（g）、保存方法（冰盒/乙醇）；-生物記錄：類群（細菌/線蟲/跳蟲）、數(shù)量（個/g或個/m2）、異常情況（如樣本污染、動物死亡）。（二）關鍵注意事項1.生態(tài)保護：采集后需將土坑回填（分層歸位），恢復地表植被（如覆蓋原凋落物），避免破壞生境。每個樣地采集面積不超過總面積的1%（如100m2樣地采集＜1m2）。2.安全操作：接觸福爾馬林時需佩戴防毒面具（濾毒盒類型：有機氣體），在通風櫥內(nèi)操作；使用酒精時遠離火源（實驗室需備滅火器）；野外采樣需穿高幫防水