1195號(72)發(fā)明人鄭偉韓葉閆春梅萬限公司37201大麻哈魚微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)及多態(tài)性引本發(fā)明公開了大麻哈魚的微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)在微衛(wèi)星位點(diǎn)兩端的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)特異性21.大麻哈魚微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)的序列，其特征在于，該序列為SEQID:1-10。2.如權(quán)利要求1所述微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)序列，其特征在于，該微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)兩端的側(cè)翼序列上設(shè)計(jì)的引物序列為SEQID:11-30。3.權(quán)利要求2所述的引物序列SEQID:11-30的篩選方法，其特征在于，該篩選方法基于全基因組的簡化基因組測序后進(jìn)行多態(tài)性篩選。4.如權(quán)利要求3所述的篩選方法，其特征在于，所述篩選方法具體為：先用酶切法建庫，然后進(jìn)行測序，對讀到的序列進(jìn)行微衛(wèi)星分析，先選出微衛(wèi)星重復(fù)單元比較多的序列，再對比基因組文庫篩選得到了多個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)，并根據(jù)相關(guān)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物并予以合成；再在大麻哈魚多個(gè)個(gè)體中進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，篩選出擴(kuò)增產(chǎn)物正確的引物對，再對產(chǎn)物正確的引物對進(jìn)行篩選，最終從中篩選出10對多態(tài)性良好的微衛(wèi)星引物序列SEQID:11-5.權(quán)利要求1所述的微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)序列SEQID:1-10在大麻哈魚親緣鑒定中的應(yīng)用。6.權(quán)利要求2所述的引物序列SEQID:11-30在大麻哈魚親緣鑒定中的應(yīng)用。7.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用的具體親緣鑒定方法包括以下步驟：2)熒光引物合成：對得到的10對引物序列SEQID:11-30進(jìn)行熒光引物合成；性分析鑒定親緣關(guān)系。3大麻哈魚微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)及多態(tài)性引物和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及大麻哈魚微衛(wèi)星分子標(biāo)記的開發(fā)技術(shù)。背景技術(shù)[0002]大麻哈魚Oncorhynchusketa(Walbaum)隸屬鮭科太平洋鮭屬，具溯河洄游性，即為江里生、海里長又回原產(chǎn)地河流產(chǎn)卵繁殖。大麻哈魚系世界名貴經(jīng)濟(jì)魚類，其卵也是著名麻哈魚也是吉林省長白山地區(qū)圖們江流域著名的冷水性魚類。但是，由于近些年其生存環(huán)境惡化，致使其資源急劇減少，目前已處于瀕危狀態(tài)，亟需大力開展水產(chǎn)種質(zhì)資源保護(hù)工利影響導(dǎo)致水生生物滅絕的事例越來越多，且一經(jīng)滅絕無法修復(fù)，因此保護(hù)大麻哈魚等魚類資源勢在必行，有條件的國家也都采取人工增殖放流措施，并將此作為分配海洋捕撈份額的依據(jù)，而開展大麻哈魚人工增殖放流屬地的追蹤調(diào)查研究是其中最首要的一環(huán)。[0003]即，如何建立微衛(wèi)星分子標(biāo)記方法鑒定親子關(guān)系，有效地追蹤大麻哈魚人工增殖放流屬地是當(dāng)前亟需解決的問題。發(fā)明內(nèi)容[0004]本發(fā)明的目的是提供大麻哈魚微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)以及其多態(tài)性引物，并提供具體的應(yīng)用方法，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。[0005]微衛(wèi)星標(biāo)記(SSRs:simplesequencerepeats)是由2-6bp堿基組成的一個(gè)多次串聯(lián)重復(fù)序列，又稱為短序列重復(fù)(Shorttandemrepeats,STRS),是一種廣泛應(yīng)用在遺傳學(xué)領(lǐng)域的DNA分子標(biāo)記。STRS普遍存在于真核生物的基因組中，平均每10kb就出現(xiàn)一個(gè)STR位點(diǎn)，重復(fù)數(shù)為10-20次，其中動物體中以雙核苷酸(CA/GT)n最為常見提供的遺傳信息多，PCR擴(kuò)增效果重復(fù)性好，以及在基因組中分散分布等優(yōu)點(diǎn)，常用于群體遺傳學(xué)分析、基因圖譜分析及親緣關(guān)系等研究，但是，微衛(wèi)星標(biāo)記研究和應(yīng)用難點(diǎn)在于難以篩選合適的標(biāo)記位點(diǎn)。[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取的具體技術(shù)方案為：[0007]大麻哈魚微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)的序列為SEQID:1-10。[0008]所述微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)序列SEQID:1-10的微衛(wèi)星兩端的側(cè)翼序列上設(shè)計(jì)的引物序列為SEQID:11-30。[0009]所述微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)序列SEQID:1-10及引物序列SEQID:11-30的篩選是基于全基因組的簡化基因組測序后進(jìn)行多態(tài)性篩選。[0010]進(jìn)一步的，所述具體的篩選方法為：先用酶切法建庫，然后進(jìn)行測序，對讀到的序列進(jìn)行微衛(wèi)星分析，先選出微衛(wèi)星重復(fù)單元比較多的序列，再對比基因組文庫篩選得到了50個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)，并根據(jù)相關(guān)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物并予以合成；再在大麻哈魚多個(gè)個(gè)體4中進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，篩選出擴(kuò)增產(chǎn)物正確的引物對，再對產(chǎn)物正確的引物對進(jìn)行篩選，最終從中篩選出10對多態(tài)性良好的微衛(wèi)星引物序列SEQID:11-30,再反向得到相對應(yīng)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)序列SEQID:1-10。[0011]所述微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)，對應(yīng)的位點(diǎn)序列和對應(yīng)的引物信息如表1:[0012]表1[0013]位點(diǎn)微衛(wèi)星序列正向引物序列反向引物序列[0014]所述的微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)序列SEQID:1-10能夠用于大麻哈魚親緣鑒定。[0015]所述的引物序列SEQID:11-30能夠用于大麻哈魚親緣鑒定。[0016]進(jìn)一步的，所述親緣鑒定方法具體包括以下步驟：[0017]1)樣品基因組DNA提??；[0018]2)熒光引物合成：對得到的10對引物進(jìn)行熒光引物合成；[0019]3)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物分析檢測；[0020]4)對上述檢測數(shù)據(jù)分析，計(jì)算等位基因、觀測雜合度、期望雜合度、多態(tài)信息含量，多態(tài)性分析鑒定親緣關(guān)系。[0021]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果：[0022]本發(fā)明從大麻哈魚基因組DNA中篩選出10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，并根據(jù)這些位點(diǎn)在微衛(wèi)星位點(diǎn)兩端的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)特異性引物，使用所獲得引物的擴(kuò)增結(jié)果具有多態(tài)性和穩(wěn)定性，可適用于大麻哈魚親緣關(guān)系鑒定，種群遺傳多樣性檢測，以及分子輔助育種領(lǐng)域。[0023]大麻哈魚微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)及引物的開發(fā)，能夠應(yīng)用于建立大麻哈魚DNA條形編碼，在子二代F2繁殖洄游的年份和季節(jié)，對捕獲的大麻哈魚進(jìn)行遺傳多樣性分析并逐一的親緣關(guān)系認(rèn)定。利用本發(fā)明能夠更加準(zhǔn)確掌握我國內(nèi)陸水域自然江河中放流大麻哈魚的資料，進(jìn)一步調(diào)整保護(hù)措施，同時(shí)在河口捕獲大麻哈魚的放流來源的確定將有利地支持我國海洋捕撈權(quán)利。本發(fā)明為大麻哈魚的親緣關(guān)系的鑒定以及遺傳多樣性提供資料，能夠更加準(zhǔn)確評估大麻哈魚增殖放流效果。[0024]說明書附圖[0025]圖1為實(shí)施例中部分引物擴(kuò)增效果圖一。[0026]圖2為實(shí)施例中部分引物擴(kuò)增效果圖二。5具體實(shí)施方式[0027]實(shí)施例1微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選[0028]本發(fā)明根據(jù)構(gòu)建的大麻哈魚鰭條組織基因組文庫中進(jìn)行的SSR分析，對比基因組文庫篩選得到了50個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)，并根據(jù)相關(guān)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了50對篩選引物序列，在大麻哈魚16個(gè)個(gè)體中進(jìn)行驗(yàn)證。[0029]實(shí)施例2微衛(wèi)星引物的驗(yàn)證[0030]以大麻哈魚基因組為模板，用50對引物序列進(jìn)行溫度梯度PCR以摸索出最佳退火溫度，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增結(jié)果。的條帶的引物對。[0032]實(shí)施例3微衛(wèi)星引物多態(tài)性驗(yàn)證[0033]對實(shí)施例2得到有條帶的引物進(jìn)行熒光引物合成，在其中1條引物的5'加FAM/HEX/系擴(kuò)增，能夠得到非常好的引物擴(kuò)增效果?！?0cycle,(94℃30s,50℃30s,72℃30s)×30cycle,72℃5min.產(chǎn)物用ABI3730DNA測序儀分析。軟件Cervus3.0進(jìn)行遺傳指標(biāo)(等位基因(na:0bservednumberofalleles)、觀測雜合度(Ho:0bservedheterozygosity)、期望雜合度(HE:Expectedheterozygosity)、多態(tài)信息含量(PIC:polymorphisminformationcontent))計(jì)算，最終得到如下表2的。[0035]表2:10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的重復(fù)單位、引物的相關(guān)信息6位點(diǎn)單元引物序列大小7050705070440505500547090775081208600968000PIC為多態(tài)信息含量。[0039]本發(fā)明的10對引物序列對50個(gè)大麻哈魚基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，遺傳多樣性分析結(jié)果表明每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)目從5到14不等，平均等位基因數(shù)為9.2,平均觀望雜合度0.698,平均期望雜合度為0.8046。[0040]實(shí)施例4:親緣鑒定方法[0041]選取327尾大麻哈魚鰭條樣本進(jìn)行基因組DNA提取，用此10對微衛(wèi)星引物進(jìn)行PCR×50cycle,(94℃30s,50℃30s,72℃30s)×30cycle,72℃5min產(chǎn)物上3730x1基因分析儀檢測；8位點(diǎn)單元引物序列大小17646917703340618032751619287701681566[0045]本發(fā)明的10對引物對327個(gè)大麻哈魚基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，遺傳多樣性分析結(jié)果表明：10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)為15.3,平均觀望雜合度0.769,平均期望雜合度為0.798.PIC平均0.774。[0046]上述實(shí)施例說明了本發(fā)明的微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)和相應(yīng)的引物序列能夠用于大麻哈魚遺傳多樣性檢測以及家系和個(gè)體鑒定。[0047]以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實(shí)施例，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權(quán)利要求所限定的范圍內(nèi)。序列表<110>吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院<120>大麻哈魚微衛(wèi)星分子標(biāo)記位點(diǎn)及多態(tài)性引物和應(yīng)用<213>大麻哈魚(Oncorhynchusketa)<213>大麻哈魚(Oncorhynchusketa)aaccaaaagcttgcactttgttttcttgctagttctgacatgctgctgctacagatttgtgtggcctgttgctgttcataatagcccatgtgtgtgttgcgctagcctgctaacctcctcagcacctt230<213>大麻哈魚(Oncorhynchusketa)tcaaacaatggttttgctaattaaaaatagctgatagaatattctacacagtgcctttgcatctctctctc<213>大麻哈魚(Oncorhynchusketa)ttacaaggcttctgcccacctctgtagaccttcctgcccattttccaactttataccctc6011agtagagccctctgcacaccagatttggtttcactactgtgtttgtagaaagcggacgaggcagcgttggcaggcgctagaagcagagcgggagcgt<213>大麻哈魚(Oncorhynchusketa)agggtgtctgttgtgccagtgacagacgagaaaccctctcattccatgtcattccagctagcattagcattagcagcagcagtgca<213>大麻哈魚(Oncorhynchusketa)tctcctctctttccttctatatcctcccctctcttc<213>大麻哈魚(Oncorhynchusketa)atggccattacatgccgtccgagtgtcctcaagggatgtgtgtgtgttgcccatttccctttcagatgagctgttatctcagagagagagagaaggagaggcatcaccccctctaacacacac<213>大麻哈魚(Oncorhynchusketa)gagaaagagagagagatggaggcagtggattcatgaaccgtttccagtttacatagagtccagtgaagttctttcagggccga224<213>大麻哈魚(Oncorhynchusketa)<213>大麻哈魚(Oncorhynchusketa)aacctcccccatgtttcttgaatcttgttttctatgcaatgttgagaatccacataactctgtgtgcgtgtgtttgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgttattttaaaaatgtgcaagggtgccaatacatttggccagaactataaccaagatttttc