湖南省豬、雞源糞腸球菌的多點位序列分型分析MULTIPOINTSEQUENCETYPINGOFENTEROCOCCUSFAECALISFROMPIGSANDCHICHENSINHUNANPROVINCE目錄摘要……………1關(guān)鍵詞…………11前言………………22材料與方法………………………22.1菌株來源……………………2試劑和儀器…………2方法…………………22.3.1細(xì)菌核酸的提取…………………22.3.2MLST基因檢測……………………22.3.3統(tǒng)計學(xué)分析………………………23結(jié)果與分析……………33.1糞腸球菌7個管家基因的PCR擴增結(jié)果………………33.2多位點序列分型結(jié)果……………33.3eBURST軟件分析結(jié)果……………53.4不同地區(qū)、不同動物來源糞腸球菌的ST型比較………………6參考文獻………………………8致謝………………8湖南省豬、雞源糞腸球菌的多點位序列分型分析摘要：目的對湖南省豬、雞源糞腸球菌進行多位點序列分型分析（MLST）,分析湖南省地區(qū)的豬、雞源糞腸球菌的分子分型情況。方法對實驗室收集的湖南省常德、瀏陽、衡陽、寧鄉(xiāng)的豬、雞源糞腸球菌共35株，通過對豬雞源糞腸球菌的7個管家基因序列對35株糞腸球菌進行多位點序列分型分析。結(jié)果35株測試的糞腸球菌一共分為21個ST型，在這21個ST型中，17個豬源糞腸球菌分離株共分為11個ST型，18個雞源糞腸球菌分離株共包含10個ST型。21個糞腸球菌ST型分為了3個組別與10個獨立型，ST16處于核心位置，是eBURST經(jīng)運算推測的試驗菌株的祖先ST。試驗的優(yōu)勢CC群包括4個，包括CC16、CC480、CC476及CC4，位于CC16的6個ST型（16、363、372、541、265、553）在本次實驗中所覆蓋的糞腸球菌數(shù)量最多，總共包含10株菌，占總數(shù)的28.6%（10/35），且大多為豬源糞腸球菌（7/10），位于CC480的3個ST型總共包括6株菌，其中，寧鄉(xiāng)豬源含2株、雞源含1株，衡陽雞源1株，常德雞源2株；位于同一CC群的ST476與ST828，共包含5株菌，且均來自豬源；位于CC4的菌株有4株，且均為雞源關(guān)鍵詞：豬、雞源糞腸球菌；多位點序列分析Multipoint

sequence

typing

of

Enterococcus

faecalis

from

pigs

and

chickens

in

Hunan

ProvinceAbstract:ObjectiveAnalysis

of

multiple

site

sequence

typing

of

Enterococcus

faecalis

from

pigs

and

chickens

in

Hunan

Province

(MLST),Analysis

of

molecular

typing

of

Enterococcus

faecalis

from

pigs

and

chickens

in

Hunan.Methods

35

strains

of

Enterococcus

faecalis

from

pigs

and

chickens

pigs

and

chickens,

Liuyang,

Hengyang

and

Ningxiang

of

Hunan

Province

were

analyzed

by

multi-site

sequence

typing

of

7

housekeeping

gene

sequences

of

Enterococcus

faecalis

from

pigs

and

chickens.Results

Thirty-five

strains

of

Enterococcus

faecalis

were

divided

into

21

ST

strains,

of

which

17

were

divided

into

11

ST

isolates

and

18

were

composed

of

10

ST

isolates.

The

21

ST

types

were

divided

into

3

groups

and

10

independent

types,

ST16

were

in

the

core

position

and

were

the

ancestor

ST

of

the

tested

strains

eBURST

calculated.The

dominant

CC

groups

in

the

experiment

included

4,

including

6

ST

types

(16,363,372,541,265,553)

located

in

the

CC16,

covering

the

largest

number

of

Enterococcus

faecalis

in

this

experiment,

containing

a

total

of

10

strains,

accounting

for

28.6%

of

the

total

(10/35).Most

of

them

were

Enterococcus

faecalis

(7/10),

and

the

three

ST

types

located

in

CC480

included

6

strains

in

total.There

were

2

strains

in

Ningxiang

,1

strain

in

chicken

,1

strain

in

Hengyang

and

2

strains

in

Changde.

There

were

5

strains

in

ST476

and

ST828,

in

the

same

CC

group,

all

from

pig.Four

strains

were

located

in

the

CC4,

all

of

which

were

chickenderivedKeywords:Enterococcus

faecalis

from

pigs

and

chickens；Multiple-site

sequence

analysis1前言腸球菌原屬于鏈球菌屬,是一種革蘭陽性菌REF_Ref41248041\r[1],廣泛分布于多種生物體內(nèi)體外,對高溫，強酸，高鹽濃度環(huán)境有較強的耐受性REF_Ref41249241\r[2]REF_Ref41249243\r[3]。腸球菌引發(fā)多種食源性動物疫病,能引起動物腹瀉,給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大打擊,并威脅人類的公共衛(wèi)生健康REF_Ref41251258\r[4]REF_Ref41251261\r[5],臨床分離的腸球菌中,糞腸球菌約占80%~90%,而屎腸球菌只占5%~10%。糞腸球菌是腸球菌屬中重要的感染致病菌，可以引起皮膚感染REF_Ref41252396\r[6]，尿路感染等疾病REF_Ref41252413\r[7]REF_Ref41252414\r[8]，通過對豬、雞源糞腸球菌的多位點序列分型，了解糞腸球菌的來源和遺傳背景，為畜禽養(yǎng)殖業(yè)中糞腸球菌感染提供預(yù)防治療措施，減少畜禽養(yǎng)殖業(yè)的損失，糞腸球菌是表示抗菌藥物耐藥性水平的一種革蘭氏陽性指示菌,因此有必要對豬、雞源分離糞腸球菌的基因序列情況進行分析和研究REF_Ref41252451\r[9]。另外糞腸球菌也是重要的益生菌，生長繁殖快，能耐受胃腸道環(huán)境對大腸桿菌O1和O78有一定的抑制作用REF_Ref41252474\r[10]，其中菌株DY-F03具有重要的益生性能和抗逆性,為開發(fā)優(yōu)良的微生態(tài)制劑提供菌種資源REF_Ref41252490\r[11]。目前，在人類社會公共安全問題上，糞腸球菌已經(jīng)成為醫(yī)院感染的一種重要病原，近年在臨床上由糞腸球菌引起的感染有逐年上升趨勢,已成為呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、傷口感染、院內(nèi)感染的常見菌,并對多種抗菌藥物耐藥REF_Ref41253021\r[12]REF_Ref41253023\r[13]REF_Ref41253024\r[14]REF_Ref41253025\r[15]REF_Ref41253027\r[16]，在動物領(lǐng)域，近年來,豬、雞感染糞腸球菌發(fā)病和死亡的報道越來越多REF_Ref41253052\r[17]REF_Ref41253053\r[18]REF_Ref41253054\r[19]REF_Ref41253055\r[20]。.2材料與方法2.1菌株來源實驗室收集的湖南省常德、衡陽、瀏陽、寧鄉(xiāng)的豬、雞源糞腸球菌共35株2.2試劑和儀器PCR擴增儀，全自動凝膠成像系統(tǒng)，Vitek-2Compack全自動微生物分析系統(tǒng)，恒溫金屬浴，PCR擴增試劑盒2.3方法2.3.1細(xì)菌核酸提取：在1ml的PE管中加入100μl的無菌水，選取10個單一菌落與EP管內(nèi)，100℃金屬浴煮12min，1200r/min離心5min，取上清作為PCR擴增的模板，放置在-20℃冰箱中保存待用。2.3.2MLST基因檢測：糞腸球菌的7對管家基因（aroE；gdh；gki；gyd；pstS；xpt；yqiL）進行PCR擴增，PCR擴增7個管家基因的目的片段。PCR程序如下：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s；按照各管家基因特異性引物要求的退火溫度設(shè)置，時間為30s，72℃延伸40s（35個循環(huán)）；72℃7min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，進行測序。將7個管家基因序列的測序結(jié)果在MLST網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫上進行對比，獲得每一個管家基因的等位號碼，綜合起來所以的等位號碼來確認(rèn)序列的型號，2.3.3統(tǒng)計學(xué)分析將測序的產(chǎn)物序列提交至MLST數(shù)據(jù)庫進行比對，確定菌株的各個等位基因的序號并提交數(shù)據(jù)庫可得到菌株確定的序列型，即ST型。應(yīng)用eBURST軟件分析所有菌株的MLST結(jié)果及其在整個糞腸球菌數(shù)據(jù)庫中的分布情況，通過繪制聚類分析圖來研究各個實驗菌株ST型之間的親緣關(guān)系。3結(jié)果與分析3.1糞腸球菌7個管家基因的PCR擴增結(jié)果35株分離菌的7個管家經(jīng)PCR擴增、1%的凝膠電泳后，均得到清晰且單一的目的條帶，部分分離株的電泳結(jié)果見圖1。圖1部分菌株7個管家基因擴增結(jié)果Table5-1Amplificationresultsof7housekeepinggenesinpartialstrains注：M為DNA分子Marker；1-aroE；2-gdh；3-gki；4-gyd；5-pstS；6-xpt；7-yqiL3.2多位點序列分型結(jié)果35株糞腸球菌一共分為21個ST型，其中包括ST32型3株，ST16型4株，ST4763株，ST480型4株；ST828、ST903、ST553、與ST416型各包含兩株；除此之外，其余序列型在本次試驗中均只包含1個菌株。在本次試驗的ST型中，ST16型與ST553、ST541、ST265、以及ST363型之間存在6個相同的等位基因序列號，僅在一個位點存在差異，與ST372型也只存在2個位點的差異；ST480與ST663型僅在gdh基因處存在不同，與ST846僅在gdh和yqiL基因處存在不同；ST476與ST828也只有一處等位基因不同。35株糞腸球菌分型結(jié)果具體見表1。表1糞腸球菌15個ST型的等位基因譜Table5-2Allelespectrumof15STtypesinEnterococcusfaecalis菌株編號ST型等位基因編號gdhgydpstSgkiaroExptyqiLJY15ST165113776LX1ST165113776A29ST165113776X7ST165113776JY8ST-328795441JY23ST-328795441BY5ST-328795441B3ST-37251137769Q4ST-903982932431727B9ST-3348175441A30ST-4761721314141LX16ST-4761721314141A20ST-4761721314141X13ST-5535113476B2ST-4801122227176A22ST-4801122227176A24ST-4801122227176Q7ST-4801122227176X15ST-538127317625SM3ST-2655113976B3ST-55512137815B15ST-416115116111310Q29ST-416115116111310X16ST-828421314141SM15ST-828421314141Q16ST-36320113776B6ST-618149181016212A23ST-82346748120JH11ST-82617171314101B8ST-903982932431727LX4ST-4943771411Q9ST-84611222271769JH16ST-5535113476JY28ST-66383122227176X20ST-54151131763.3eBURST軟件分析結(jié)果本次研究通過該軟件成功構(gòu)建了21個ST型的克隆圖譜（圖1），由圖可知，21個ST型分為了3個組別與10個獨立型。圖中ST16處于核心位置，是eBURST經(jīng)運算推測的試驗菌株的祖先ST型（即Founder），ST553、ST363、ST265、ST372以及ST541型以它為中心，與該型的親緣關(guān)系較近。組別2由ST480、ST663及ST846組成，組別3由ST476和ST828組成。10個獨立序列型分別為ST538、ST823、ST903、ST494、ST556、ST416、ST334、ST32、ST826和ST618，它們的親緣關(guān)系較為疏遠(yuǎn)。圖135株糞腸球菌21個ST型的eBRUST圖pig5-1TheeBURSTmapabout21STsof35Enterococcusfaecalis注：圓圈及數(shù)字代表具體ST型，圓圈的大小代表位于該ST型的菌株數(shù)，線段連接的ST型代表位于同一CC群到目前為止，糞腸球菌PubMLST數(shù)據(jù)中已發(fā)現(xiàn)的ST型共913種（/efaecalis/），將本試驗的21個ST型與整個數(shù)據(jù)庫的ST型一起導(dǎo)入該軟件進行分析，結(jié)果見圖2。在7個管家基因中，擁有5個及5個以上相同等位基因編號的ST屬于同一個復(fù)合克隆群（ClonalComplex，CC），本次試驗的優(yōu)勢CC群包括4個，包括CC16、CC480、CC476及CC4。圖中ST型16及其周圍的變異體組成的克隆群為CC16，該克隆群中ST16型占據(jù)核心位置，為該子群的祖先序列型，且根據(jù)糞腸球菌數(shù)據(jù)庫的相關(guān)信息，ST16型的菌株在世界范圍內(nèi)均有分布，且這些菌株的來源包括人及動物。ST663與ST846位于克隆復(fù)合群480（CC480），ST32與ST334位于克隆群4（CC4），ST828與ST476也屬于同一克隆群476（CC476）。除優(yōu)勢CC群外，位于CC6、CC403、CC259、CC59等群中糞腸球菌在本次試驗中也有少數(shù)分布。還有部分ST型較為獨立，如ST826等，不形成復(fù)合克隆群。圖2糞腸球菌MLST全局分布圖Pig5-2MLSTglobaldistributionmapofEnterococcusfaecalis注：圖中紅色圓圈標(biāo)注的為本實驗和糞腸球菌數(shù)據(jù)庫中共有的ST型，位于中心的藍色圓圈為該克隆群的祖先ST型，線段連接的ST型位于同一克隆復(fù)合群3.4不同地區(qū)、不同動物來源糞腸球菌的ST型比較對35株糞腸球菌的ST型進行比較得出，不同地區(qū)不同動物來源的糞腸球菌擁有豐富的ST型。其中，17個豬源分離株共分為11個ST型，18個雞源分離株共包含10個ST。位于CC16的6個ST型（16、363、372、541、265、553）在本次實驗中所覆蓋的糞腸球菌數(shù)量最多，總共包含10株菌，占總數(shù)的28.6%（10/35），這些菌株在寧鄉(xiāng)、衡陽等地區(qū)均有分布，且大多為豬源糞腸球菌（7/10）。位于CC480（ST480、ST663、ST846）的3個ST型總共包括6株菌，其中，寧鄉(xiāng)豬源含2株、雞源含1株，衡陽雞源1株，常德雞源2株；位于同一CC群的ST476與ST828，共包含5株菌，且均來自豬源；位于CC4（ST32、ST334）的菌株有4株，且均為雞源。除此之外，其它CC群以及余下的獨立ST型在不同地區(qū)的豬、雞源分離株中均有少量分布。表2部分ST型在不同地區(qū)、不同來源糞腸球菌中的分布情況Table5-2DistributionofpartialSTtypesindifferentregionsanddifferentsourcesofEnterococcusfaecalis序列型菌株數(shù)量總計寧鄉(xiāng)豬源雞源衡陽豬源雞源常德豬源雞源瀏陽豬源雞源ST16201100004ST363000001001ST372010000001ST541100000001ST265000010001ST553101000002ST480100001114ST663000100001ST846000001001ST476201000003ST828000010102ST32020100003ST334010000001參考文獻幸文定.江西部分地區(qū)豬源糞腸球菌耐藥性及毒力基因檢測與分析[D].江西農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.PissettiC,CamposT,WerlangGO,etal.AntimicrobialresistanceinEscherichiacoliandEnterococcussp.isolatedfromswinecarcassesatthepre-chillstage[Z].SafeporkProc,2013:203-206.TremblayC,LetellierA,QuessyS,etal.Antibiotic-resistantEnterococcusfaecalisinabattoirpigsandplasmidcolocalizationandcotransferoftet(M)anderm(B)genes[J].JFoodProt,2012,75(9):1595-1602.NamHM,LimSK,MoonJS,etal.AntimicrobialresistanceofenterococciisolatedfrommastiticbovinemilksamplesinKorea[J].ZoonosesandPublicHealth,2009,57(7-8):e59-e64.BeshiruA,IgbinosaIH,OmejeFI,etal.Multi-antibioticresistantandputativevirulencegenesignaturesinEnterococcusspeciesisolatedfrompigfarmsenvironment[J].MicrobPathog,2017,104:90-96.張凡,鄺捷.皮膚糞腸球菌感染一例[J].實用皮膚病學(xué)雜志,2015,8(06):465-466.楊仁國,王蜀強,龍姍姍,喻華,黃仁剛,林健梅,徐開菊,楊興祥.復(fù)雜性尿路感染243例病原菌構(gòu)成及藥敏分析[J].中國抗生素雜志,2017,42(12):1050-1055.李金磊,董鵬,狄元冉,方忠意,高延玲,周紅霞,吳志明.河南省部分地區(qū)豬和雞源糞腸球菌的分離鑒定與耐藥性分析[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2018,39(04):122-127.朱娜,方超,周成捷,等.湖南省豬源腸球菌的分離鑒定[J].湖南畜牧獸醫(yī),2016(2):41-44.鮑延娥,董曉芳,佟建明,高玉鵬,劉炎.糞腸球菌益生特性的體外評價[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2013,22(11):202-207.胡紅偉,段明房,閆凌鵬,麻嘯濤,陳茹茹,趙帥,李自茹.產(chǎn)細(xì)菌素糞腸球菌的分離、鑒定及體外益生特性研究[J].飼料廣角,2017(11):27-32劉鳳強,姬生瑞.檢出160株腸球菌的分布及耐藥性分析[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2005(09):1879+1874.商軍,顧欣,張文剛,姜芹,孫冰清.豬、雞源分離糞腸球菌的核糖體分型及耐藥性分析[J].中國抗生素雜志,2017,42(03):230-236.王送林,李蕓芳,劉秋菊,朱娜,蔣偉,鄧治邦,黎滿香.湖南省豬源糞腸球菌耐藥性分析[J].中國動物傳染病學(xué)報,2015,23(02):41-46.施宏,陳書韻,楊狄,任緒義.浙江地區(qū)臨床分離糞腸球菌的多位點序列