槲皮素對H2O2作用PIEC細(xì)胞增殖的影響IDENTIFICATIONOFPIECANDEFFECTOFQUERCETINONPROLIFERATIONOFPIECINDUCEDBYH2O2目錄摘要………………1關(guān)鍵詞……………11前言……………21.1槲皮素的相關(guān)研究…………21.1.1槲皮素的藥理研究...……………21.2其他研究進(jìn)展……………32材料與方法……………………42.1試驗(yàn)材料…………………42.2PIEC鑒定…………………42.3不同濃度的QCT對PIEC增殖的影響……………42.4統(tǒng)計(jì)分析………………53結(jié)果與分析…………………53.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)與免疫熒光染色鑒定………………53.2不同濃度QCT對PIEC活力的影響…………63.3不同濃度的QCT對H2O2作用的PIEC活力的影響……………64討論…..…………….…75結(jié)論…..……………7參考文獻(xiàn)……………………8致謝………………………10槲皮素對H2O2作用PIEC細(xì)胞增殖的影響摘要：為探討不同濃度的槲皮素（quercetin,QCT）對H2O2作用的豬髖動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（porcineiliacarteryendothelialcells,PIEC）增殖的影響，采用人第Ⅷ因子免疫熒光抗體檢查法鑒定所購買的細(xì)胞系并體外培養(yǎng)，將細(xì)胞分為空白對照組、H2O2干預(yù)組、QCT組（5、10、10μM），于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并用MTT法測定PIEC相對活力。結(jié)果顯示，細(xì)胞呈典型的鵝卵石或鋪路石狀鑲嵌排列，經(jīng)人第Ⅷ因子免疫熒光抗體檢查法鑒定為PIEC；QCT明顯提高H2O2作用的PIEC活力，且存在劑量依賴關(guān)系。關(guān)鍵詞：槲皮素；豬髖動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞；鑒定；MTT；增殖IDENTIFICATIONOFPIECANDEFFECTOFQUERCETINONPROLIFERATIONOFPIECINDUCEDBYH2O2Abstract：InordertoinvestigatetheeffectofstannicchlorideonimmuneinjuryofchicksBursaofFabricius.120chickswererandomlydividedinto4groups.Theexperime-ntgroupadded400mg/kg,800mg/kgand1200mg/kgstannouschloride(SnCl2)tothedietrespectively.Onthe7th,14th,21st,28th,35thand42nddaysofthetestrespectively,5animalswererandomlyselectedfromtheexperimentalgroupandthecontrolgroup.AftertheBursaofFabriciusistakenoutandhomogenized,thecontentsofIgA,IgMandIgGintheBursaofFabriciusofchicksineachgroupofdifferentagesofdayweremeasuredbyELISA.Theresultsshowthatwhenthecontentofstannouschloride(SnCl2)inthetestgroupexceeds400mg/kg,thecontentsofIgMandIgGintheBursaofFabriciusofchicksweresignificantlyreduces,causingtoxiceffectsonchicks,However,thedecreaseofimmunolob-ulinandlymphocytesecretionisthedirectcauseoftheimpairmentofimmunefunctionofBursaofFabriciusKeywords:SnCl2;ImmuneinjuryofBursaofFabricius;ELISA;immunologicfunction1前言槲皮素(Quercetin;3,3',4',5',5,7-Pentahydroxyflavone),異名櫟精、槲皮黃素,化學(xué)名3，3，，4，，5，7-五羥黃酮，分子式C15H10O7,相對分子質(zhì)量302.24。為黃色粉末(甲醇)，其二水合物為黃色針狀結(jié)晶。[1]槲皮素可以通過酸水解得到，它是一種天然植物源性膳食黃酮，存在于花卉、樹葉、茶葉、漿果、蘋果等多種植物的常見食物中，主要以糖苷形式存在，如蘆丁、槲皮素、金絲桃苷等。[2-3]許多中藥，如槐米、側(cè)柏、冬花、桑寄生、三七、銀杏等，都含有這種成分；尤其是蕎麥葉、沙棘、山楂、洋蔥的含量較高。[4]本世紀(jì)初至今，國內(nèi)外學(xué)者對槲皮素的提取、純制備、結(jié)構(gòu)測定、理化性質(zhì)、合成衍生物、藥理及臨床應(yīng)用等方面進(jìn)行了大量的研究。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血液與血管壁之間的屏障。內(nèi)皮細(xì)胞具有細(xì)胞通透性、選擇性屏障和抑制作用血液、抗凝、纖維蛋白溶解、血液運(yùn)輸、血管活性物質(zhì)代謝、血管舒縮力調(diào)節(jié)、生長因子的產(chǎn)生、纖維基質(zhì)的增殖等;參與炎癥反應(yīng)[5]，影響血管生成、血管通透性和體液平衡等。血管內(nèi)皮細(xì)胞是覆蓋血管腔表面的連續(xù)單層扁平細(xì)胞，正常成人血管內(nèi)皮細(xì)胞約1×1012個。血管內(nèi)皮的主要功能是屏障功能。同時，血管內(nèi)皮具有重要的內(nèi)分泌功能，可以從內(nèi)皮合成和釋放多種血管激活因子，具有多種生理功能。1.1槲皮素的相關(guān)研究1.1.1槲皮素的藥理作用大多數(shù)研究表明槲皮素不會致癌，而且槲皮素在人類中具有良好的耐受性。它作為一種潛在的化學(xué)抗癌藥物，能抑制許多腫瘤細(xì)胞的生長，其作用機(jī)制主要有：細(xì)胞周期的阻斷、抑癌基因表達(dá)調(diào)控、誘使細(xì)胞凋亡、浸潤轉(zhuǎn)移等；槲皮素能抑制淋巴細(xì)胞增殖來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用；槲皮素具有較好的止咳、化痰、平喘功效，對血壓血脂的降低、毛細(xì)血管脆性的減少、毛細(xì)血管阻力的增強(qiáng)、冠狀動脈擴(kuò)張、冠脈血流量增加等作用；槲皮素還具有顯著的抗氧化作用，主要通過直接消耗活性氧自由基、清除自由基、鰲合金屬離子以及抑制低密度脂蛋白氧化損傷，進(jìn)而在內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷過程中發(fā)揮保護(hù)作用。但是到目前為止，把槲皮素作為主要的成分來制藥，并且投入臨床使用的藥物少之又少，盡管現(xiàn)在對槲皮素作用的研究越來越廣泛，但是都處于臨床前階段，所以盡管槲皮素有許多的藥理作用，但是卻沒有得到很好的臨床應(yīng)用，因此在這一塊的研究也十分的重要。槲皮素來源廣泛而且容易得到，很多的體外實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)都表明它具有廣闊的應(yīng)用前景，有希望能夠在抗擊癌癥，抗氧化纖維化，抗炎癥，以及心血管的保護(hù)等臨床上扮演重要的角色，在未來的實(shí)驗(yàn)研究中，

進(jìn)一步的開展大規(guī)模樣本的臨床研究和論證，就助于增快槲皮素的利用，新成分藥物的發(fā)明是一項(xiàng)大規(guī)模任務(wù)，需要進(jìn)一步的研究它的藥代動力學(xué)，毒性等方面，才能確保臨床用藥的安全有效，在不久的將來，以槲皮素為主要成分的保健食品與新藥物，將會為各種病的康復(fù)和治療發(fā)揮大作用，能更加豐富和完備人類的醫(yī)學(xué)資源寶庫。研究者們多以人內(nèi)皮細(xì)胞[6-8]探究槲皮素對其增殖影響和氧化損傷的保護(hù)作用，而對于豬等內(nèi)皮細(xì)胞研究較少。但氧化應(yīng)激是動物出現(xiàn)心血管疾病、代謝相關(guān)疾病以及神經(jīng)紊亂等綜合病癥的主要原因之一，對畜牧業(yè)的發(fā)展危害極大，本文從畜牧養(yǎng)殖方面考慮，以豬髖動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（porcineiliacarteryendothelialcells,PIEC）為試驗(yàn)材料，通過對PIEC鑒定、不同濃度的槲皮素對PIEC增殖的影響統(tǒng)計(jì)分析[9,10]，利用PIEC經(jīng)免疫熒光染色后，觀察細(xì)胞核和接觸抑制情況[9]。通過不同濃度的槲皮素對H2O2作用的PIEC活力的影響，探究槲皮素對H2O2作用的PIEC增殖的影響，以便為后續(xù)槲皮素用作PIEC氧化損傷保護(hù)的研究提供參考。1.2其它研究進(jìn)展楊翠霞等采用細(xì)胞計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞儀等方法，檢測o-H-A在內(nèi)皮細(xì)胞中的作用。對Scr激酶，絲裂素A，蛋白激酶M激酶(ErK-1/2)磷酸化的激活和細(xì)胞周期蛋白D1到rSC-MAPK信號通路的表達(dá)水平參與透明質(zhì)酸寡糖誘導(dǎo)PIEC細(xì)胞增殖進(jìn)行了研究[13]；河南大學(xué)劉紅亮、胡磊采用MTT比色法檢測槲皮素對PC12細(xì)胞增殖的影響。建立H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷模型,分析槲皮素對PC12細(xì)胞H2O2損傷的保護(hù)作用；比較分析槲皮素保護(hù)組和對照組PC12細(xì)胞的活性氧水平和丙二醛含量，檢測其抗氧化作用。對槲皮素超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性的比較分析及抗氧化機(jī)制的初步研究[14]；重慶醫(yī)科大學(xué)的安昌勇致力于探索槲皮素對結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞增殖能力的影響。他通過細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞增殖活性測定和細(xì)胞克隆，分析了槲皮素對LOVO細(xì)胞系增殖的影響，為槲皮素潛在的抗結(jié)腸癌作用提供了理論依據(jù)[15]；鄧曉慧用不同濃度的槲皮素治療卵巢癌SKOV3細(xì)胞，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制情況，并計(jì)算抑制率。利用免疫化學(xué)染色檢測細(xì)胞凋亡、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡；得出結(jié)論——槲皮素在體外可抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖，阻止細(xì)胞從S期向G2期遷移，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為卵巢癌的臨床治療提供依據(jù)[16]；山西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院孫怡,顧君為了研究槲皮素對乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231轉(zhuǎn)移的影響及其作用機(jī)制，通過劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell分析，考察了槲皮素對mdamb-231級電機(jī)性能的影響。采用Westernblotting研究槲皮素對mda-mb-231細(xì)胞中整合素3,1、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(mmp-2)和mmp-9蛋白表達(dá)的影響。槲皮素和整合素通過虛擬對接技術(shù)進(jìn)行體外評價(jià)。得出結(jié)果:槲皮素能抑制丙二醛-甲基溴-231細(xì)胞的增殖，且呈劑量依賴性。在Woundhealing實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，MDA-MB-231的遷移數(shù)隨著槲皮素濃度的增加而減少。隨著槲皮素濃度的增加，乳腺癌細(xì)胞的侵襲能力呈下降趨勢。槲皮素能抑制整合素β3蛋白的表達(dá)，呈劑量依賴性，但對整合素β1的表達(dá)不明顯。此外，槲皮素能顯著抑制基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的蛋白表達(dá)。計(jì)算機(jī)虛擬對接結(jié)果顯示槲皮素與整合素β3的結(jié)合能力較低，表明槲皮素與整合素β3具有良好的親和力[17]。2材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料PIEC（中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫）。胎牛血清（上海依科賽生物制品有限公司）；0.25%-EDTA胰蛋白酶（美國Hyclone生物公司）；1640培養(yǎng)基（武漢普諾賽生物科技有限公司）；兔抗人第Ⅷ因子相關(guān)抗原多克隆抗體、羊抗兔IgG-Cy3抗體（武漢博士德生物科技有限公司）；青霉素和鏈霉素混合液（雙抗）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）；MTT試劑盒、DMSO（長沙維爾生物科技有限公司）；QCT（上海源葉生物科技有限公司）。倒置相差顯微鏡（AE2000，Motic）；熒光顯微鏡（OLYMPUS）；酶聯(lián)檢測儀（ELx800，Bio-Tek）。2.2PIEC鑒定于超凈工作臺配置完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清+1%青-鏈霉素+1640培養(yǎng)基)，將購回的PIEC用0.25%-EDTA胰蛋白酶消化1-2min，終止消化，1000rpm，4℃離心5min，接種于完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞增殖情況及生長狀態(tài)酌情換液、傳代，取第4-7代PIEC用于實(shí)驗(yàn)。將PIEC接種至24孔板，待細(xì)胞生長至達(dá)80%左右時，棄掉原培養(yǎng)基，PBS緩沖液清洗2-3次后，以4%多聚甲醛于室溫條件下固定15-30min，PBS緩沖液再清洗3次，5min/次；在37℃下加入0.1%tritonx-100PBS，膜破裂10分鐘，然后用PBS緩沖液洗滌2次。30%H2O2與純甲醇以1:50的比例混合，在室溫下放置30min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水清洗，每次3min，重復(fù)3次；蛋白酶K進(jìn)行修復(fù)，反應(yīng)40s后，進(jìn)行6min的PBS緩沖液清洗，3min/次；正常山羊血清在37℃下封閉30min左右。加入抗人VIII因子相關(guān)抗原兔多克隆抗體，在4℃孵育過夜；靜置30min，用PBS緩沖液清洗，3min/次，清洗3次；加入羊抗兔IgG-Cy3抗體，避光條件下，37℃孵育40min，PBS緩沖液清洗，5min/次，清洗3次；熒光顯微鏡下觀察并拍照。2.3不同濃度的QCT對PIEC增殖的影響取對數(shù)生長的第6代PIEC，以5×103/孔接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)基體積為100μL。將貼壁細(xì)胞分組：（1）空白對照組：培養(yǎng)基+PIEC；（2）模型組：H2O2（150μM）+PIEC（3）試驗(yàn)組：不同濃度PIEC+QCT（5μM、10μM、20μM）+H2O2（150μM）。每組設(shè)4個復(fù)孔，每孔加入含相應(yīng)QCT濃度的培養(yǎng)液100μL（QCT溶解于DMSO中，CDMSO≤0.1%[18]）預(yù)處理2h，H2O2干預(yù)3h。除去原液后，每孔加入20μLMTT溶液及100μL培養(yǎng)基，在37℃下、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h。吸去所有液體（培養(yǎng)基+MTT），每孔加入150μL甲瓚（Formazan）溶劑，在室溫下面，輕緩搖晃10min，然后充分混勻，在490nm波長處測定細(xì)胞吸光度值（OD）。細(xì)胞相對活力（%）=各組OD/空白組OD×100%2.4統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS21統(tǒng)計(jì)軟件將數(shù)據(jù)與均數(shù)分析進(jìn)行比較，結(jié)果以“均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差(S)”表示。獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)兩組之間,顯著水平α=0.05,p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果與分析3.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)與免疫熒光染色鑒定PIEC在基于CO2的培養(yǎng)箱(37℃，5%CO2)中培養(yǎng)，完全培養(yǎng)，并在約4小時后逐漸粘附到壁上。貼壁細(xì)胞以多邊方式向外呈小三角形增殖，呈長橢圓形或長梭形，邊界清晰，相互間無重復(fù)疊加。18h顯微拍照，細(xì)胞形態(tài)見圖1。48h可以單層平鋪的形式鋪滿培養(yǎng)瓶底，呈鋪路石或鵝卵石狀鑲嵌排列[19-20]。PIEC經(jīng)免疫熒光染色后，明視野下，可見內(nèi)皮細(xì)胞呈三角形發(fā)散生長，形態(tài)正常，可以觀察到細(xì)胞核，接觸抑制也明顯易見[19]。在黑暗的視野中，可以看到明亮的紅色熒光，并且核區(qū)域是最明亮的。熒光顯微鏡下觀察結(jié)果如圖2。經(jīng)鑒定，該細(xì)胞為髖動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞。圖1PIEC形態(tài)（100×）圖2PIEC免疫熒光染色鑒定（200×）Fig.1ThemorphologyofPIECFig.2IdentificationofPIECbyimmunofluorescencestaining3.2不同濃度QCT對PIEC活力的影響圖3不同濃度的QCT對PIEC增殖的影響Fig.3EffectofdifferentconcentrationsofQCTonproliferationofPIEC注：與對照組（0μM）比較，*：P﹤0.05；**：P﹤0.01。以不同濃度的QCT作用24h，結(jié)果顯示，與對照組相比，5、10、20μM的QCT對PIEC無明顯毒性作用（p＞0.05）。5、10、20μM為QCT的安全作用濃度，并以此作為干預(yù)試驗(yàn)的劑量。3.3不同濃度的QCT對H2O2作用的PIEC活力的影響圖4不同濃度的QCT對H2O2作用的PIEC增殖的影響Fig.4EffectofdifferentconcentrationsofQCTonproliferationofPIECinducedbyH2O2注：*：P﹤0.05；＃＃/**：P﹤0.01。由圖4分析得出，與正常組比較，150μM的H2O2作用3h顯著抑制PIEC的增殖（P﹤0.01）。與H2O2模型組比較，QCT預(yù)處理2h后，呈劑量依賴性地顯著促進(jìn)PIEC的增殖，說明QCT可顯著緩解H2O2作用的PIEC增殖抑制。4討論在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，所用的完整培養(yǎng)基在復(fù)蘇、換液和傳代前應(yīng)在37℃水浴中預(yù)熱，以免培養(yǎng)液取出冰箱后溫度過低對細(xì)胞造成一定影響，細(xì)胞數(shù)量的增加將導(dǎo)致細(xì)胞間的接觸抑制，經(jīng)過幾次傳代后，細(xì)胞增殖的速度、狀態(tài)和活力也會提高，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，為了使拍攝的照片更加美觀和立體，從多個角度調(diào)整培養(yǎng)瓶，并計(jì)算白平衡，根據(jù)放大率調(diào)節(jié)相位對比板，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)瓶角落拍攝的細(xì)胞照片是最美麗和立體的。第VIII因子相關(guān)抗原抗體作為一種糖蛋白，廣泛存在于血管內(nèi)皮、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞等，用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定。研究人員在對小鼠、豬和人的[19-21]血管內(nèi)皮細(xì)胞等進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定時，都選擇了第VIII因子作為關(guān)鍵指標(biāo)，從而PIEC的鑒定結(jié)果保證了實(shí)驗(yàn)材料和MTT試驗(yàn)的可靠性。四甲基吡唑藍(lán)(MTT)主要用于檢測細(xì)胞存活率，活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶可將外源性MTT還原為藍(lán)紫色晶體A，并沉積于細(xì)胞內(nèi)，而死細(xì)胞不具有此功能。酶閱讀器可以測量細(xì)胞的吸光度，以反映細(xì)胞的生長情況。用MTT法可以直接檢測細(xì)胞的生長活性，間接反映細(xì)胞的生存狀態(tài)[22]。QCT的濃度用無血清培養(yǎng)基稀釋，稀釋溶液中二甲基亞砜（DMSO）的濃度控制在0.1%以下。初步試驗(yàn)表明，二甲基亞砜（DMSO）濃度過高，明顯抑制細(xì)胞生長。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)QCT單獨(dú)作用于PIEC時，對照組和PIEC組的細(xì)胞活力無顯著差異，表明QCT在5-20存活率范圍內(nèi)對血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖無明顯影響[23]。不同內(nèi)皮細(xì)胞對QCT的敏感性也不同；QCT作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ecv30448h后，可顯著抑制其增殖，呈劑量依賴性作用性；QCT可以促進(jìn)H2O2活化的PIEC的增殖，整體效果呈劑量依賴性，說明QCT可以保護(hù)H2O2活化的PIEC的損傷。QCT是一種天然黃酮類物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌、抗氧化等多種藥理活性。近年來，對QCT的研究越來越多，內(nèi)容也越來越廣泛，如QCT含量測定法[24]、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[25]、抑制與內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的動脈粥樣硬化[26]、抗阿爾茨海默病[27]等。本文初步探討了QCT對PIEC擴(kuò)散的影響,但是對于QCT對H2O2誘導(dǎo)的PIEC效應(yīng)的保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。5結(jié)論如目前的研究相似，5-10um濃度的槲皮素（QCT）對豬髖動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（PIEC）無明顯的毒素作用，槲皮素（QCT）可以顯著緩解H2O2作用的PIEC增殖抑制。

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